Ferita laser epidermica: indurre danni localizzati per esaminare i processi di riparazione in C. elegans

Overview

Questo video introduce un metodo di wounding laser, che viene utilizzato per causare lesioni molto precise nell'epidermide del verme.  Il protocollo campione proviene da uno studio sulla risposta e la riparazione delle ferite.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Xu e Chisholm, Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).

1. Ferita laser

NOTA: Utilizzare l'irradiazione laser al femtosecondo (800 nm) per eseguire ferite più precise.

1. Preparare tamponi di agar su uno scivolo di vetro con agar fuso al 2%. Assicurarsi che i pad siano simili ai cuscinetti di agar utilizzati per l'imaging dal vivo di C. elegans.
2. Trasferire 10 giovani vermi adulti sul tampone di agarosio con piccone di verme e aggiungere una goccia di 2 μl di soluzione levamisolo da 12 mM. Coprire gli animali e il liquido con un foglietto di copertura. Attendere 1-2 minuti perché i vermi paralizzino.
3. Posizionare lo scivolo di vetro su un microscopio confocale a disco rotante. Spostare lo stadio per trovare i vermi e concentrarsi sull'epidermide sincreziale anteriore o posteriore laterale con un obiettivo 100X (NA 1.4-1.46).
4. Impostare la potenza del laser a femtosecondi su 140 mW (misurata prima dell'obiettivo). Utilizzare il laser femtosecondo ad una velocità di ripetizione di 80 MHz.
   NOTA: Due impulsi da 200 msec ciascuno (separati da 20 msec) sono sufficienti per ferirsi nelle nostre mani.
5. Concentrati sulla superficie apicale della cellula epidermica e ferisce l'epidermide. Osservare l'interruzione locale del citoplasma (gorgogliamento) o lo sbiancamento locale di qualsiasi marcatore fluorescente utilizzato.
   NOTA: Seguire le procedure di sicurezza laser appropriate quando si utilizza il laser a femtosecondi. Le scansioni di linea o punto che utilizzano laser a femtosecondi come quelli in due microscopi fotoni dovrebbero fornire una potenza sufficiente per il mento laser.
   NOTA: Anche se non abbiamo esperienza diretta nell'uso di altri laser, in linea di principio il mento dovrebbe essere possibile utilizzando laser UV convenzionali (come usato nelle ablazioni cellulari C. elegans). Opzionalmente, utilizzare un modulo Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) sul disco rotante confocale per ferire l'epidermide (N. Pujol, comunicazione personale).