表皮レーザー創傷:線虫の修復過程を調べるための局所的な損傷の誘発

Abstract

出典: Xu, S. and Chisholm, A. D. 皮膚創傷の方法とC.エレガンスの創傷反応のアッセイ。J. Vis. Exp.(2014年)。

このビデオでは、線虫の表皮に非常に正確な損傷を引き起こすために使用されるレーザー創傷の方法を紹介しています。サンプルプロトコルは、創傷の反応と修復の研究から得られたものです。

Protocol

このプロトコルは、Xu and Chisholm, Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans, J. Vis. Exp. (2014)からの抜粋です。

1. レーザー傷

注:フェムト秒レーザー照射(800nm)を使用して、より正確な傷害を行います。

1. 溶かした2%寒天を入れたスライドガラス上に寒天パッドを準備します。パッドがC.エレガンスのライブイメージングに使用される寒天パッドと類似していることを確認してください。
2. 若年成虫10匹のワームをワームピックでアガロースパッドに移し、12 mMレバミゾール溶液を2 μl滴下します。動物と液体をカバースリップで覆います。ワームが麻痺するまで1〜2分待ちます。
3. スライドガラスをスピニングディスク共焦点顕微鏡に置きます。ステージを動かして線虫を見つけ、100倍対物レンズ(NA 1.4-1.46)で外側の前部または後部合胞体表皮に焦点を当てます。
4. フェムト秒レーザーの出力を140 mWに設定します(対物レンズの前に測定)。フェムト秒レーザーを80MHzの繰り返し周波数で使用します。
   注:私たちの手を傷つけるには、それぞれ200ミリ秒の2つのパルス(20ミリ秒の間隔)で十分です。
5. 表皮細胞の頂端面に焦点を合わせ、表皮を創傷します。細胞質の局所的な破壊(バブリング)、または使用した蛍光マーカーの局所的な漂白を観察します。
   注:フェムト秒レーザーを使用するときは、適切なレーザー安全手順に従ってください。2つの光子顕微鏡のようなフェムト秒レーザーを使用したラインスキャンまたはポイントスキャンは、レーザー創傷に十分な出力を提供するはずです
   注:他のレーザーを直接使用した経験はありませんが、原則として、従来のUVレーザー(C.エレガンス細胞のアブレーションで使用される)を使用して創傷が可能であるはずです。オプションで、表皮を創傷するために共焦点のスピニングディスクに光退色後の蛍光回復(FRAP)モジュールを使用します(N. Pujol、私信)。