Summary
يتم فحص الفأر نموذج لتصلب الأنسجة العضلية الجانبية (ALS) سريريا وسلوكيا. كشرط أساسي لتحليل 1 immunohistological المرافق وصفت إعداد الحبل الشوكي بالتفصيل.
Abstract
التصلب الجانبي (ALS) هو اضطراب الاعصاب المميتة مما أدى إلى تدهور تدريجي من العصبونات الحركية. ذروة بداية نحو 60 عاما لهذا المرض متفرقة ونحو 50 سنوات لمرض عائلي. نظرا لمساره التدريجي، 50٪ من المرضى يموتون في غضون 30 شهرا من ظهور الأعراض. من أجل تقييم خيارات العلاج رواية لهذا المرض، وقد ولدت نماذج الماوس الوراثية من المرض على أساس عائلي الإنسان طفرات في الجين الهيئة العامة للسدود، مثل الطفرة (G93A) SOD1. أهم الجوانب التي لا بد من تقييمها في النموذج هي عموما البقاء على قيد الحياة، وبطبيعة الحال السريرية وظيفة الحركة. هنا، علينا أن نبرهن على التقييم السريري، وتبين البدء في عمل اختبارين محرك السلوكية وتوفير أنظمة التسجيل الكمي لجميع المعلمات. لأن في تحليل معمق لنموذج الفأر المرض وعادة ما يتطلب دراسة المناعى من الحبل الشوكي، وعلينا أن نبرهن إعداده بالتفصيل تطبيق فعلrsal استئصال الصفيحه طريقة. وأظهرت النتائج النسيجية نموذجية. فإن التطبيق الشامل لطرق الفحص صورت في دراسات عن نموذج الفأر من المرض تمكن الباحث لاختبار موثوق الخيارات العلاجية في المستقبل والتي يمكن أن تشكل أساسا لتجارب اكلينيكية على البشر في وقت لاحق.
Protocol
وقد تم شراء الحيوانات من مختبر جاكسون (# 002726) 1. وسجل سريريا أنهم وتعرض لاختبار وظيفة الحركة (rotarod الاختبار) وقوة العضلات (شنقا اختبار الأسلاك). وقد تم تنفيذ جميع هذه الاختبارات، وقتل في وقت لاحق من هذه الحيوانات من اجل اعداد الحبل الشوكي وفقا قريبة جدا من المبادئ التوجيهية المحلية لحسن السلوك من التجارب على الحيوانات.
1. السريرية نقاط
ويتم فحص وبصرف النظر عن تقييم للفئران من وزن الجسم لعلامات العجز الحركي بما يلي 4 نقاط سجل النظام 2:
4 نقاط: عادي (أي علامة على ضعف المحرك)
3 نقاط: الهزات أطرافه الخلفية واضحة للعيان عندما علقت من ذيله
2 نقاط: شذوذ مشية موجودة
(1) نقطة: سحب واحد على الأقل أطرافهم هند
0 نقطة: متناظرة والشلل، وعدم القدرة على الحق نفسه أو فقدان 20٪ من وزن الجسم أقصى، وفي هذه الحالة يصرح باستخدامها فورا الحيوانات ويتم إنهاء التجربة
2. اختبارات وظيفة الحركة وقوة العضلات
سلك معلق
ويستخدم هذا الاختبار لتقييم قوة العضلات 3 و 4. جميع الحيوانات إجراء هذا الاختبار واحد على الأقل أو بعد يومين من اختبار rotarod. تغطية 60 سم فوق القش وضعت كل الماوس على غطاء السلك حسب المقاس مع فترات من 0.8 سم، واتجهوا بحذر رأسا على عقب، أسفل. بعد تدريب لثلاث مرات متتالية ما لا يقل عن 180 ق يقاس الكمون في الانخفاض. وتعطى كل فأر تصل إلى ثلاث محاولات الابقاء على الغطاء المقلوب لمدة أقصاها 180 ق، وتسجل أطول فترة.
