Denne protokollen er et utdrag fra Tong et al, Mikrofluidisk-basert elektrotaksi for on-demand kvantitativ analyse av Caenorhabditis elegans' Locomotion, J. Vis. Exp. (2013).
1. Elektrotaxis eksperiment
- Plasser mikrokanal på scenen (helst XY-bevegelig) til et mikroskop med et montert kamera koblet til en skjerm (figur 1).
- Koble strømforsyningen eller forsterkerens utgangsledninger til mikrokanalelektrodene. En enkel DC strømforsyning er tilstrekkelig hvis bare et DC-signal er ønsket, men en forsterker koblet til en funksjonsgenerator tillater også bruk av pulserende DC- og AC-signaler.
- Fest mikrokanals utgangsrør til en engangssprøyte. Senk munnen på innløpsrøret i M9 fysiologisk buffer og aspirer væske forsiktig inn i kanalen ved å påføre et negativt trykk inne i sprøyten (enten manuelt eller ved hjelp av en sprøytepumpe). Når både innløps- og utløpsrørene er fylt med M9, kobler du sprøyten fra røret. Jevn begge rørene i samme høyde for å forhindre hydrostatisk drevet strømning.
- Påfør en DC-spenning på kanalen og sørg for at motstanden (R = V / I) er rundt 0,6 MΩ (for en 50 mm lang, 0,3 mm bred og ~ 0,1 mm dyp mikrokanal).
- Hvis du er fornøyd med kanalens integritet, følger du trinnene ovenfor for å laste ormer fra en fortynnet suspensjon inn i kanalen.
- Koble fra sprøyten og manipulere strømmen hydrostatisk ved å justere rørenes relative høyde. Bruk denne metoden til å plassere en orm i midten av kanalen og legg deretter begge rørene flatt i samme høyde.
- Still strømforsyningen på riktig spenning: 4-12 V/cm for L3-scenedyr, 4-10 V/cm for L4 og 2-4 V/cm for unge voksne. Aktiver det elektriske signalet og la 1 min preeksponering for ormen akklimatisere seg til feltet. Ormen skal begynne å bevege seg mot katoden. Når minuttet har gått, bruker du kameraet til å begynne innspillingen.
- For AC- og pulsede DC-eksperimenter kan det maksimale responsive elektriske feltet vedtas ovenfra, og signalets frekvens og driftssyklus kan moduleres etter ønske.
- Når eksperimentet er ferdig, fjern all væske (og ormer) fra kanalen, skyll den med dH2 0,og la enheten stå på en varm plate ved 125 °C for å tørke.
- Trekk ut lokomotoriske data fra innspilte videoer manuelt ved hjelp av NIH ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) eller tilpasset MATLAB-basert ormsporingsprogramvare.
