Overview
このビデオでは、レーザー傷の方法を紹介します, これは、ワーム表皮に非常に正確な傷害を引き起こすために使用されます. サンプルプロトコルは、創傷応答と修復の研究からである。
Protocol
このプロトコルは、徐とチザム、皮膚創傷の方法、およびC.エレガンスの創傷応答のためのアッセイ、J.Vis.Expからの抜粋です。(2014).
1. レーザー創傷
注: フェムト秒レーザー照射(800nm)を使用して、より正確な創傷を行います。
- 2%寒天を溶かしてガラススライド上に寒天パッドを準備します。パッドがC.エレガンスのライブイメージングに使用される寒天パッドと同様であることを確認してください。
- 10の若い成虫を虫ピックでアガロースパッドに移し、12 mMレバミソール溶液の2μlドロップを追加します。動物と液体をカバースリップで覆います。ワームが麻痺するまで1-2分待ちます。
- 回転ディスク共焦点顕微鏡にガラススライドを置きます。ステージを移動してワームを見つけ、100Xの目的(NA 1.4-1.46)を持つ横前または後のシンクロ表皮に焦点を当てます。
- フェムト秒レーザーのパワーを140mW(目標の前に測定)に設定します。フェムト秒レーザーは、80 MHzの繰り返し速度で使用します。
注: 200ミリ秒(20ミリ秒で区切られた)の2つのパルスは、私たちの手の中で傷するのに十分です。 - 表皮細胞の有端表面に焦点を当て、表皮を巻く。細胞質の局所破壊(バブリング)、または使用される蛍光マーカーの局所的な漂白を観察してください。
注: フェムト秒レーザーを使用する場合は、適切なレーザー安全手順に従ってください。2つの光子顕微鏡のようなフェムト秒レーザーを用いたラインまたはポイントスキャンは、レーザーの傷に十分なパワーを提供する必要があります。
注: 他のレーザーを使用した直接の経験はありませんが、原則として、従来のUVレーザー (C.エレガンス細胞アブレーションで使用される)を使用して傷を負うことは可能です。必要に応じて、回転ディスク共焦点上の蛍光回復後の蛍光回復(FRAP)モジュールを使用して表皮を巻き付けます(N. Pujol, 個人的なコミュニケーション)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