Rotarod إختبار
ق استخدمت = "jove_content"> وجهاز rotarod (أوغو باسيلي، Comerio، ايطاليا) لقياس التناسق الحركي والتوازن والقدرة على التعلم الحركي 3 و 4. أداء جيد يتطلب درجة عالية من التنسيق الحسية. يجب وضع الجهاز في بيئة هادئة وغير مزعجة، لتجنب المنبهات تتناقض لاختبارها على الحيوانات. وهو يتألف من مغزل بالمحركات الكمبيوتر التي تسيطر عليها بالتناوب والممرات خمسة لمدة خمس الفئران. تم الكشف عن السقوط من الفئران تلقائيا بواسطة الضغط على طبق من البلاستيك في الجزء السفلي. بعد يقاس تدريب لثلاث مرات متتالية ما لا يقل عن 180 ق بسرعة ثابتة من 15 دورة في الدقيقة في الوقت الذي حيوان يمكن أن تبقى على قضيب الدورية. كل حيوان يخضع لثلاث محاكمات، وأطول من دون كمون يتم تسجيل هبوط. يتم اختيار وقت من 180 ق كما قطع الوقت لأن يتم الكشف عن الغالبية العظمى من اختلافات كبيرة في التنسيق الحركي في هذا الإطار الزمني.
3. الحبل الشوكي التحضير
- وقتل الحيوانات عن طريق نفخ CO 2 وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية وperfused فورا transcardially مع حل PBS يعقبه حل بارافورمالدهيد 4٪.
- من أجل إعداد الحبل الشوكي من الفأرة التضحية، يتم وضع الحيوان على جدول تشغيل ويتم إصلاح الأطراف الأربعة على الجانب من أجل فضح الجانب الخلفي من الماوس.
- وغسل قصير مع حل الإيثانول 70٪ ينظف موقع من تشريح ويسطح معطف الشعر.
- ثم يتم شق الجلد مع مشرط حاد في خط الوسط. من أجل تسهيل قطع يتمدد الجلد لكلا الجانبين. إذا يجب أن تكون مستعدة عضلات الساق، كما أن بشرتهم قطعي.
- بعد الانتهاء من شق الجلد، ويتم سحبها جانبا مع زوج من ملاقط لفضح اللفافة الكامنة السطحية من الجسم.
- عضلات الرقبة والرباط القفوي يجب ازالتها وهي كاليفورنياأعد refully. يجب الحرص على عدم شق إلى الحبل الشوكي بعمق وآفة. ويمكن أيضا للعضلات الكتف يمكن إزالتها من أجل فضح أفضل العمود الفقري.
- ثم تتم إزالة عضلات مجاورة للفقرة من العمود الفقري بأكمله.
- من أجل فتح laminectomies العمود الفقري عدة لا بد من القيام بها. ينبغي للمرء أن يبدأ من الجزء العلوي في الجمجمة في موقع مشترك الفهقي القذالي.
- من الأسهل لإزالة التثبيت في الأطراف العلوية 2 وتجهد الرقبة لتكون أكثر قدرة على أداء استئصال الصفيحة الفقرية للفقرات الأولى. يتم سحب هذه بعيدا دون لمس تعرض الحبل الشوكي عنق الرحم.
- تتم إزالة أكثر من فقرات بواسطة transecting 1 الأقواس الفقري في كلا الجانبين مع مقص الزاوية ومن ثم سحب على العمليات ظهري. يجب إزالة أجزاء الجانبي المتبقية من فقرات لتسهيل الإزالة الكاملة في وقت لاحق من الحبل الشوكي.
- معلما التشريحية للالفقري القطنيالحبل ل هو intumescence أن هذا هو ايضا في النخاع الشوكي عنق الرحم.
- بعد ان انتهى لاستئصال الصفيحه من الحبل الشوكي بأكمله، تأكد من أن القطع أيضا عن جذور بطني والافراج عن الحبل الشوكي من الأم الجافية للسحايا.
- ثم يتم قطع الحبل الشوكي العنقي cranially والبدء في إزالة الحبل الشوكي.
- أخيرا تم أيضا قطع الحبل الشوكي في ذيل الفرس، البعيدة تماما أن يكون صدر.
- في النهاية، يتم وضع الحبل الشوكي الى حل (لامتصاص العرق مثلا 4٪) بين عشية وضحاها postfixating ويمكن معالجة أخرى. نحن cryosection عادة الحبل الشوكي كي يكون جاهزا لتحليل immunohistological.
4. ممثل النتائج
أسلوب إعداد الحبل الشوكي يمثل محور هذه المقالة الفيديو. وهو شرط أساسي لباجتزاء الأنسجة في وقت لاحق، وفي نهاية المطاف لتحليل immunohistological من الحبل الشوكيالمقاطع ل الحبل. كمثال على نتيجة نهائية، وهي workup المناعى للمنطقة القرن الأمامي للنخاع الشوكي القطني الماوس لwildtype (بالوزن)، وعلى الهيئة العامة للسدود G93A التحوير (TG) ويظهر الماوس. يمكن التعرف على الخلايا العصبية الحركية مع الأجسام المضادة لمكافحة دردش الابتدائية ووضع العلامات فلوري لاحق مع الأجسام المضادة Cy3 الثانوية. وبالإضافة إلى ذلك، تم إجراء النووية لمكافحة وصمة عار مع دابي (4،6-diamidino-2-phenylindole) (الشكل 1).
