Overview
Denne videoen introduserer en metode for å isolere og sterilt kultur embryonal C. elegans celler in vitro.
Protocol
1. Desosiasjon av embryonale celler
- Utfør de neste trinnene i prosedyren under sterile forhold ved hjelp av en laminær strømningshette. Mens dyr er kjole på bakterieplater, bør vaskene og behandlingen med lysisløsningen som inneholder blekemiddel eliminere de fleste om ikke alle bakteriene. Dermed ved hjelp av en laminær hette på dette punktet av prosedyren forhindrer ny forurensning av eggfjæringen.
- Resuspend pelleted egg i 1 ml 2 mg/ ml chitinase (lager i eggbuffer pH 6,5) og overfør dem til et nytt sterilt 15 ml konisk rør. Rock røret i 10-30 min ved romtemperatur. Den nøyaktige inkubasjonstiden endres i henhold til enzymets friskhet og temperaturen i rommet og bør derfor bestemmes for hvert preparat. Det anbefales å begynne å overvåke eggene under et invertert cellekulturmikroskop etter 10 min inkubasjon. Merk: Etter vår erfaring øker lav pH chitinase enzymatisk aktivitet. Av denne grunn bruker vi eggbuffer ved pH 6.5 for å oppløse chitinase (oppskrift rapportert ovenfor, hvor pH justeres til 6,5 ved hjelp av NaOH).
- Når ~ 80% av eggeskallene fordøyes av chitinase-behandlingen (Figur 1 A-B), pellet eggene ved sentrifugering ved 900 x g (~ 2500 rpm) i 3 min. Bruk en P1000 pipettor og sterile spisser, fjern forsiktig supernatanten og tilsett 3 ml L-15 medium.
- Overfør eggene til en plate med en diameter på 6 cm og fjern forsiktig cellene ved hjelp av en 10 ml steril sprøyte utstyrt med en 18 G nål. Overvåk graden av dissosiasjon ved å plassere en dråpe suspensjon i en fersk plast Petri-tallerken og ved å se under mikroskopet. Ikke aspirer luft inn i sprøyten under denne prosedyren for å unngå å skade celler. Fortsett dissosiasjonen til ~ 80% av cellene er dissosiert.
- Filtrer suspensjonen med et sterilt 5 μm Millipore-filter. Celle suspensjoner må filtreres for å fjerne celle klumper, ufordøyde egg og klekkede larver. Filtrer ytterligere 4-5 ml ferske L-15-medier gjennom filteret for å gjenopprette alle cellene. Ikke bruk overdreven kraft under filtreringstrinnet for å unngå å skade filteret og/eller cellene.
2. Culturing celler
- Pellet de dissosierte cellene ved sentrifugering ved 900 x g (~ 2500 rpm) i 3 min. Bruk en P1000 pipettor og sterile spisser forsiktig fjerne alle supernatant. Resuspend pelleted cellene i komplett L-15 medium og plate 1 ml/ brønn. Mengden av mediet som legges til, avhenger av antall 8P-plater som brukes, sammenløpet av ormene på platene og typen eksperimenter som skal utføres på cellene. Celletettheten kan bestemmes ved hjelp av et hemocytometer. For patch-clamp opptak plating tetthet av ~ 230,000 celler / cm2 er optimal.
- Oppbevar de 24 brønnplatene i en Tupperware-beholder i plast som inneholder våte papirhåndklær for å unngå fordampning av kulturmediet. Oppbevar beholderen i en fuktet inkubator ved 20 °C og omgivelsesluft.
- Cellene er vanligvis klare for forsøkene innen 24 timer når den morfologiske differensiering og uttrykk for GFP-markører er fullført. Celler kan holdes i kultur i opptil 2 uker, men de er vanligvis mest sunne opptil 7-9 dager etter plating. Mediet må byttes ut en gang om dagen for å opprettholde sunne celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1. C. elegans embryoer før og etter chitinase behandling. (A) Fotografi av egg før eksponering for chitinase. Pilen peker på det gjennomsiktige og intakte eggeskallet som omgir et embryo. (B) Egg behandlet med chitinase i 10 min. Eggeskallene har blitt fordøyd og er ikke lenger synlige rundt embryoene. Pilene peker på tre ganger embryoer frigjort fra eggeskallet. Den blå boksen omgir en gruppe celler som fremdeles er knyttet til hverandre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333-100ML | |
| Chitinase from Streptomyces Griseus | Sigma | C6137-25UN | |
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| Portable Pipet Aid, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| Transfer Plastic Pipet Sterile | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15 ml Conical Tube | USA Scentific | 1475-1611 | |
| Sterile 18 gauge Needles | Becton, Dickinson and Co. | 305196 | |
| Sterile 10 ml Syringes | Becton, Dickinson and Co. | 305482 | |
| Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15 mm Petri Dish Sterile | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12 mm Diameter Glass Coverslips | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid | Thomas scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 22629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| Inverted Microscope with x10 objective | |||
| Ambient air humidified Incubator |
