Epidermal lasersår: Inducera lokaliserade skador för att undersöka reparationsprocesser i C. elegans

Abstract

Källa: Xu, S. och Chisholm, A. D. Metoder för hudsår och analyser för sårsvar i C. elegans. J. Vis. Exp. (2014). 

Denna video introducerar en metod för lasersår, som används för att orsaka mycket exakta skador i mask epidermis.  Provprotokollet är från en studie av sårrespons och reparation.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Xu och Chisholm, Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans,J. Vis. Exp. (2014).

1. Lasersår

OBS: Använd femtosekerkond laser bestrålning (800 nm) för att utföra mer exakt sårning.

1. Förbered agarkuddar på en glasrutschbana med smält 2% agar. Se till att dynorna liknar de agarkuddar som används för levande avbildning av C. elegans.
2. Överför 10 unga vuxna maskar till agarosplattan med maskplockning och tillsätt en 2 μl droppe 12 mM Levamisole-lösning. Täck djuren och vätskan med en täcksnederett. Vänta 1-2 min tills maskarna förlamar.
3. Placera glasglaset på ett snurrande diskkonfokalt mikroskop. Flytta scenen för att hitta maskarna och fokusera på den laterala främre eller bakre syncytial epidermis med ett 100X-mål (NA 1,4-1,46).
4. Ställ in kraften hos femtosekrerad laser på 140 mW (mätt före målet). Använd femtosekreradlasern med en repetitionshastighet på 80 MHz.
   OBS: Två pulser på 200 msec vardera (separerade med 20 msec) är tillräckliga för sår i våra händer.
5. Fokusera på epidermalcellens apatiska yta och såra epidermis. Observera lokala störningar av cytoplasman (bubblande) eller lokal blekning av någon fluorescerande markör som används.
   OBS: Följ lämpliga lasersäkerhetsrutiner när du använder femtosekecondlasern. Linje- eller punktskanningar med hjälp av femtosekroskop, t.ex. i två fotonmikroskop, bör ge tillräcklig kraft för lasersår.
   OBS: Även om vi inte har direkt erfarenhet av att använda andra lasrar, bör sår i princip vara möjligt med konventionella UV-lasrar (som används i C. elegans cell ablations). Alternativt kan du använda en Fluorescens Recovery After Photobleaching (FRAP) modul på snurrande disk confocal för att så epidermis (N. Pujol, personlig kommunikation).