الشكل 1. photomicrographs نيون الرؤية وكشف مناعي من العصبونات الحركية المضادة للCHAT الأجسام المضادة (أحمر) ونوى الخلايا لمكافحة وصمة عار بواسطة دابي (الأزرق) في الماوس قطني القرن الأمامي للنخاع الشوكي لwildtype (بالوزن) (على اليسار) و 1 الهيئة العامة للسدود G93A المعدلة وراثيا (TG) (على اليمين) الماوس في سن ال 130 يوما. مقياس شريط: 40 ميكرون.
كما أن تحليل المناعى للالهيئة العامة للسدود والفئران G93A ليس في نطاق أساسي من هذه المادة يرجى الاطلاع على المنشور الأصلي الذي اتسمت هذه الفئران المعدلة وراثيا وتلك الأكثر حداثة التي تدرس المناهج العلاجية للإشارة أخرى 1، 5، 6. وينبغي إذا يجب التمييز بين الآثار العلاجية على مستوى immunohistological محددة بوضوح أن تطبق خوارزميات التقييم الكمي يدعمها البرنامج stereological (انظر على سبيل المثال 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
و(G93A) SOD1 نموذج الفأر الوراثية هو نموذج حيواني قيمة لدراسة مسار مرض فقدان العصبون الحركي تقدمية مماثلة لمرض التصلب الجانبي الإنسان 8. وقد تم تقييم مجموعة متنوعة من نماذج معاملة مختلفة في هذا النموذج، وتمثل الأساس للاختبار في وقت لاحق الإنسان 8-10 الدراسات السريرية. من أجل أن تكون قادرة على الكشف عن اختلافات كبيرة في دراسة العلاج التجريبي في هذه الفئران، فإنه من الأهمية البارزة لتشمل ما لا يقل عن 24 القمامة المتطابقة المتوازن بين الجنسين الفئران من الخلفية الجينية نفسها، واتباع تصميم مزدوجة التعمية 8. مماثلة لدراسات اكلينيكية على البشر، يجب أن يتم اختيار واحد معيار موحد نقطة النهاية. هنا، واحد الأكثر شيوعا هو عدم قدرة الحيوان على الحق نفسه في 30 ثانية بعد وضعه على جانبه. اذا تم التوصل الى هذا المعيار هو التضحية الحيوانية، ويتم تسجيلها وقتها حياة مع مرور الوقت من البقاء على قيد الحياة.
المعالجة:يمكن البدء في دراسات NT دولة سابق للأعراض السريرية (على سبيل المثال في يوم من حياة (DOL) 50 أو حتى على DOL 30) عند الحيوانات لا تظهر حتى الآن أي علامة على ضعف المحرك وسيتم سجل برصيد 4 نقاط في نظامنا التهديف السريرية . وهناك احتمال آخر يتمثل في مقاربة علاج الأعراض التي ينبغي أن تبدأ عند أول أعراض سريرية تظهر والهزات أطرافه الخلفية واضحة عندما يتم تعليق هذا الحيوان من ذيله. ويعرف هذا المرض وبداية كما تم تصنيف هذه المرحلة الأولية مع مرض النتيجة السريرية 3. ضعف كبير في اختبارات وظيفة الحركة وقوة العضلات تحدث في الغالب فقط أكثر من أسبوعين إلى أربعة أسابيع في وقت لاحق. كما في المتوسط من الحيوانات يصل إلى المرحلة الأولى من المرض السريري حول DOL 80، بعض الباحثين بدء علاجهم أعراض لجميع الحيوانات في هذه النقطة مرة في نهج مبسطة. في كل من إعدادات وجوب مراقبة تطور المرض. يجب أن يبدأ هذا في ذلك الوقت من بدء العلاج لpresympمعاملة الحيوانات tomatically (DOL 50 أو DOL 30، على التوالي)، أو في DOL 70 في الحيوانات المعالجة symptomatically. رصد تطور المرض يتضمن تقرير مرتين أسبوعيا من وزن الجسم، وسجل الجهاز العصبي السريري واختبارات وظيفة الحركة وقوة العضلات. إذا كانت الحيوانات تصل إلى درجة السريرية 1 (سحب ما لا يقل عن أحد أطرافه الخلفية) من المستحسن لتنفيذ تقرير يومي من وزن الجسم والرصد السريري لكي لا تفوت السريرية درجة 0 نقطة (شلل متماثل، عدم القدرة على حق نفسه أو خسارة من 20 ٪ من وزن الجسم كحد أقصى) عند الحيوانات يجب أن يتم التخلص على الفور، ويتم إنهاء التجربة. فمن المستحسن أن يسترشد فاحص لأول مرة من قبل الباحث حيوان من ذوي الخبرة الذين يساعد على كشف أيضا علامات سريرية خفية من التقدم. ومن الثابت السريرية 4 نقاط من المباراة بعد نظام آل Weydt 2 آخرون في هذا المجال ويعتبر نظام موثوق به باستخدام معايير التي يمكن التمييز بوضوح. Aوالتمايز أكثر مكرا من الأعراض السريرية تكون أقل وضوحا، وتعتمد إلى حد كبير ممتحن.
