Denne protokol er et uddrag fra Tong et al, Microfluidic-baserede Electrotaxis for On-demand kvantitativ analyse af Caenorhabditis elegans' Bevægelse, J. Vis. Exp. (2013).
1. Elektrotaxis eksperiment
- Placer mikrokanalen på scenen (helst XY-bevægelig) af et mikroskop med et monteret kamera tilsluttet en skærm (Figur 1).
- Tilslut strømforsyningens eller forstærkerens udgangsledninger til mikrokanalens elektroder. En simpel DC strømforsyning er tilstrækkelig, hvis kun et DC-signal ønskes, men en forstærker tilsluttet en funktion generator tillader anvendelse af pulserende DC og AC-signaler så godt.
- Fastgør mikrokanalens udgangsrør til en engangssprøjte. Nedsænk mundingen af indløbsrøret i M9 fysiologisk buffer og stræb forsigtigt væske ind i kanalen ved at anvende et undertryk inde i sprøjten (enten manuelt eller ved hjælp af en sprøjtepumpe). Når indløbs- og udløbsrørene begge er fyldt med M9, skal du frakoble sprøjten fra røret. Niveau begge rør i samme højde for at forhindre hydrostatisk drevet flow.
- Påfør en DC-spænding på kanalen, og sørg for, at modstanden (R= V/I) er omkring 0,6 MΩ (i en 50 mm lang, 0,3 mm bred og ~0,1 mm dyb mikrokanal).
- Hvis du er tilfreds med kanalens integritet, skal du følge ovenstående trin for at indlæse orme fra en fortyndet affjedring i kanalen.
- Frakoble sprøjten og hydrostatisk manipulere strømmen ved at justere rørenes relative højde. Brug denne metode til at placere en orm i midten af kanalen og derefter lægge begge rør fladt i samme højde.
- Indstil strømforsyningen til den relevante spænding: 4-12 V/cm for L3-trinsdyr, 4-10 V/cm for L4'ere og 2-4 V/cm for unge voksne. Aktiver det elektriske signal og lad ormen akklimatisere sig til marken i 1 min. Ormen skal begynde at bevæge sig mod katoden. Når minuttet er gået, skal du bruge kameraet til at begynde at optage.
- For AC- og pulserende DC-eksperimenter kan det maksimale responsive elektriske felt vedtages ovenfra, og signalets frekvens- og arbejdscyklus kan moduleres efter ønske.
- Når forsøget er afsluttet, fjernes al væske (og orme) fra kanalen, skylles med dH20, og enheden efterlades på en kogeplade ved 125 °C for at tørre.
- Udtræk lokomotoriske data fra optagede videoer manuelt ved hjælp af NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) eller brugerdefineret MATLAB-baseret ormsporingssoftware.
