Ferita laser epidermica: induzione di danni localizzati per esaminare i processi di riparazione in C. elegans

Abstract

Fonte: Xu, S. e Chisholm, A. D. Metodi per le ferite cutanee e saggi per le risposte alle ferite in C. elegans.J. Vis. Exp.(2014).

Questo video introduce un metodo di ferita laser, che viene utilizzato per causare lesioni molto precise nell'epidermide del verme. Il protocollo di esempio proviene da uno studio sulla risposta e la riparazione delle ferite.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Xu e Chisholm, Metodi per ferire la pelle e saggi per le risposte alle ferite in C. elegans, J. Vis. Exp. (2014).

1. Avvolgimento laser

NOTA: Usa l'irradiazione laser a femtosecondi (800 nm) per eseguire una ferita più precisa.

1. Preparare i tamponi di agar su un vetrino di vetro con agar sciolto al 2%. Assicurarsi che i cuscinetti siano simili ai cuscinetti di agar utilizzati per l'imaging dal vivo di C. elegans.
2. Trasferire 10 giovani vermi adulti sul tampone di agarosio con il vermicompost e aggiungere una goccia da 2 μl di soluzione di Levamisolo da 12 mM. Copri gli animali e il liquido con un vetrino coprioggetto. Attendi 1-2 minuti che i vermi si paralizzino.
3. Posizionare il vetrino su un microscopio confocale a disco rotante. Muovi il palco per trovare i vermi e concentrati sull'epidermide sinciziale laterale, anteriore o posteriore con un obiettivo 100X (NA 1,4-1,46).
4. Impostare la potenza del laser a femtosecondi su 140 mW (misurata prima dell'obiettivo). Utilizzare il laser a femtosecondi a una frequenza di ripetizione di 80 MHz.
   NOTA: Due impulsi di 200 msec ciascuno (separati da 20 msec) sono sufficienti per ferire le nostre mani.
5. Concentrati sulla superficie apicale della cellula epidermica e avvolgi l'epidermide. Osservare l'interruzione locale del citoplasma (gorgogliamento) o lo sbiancamento locale di qualsiasi marcatore fluorescente utilizzato.
   NOTA: Seguire le procedure di sicurezza laser appropriate quando si utilizza il laser a femtosecondi. Le scansioni lineari o a punti che utilizzano laser a femtosecondi, come quelli dei microscopi a due fotoni, dovrebbero fornire una potenza sufficiente per l'avvolgimento laser.
   NOTA: Anche se non abbiamo esperienza diretta nell'uso di altri laser, in linea di principio la ferita dovrebbe essere possibile utilizzando i laser UV convenzionali (come quelli utilizzati nelle ablazioni cellulari di C. elegans). Opzionalmente, utilizzare un modulo FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) su disco rotante confocale per avvolgere l'epidermide (N. Pujol, comunicazione personale).