من أجل الكشف عن العجز السلوكية مجموعة متنوعة من نماذج الاختبار هو متاح. معظم المؤلفين يفضلون اختبار rotarod أن يقيم قدرة الحيوانات ليتم تشغيله على اسطوانة دوارة 4 و 11. في دراسة لتقييم أهمية الاختبارات السلوكية في نموذج الفأر SOD1 G93A أثبت اختبار rotarod أن تكون حساسة جدا في الكشف عن اختلافات كبيرة بين wildtype والفئران المعدلة وراثيا في وقت مبكر من الأسبوع 16 من العمر في 11. التعديلات الممكنة تشمل تشغيل بسرعة ثابتة أو شوط سرعة متسارعة. في أي حال، فإن الحيوانات يجب أن يتم تدريبهم قبل اختبار صالح الأولى، لأن بعض قد تحتاج إلى مزيد من التدريب أكثر من غيرها في الحصول على مستوى أساسي من التناسق الحركي. ويمثل وجود قيود من قبل الحيوانات لدوافع مختلفة لتنفيذ هذه المهمة. هذا، ومع ذلك، يمكن تعويضها عن طريق اختبارات متكررة لا تقل عن عشرمرات في اليوم الواحد فحص العناصر الأرضية النادرة. اختبار آخر السلوكية الحركية التي هي حساسة للغاية في الكشف عن حالات العجز الحركي في وقت مبكر هو تحليل البصمة 11. ومع ذلك، فإنه أمر شاق جدا لأن الحيوانات يجب أن يكون الدافع لتشغيل أكثر من ممشى بعد أن أقدامهم يغمس في خزان من الطلاء. ويمكن لنوعية البصمة تختلف إلى حد كبير، وتحليل البرمجيات بمساعدة أمر صعب. ولذلك، فإننا نفضل الاختبار rotarod لتقييم التناسق الحركي.
اختبار سلك معلق تقييم قوة العضلات في الأطراف. انه اختبار النفط الخام بدلا من أن أفضل بالكشف عن العجز العضلي في وقت مبكر بعد أسابيع قليلة من بدء المرض 4. ومع ذلك، فمن السهل جدا لأداء ويمكن بناء جهاز اختبار كامل بسهولة. وهناك اختبار أكثر تفصيلا للقوة العضلات هو استخدام محول قوة 12. هنا، يتم مطالبة الماوس للاستيلاء على شريط متصلة محول قوة مع هند له أو لها الصدارةالكفوف. الاختبارات الفنية الأخرى التي لا بد من النظر فيها وقياس المسافة عجلة دوارة أو حتى تقييم المفتوح مجال النشاط (3)، 13. ومع ذلك، في تجربتنا أثبتت مجموعة من rotarod واختبار سلك معلق إلى أن تكون أكثر حساسية، من الناحية العملية بسهولة وكفاءة وقت لتقييم الفئران G93A SOD1. عموما، ينبغي تصميم دراسة ما قبل السريرية في الحيوانات بعناية فائقة، وينبغي أن يتبع المبادئ الأساسية للمحاكمات سريرية الإنسان على النحو المبين في المبادئ التوجيهية للحرم ( www.consort-statement.org ) 14. عندئذ فقط، يمكن أن يبرر استخدام الحيوانات في البحوث قبل السريرية والنتائج التي قد تؤدي في نهاية المطاف إلى الترجمة الناجحة في تطبيق السريرية البشرية.
وينبغي دائما هذه النتائج السريرية والسلوكية يمكن ربطها تحليلا لعلم الأمراض العصبية والعضلية وحدة بما في ذلك الدراجات النارية الحبل الشوكيالخلايا العصبية، ومحور عصبي الوصل العصبي العضلي 14. هنا، وتحليل عالي الجودة من الحبل الشوكي الجهاز العصبي المركزي علم الأمراض هو شرط أساسي لتفسير الآثار في البقاء على قيد الحياة أو تطور المرض. لأن شامل تثبيت الأنسجة أمر بالغ الأهمية، ينبغي أن نضح من الحيوانات مع بارافورمالدهيد 4٪ التي تحتوي على برنامج تلفزيوني، حل تكون موحدة ايضا. وينبغي من أجل أن يكون قادرا على إزالة بعناية الحبل الشوكي يتم تثبيت جدول تشريح مع المجهر عملية ثابتة والأدوات الجراحية الدقيقة يجب أن تكون متوفرة (انظر قائمة الأدوات الجراحية أدناه). بعد تمت إزالة الحبل الشوكي بأكمله، ويمكن معالجتها لأسلوب باجتزاء المناسبة (على سبيل المثال vibratome أو مبضع بردي) ويمكن في النهاية أن تخضع لتحليل immunohistological. هنا، المعلمات التقييم الأساسية هي أرقام العصبونات الحركية في النخاع الشوكي والخلايا الدبقية تنشيط أو التسلل 10، 15. اعتمادا على مسألة البحث الأصلي، م المناعى إضافيةويمكن تقييم arkers مثل الركام الهيئة العامة للسدود أو الجهاز العصبي المركزي سلامة البطانة. وعلاوة على ذلك، يمكن تقييم الطرفية مرض الجهاز العصبي علم الأمراض عن طريق الفحص من بالخلايا العصبية الطرفية والتقاطعات العصبية والعضلية. فقط مجموعة من التحليلات على حد سواء السريرية والمناعية من الجهاز العصبي المركزي والجهاز العصبي المحيطي توفير نظرة شاملة لعلم الأمراض المرض الشامل الذي يجب أن يرتبط مع النتائج السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تلقت منحة LT الدعم من Forschungsförderungsprogramm من الطب جامعة غوتنغن. وقدم الدعم وPL ميغابايت من قبل مركز بحوث DFG للعلم وظائف الأعضاء الجزيئية من الدماغ (CMPB)، غوتنغن. الكتاب أشكر الدكتور لارس Tatenhorst للحصول على المساعدة مع بالفيديو وLiebau بيرجيت للمساعدة في الصوت وتحرير الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rota-Rod for Mice | Ugo Basile | # 47600 | |
| Hanging wire device | Custom Made | ||
| Operation Table Operation lamp Protective gloves | |||
| “Iris” Scissors, angled to side | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Micro forceps | Hammacher, Solingen, Germany | HWC 111-10 | |
| Scalpel “präzisa plus” | Dahlhausen, Köln, Germany | 11.000.00.510, FIG 10 |
References
- Gurney, M. E. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Weydt, P. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
- Miana-Mena, F. J. Optimal methods to characterize the G93A mouse model of ALS. Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord. 6 (1), 55-62 (2005).
- Zhong, Z. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Invest. 119 (11), 3437-3449 (2009).
- Pitzer, C. Granulocyte-colony stimulating factor improves outcome in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131 (Pt. 12), 3335-3347 (2008).
- Gowing, G. Ablation of proliferating microglia does not affect motor neuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis caused by mutant superoxide dismutase. J. Neurosci. 28 (41), 10234-10244 (2008).
- Scott, S. interpretation of studies in the standard murine model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).
- Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
- Corse, A. M. Preclinical testing of neuroprotective neurotrophic factors in a model of chronic motor neuron degeneration. Neurobiol Dis. 6 (5), 335-346 (1999).
- Knippenberg, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behav Brain Res. 213 (1), 82-87 (2010).
- Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Neuromuscular disease models and analysis. Methods Mol. Biol. 602, 347-393 (2010).
- Hayworth, C. R., Gonzalez-Lima, F. Pre-symptomatic detection of chronic motor deficits and genotype prediction in congenic B6.SOD1(G93A) ALS mouse model. Neuroscience. 164 (3), 975-985 (2009).
- Ludolph, A. C. Guidelines for preclinical animal research in ALS/MND: A consensus meeting. Amyotroph Lateral Scler. 11 (1-2), 38-45 (2010).
- Boillee, S. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 5778 (3), 1389-1392 (2006).
