Summary
Модель мыши для боковой амиотрофический склероз (БАС) рассматриваются клинические и поведенческие. В качестве предварительного условия для сопровождающих immunohistological анализ подготовки спинного мозга изображен в деталях.
Abstract
Боковой амиотрофический склероз (БАС) является фатальным нейродегенеративные расстройства в результате прогрессирующей дегенерации мотонейронов. Пик начала около 60 лет спорадических заболеваний и около 50 лет семейной болезни. Благодаря прогрессивной Конечно, 50% пациентов умирают в течение 30 месяцев с момента появления симптомов. Для того чтобы оценить новые методы лечения этого заболевания, генетические модели мышей ALS были получены на основе семейного человека мутации в гене СОД, такие как SOD1 (G93A) мутации. Наиболее важные аспекты, которые должны быть оценены в модели общей выживаемости, клинического течения и двигательные функции. Здесь мы показываем, клинической оценки показывают, проведение двух поведенческих тестов двигатель и дать количественную системы скоринга для всех параметров. Потому что в глубине анализа модели мышей ALS обычно требуется иммуногистохимическое исследование спинного мозга, мы демонстрируем свою подготовку в подробности применения этогоРСАЛ метод ламинэктомия. Примерные результаты гистологического исследования демонстрируют. Комплексное применение методов исследования изображены в исследованиях на мышах БАС позволит исследователю надежно проверить будущих терапевтических вариантов, которые могут служить основой для последующего клинические испытания на человеке.
Protocol
Животные были приобретены в Jackson Laboratory (# 002726) 1. Они забили и клинически испытания на моторной функции (rotarod тест) и мышечной силы (висящие провода теста). Все эти испытания и позже убийства животных для того, чтобы подготовить спинного мозга были выполнены в очень тесном соответствии с местными руководящими принципами для надлежащего проведения экспериментов на животных.
1. Оценка клинических
Помимо оценки для мышей массой тела рассматриваются признаки дефицита двигатель со следующими 4-балльной системе баллов 2:
4 балла: нормальный (не знаком моторной дисфункции)
3 балла: задние конечности толчки становятся очевидными, когда приостановлены за хвост
2 балла: походка нарушения присутствуют
1 балл: перетаскивание по крайней мере одной задней конечности
0 баллов: симметричныйпаралич, неспособность право сам или потеря 20% от максимального веса, в этом случае животные сразу усыпляют и эксперимент заканчивается
2. Испытания моторной функции и мышечная сила
Висячие провода
Этот тест используется для оценки мышечной силы 3, 4. Все животные выполнить этот тест по крайней мере один или два дня после того, как тест rotarod. Каждая мышь находится на заказ провод крышки с интервалом в 0,8 см и осторожно перевернулся, 60 см покрыты соломой дно. После тренировки три раза подряд, по крайней мере 180 с задержкой падать измеряется. Каждая мышь дается до трех попыток провести на перевернутую крышку на срок до 180 сек и дольше сохраняются.
Rotarod испытаний
3, 4. Хорошая производительность требует высокой степени координации сенсомоторных. Машина должна быть помещена в спокойной и не тревожные окружающей среды, чтобы избежать отвлекающего стимулов для испытуемого животного. Он состоит из управляемых компьютером с приводом от двигателя вращающихся шпинделей и пять полос движения в течение пяти мышей. Водопад мышей обнаруживаются автоматически давление на пластиковую пластину на дне. После тренировки три раза подряд, по крайней мере 180 с постоянной скоростью 15 оборотов в минуту времени, на которое животное может оставаться на вращающийся стержень измеряется. Каждое животное проходит три испытания и самая длинная задержка, не впадая записывается. Время 180 с выбрано время отключения, потому что большинство существенные различия в координации движений обнаружены в этот период времени.
3. Спинной Подготовка кабеля
- Животные погибают от CO 2 вдувания в соответствии с местными руководящими принципами и сразу перфузии transcardially с PBS решение следуют 4% параформальдегид решение.
- Для того, чтобы подготовить спинного мозга мыши жертву животное помещается на операционный стол и четыре конечности крепятся на стороне для того, чтобы подвергать обратной стороне мыши.
- Короткая стирка с 70% раствором этанола очищает место рассечения и выравнивает шерсть.
- Тогда кожи вырезается острым скальпелем в средней линии. В целях облегчения резки кожа растягивается в обе стороны. Если мышцы ног должны быть подготовлены, их кожа также должны быть врезаны.
- После рассечения кожи завершен, он отодвинул с пинцетом, чтобы выставить основной поверхностной фасции тела.
- Мускулатура шеи и затылочной связки должны быть удалены и околоrefully подготовлены. Будьте осторожны, чтобы не надрезать глубоко и повреждение спинного мозга. Плечевые мышцы могут быть удалены для того, чтобы лучше выявить позвоночника.
- Тогда паравертебральные мышцы отделяются от всего позвоночного столба.
- Для того чтобы открыть позвоночника несколько laminectomies должны быть выполнены. Надо начинать с верхней части черепной на месте атланто-затылочного сустава.
- Легче всего снять фиксацию двух верхних конечностей и затягивать на шее, чтобы иметь больше возможностей для выполнения ламинэктомии первого позвонка. Они отстранилась, не прикасаясь к воздействию шейного отдела спинного мозга.
- Более позвонки удаляются по первому, пересекающих позвоночной арки с обеих сторон с угловыми ножницами, а затем тянет на спине процессов. Оставшиеся боковые части позвонков должны быть удалены, чтобы облегчить позже полного удаления спинного мозга.
- Анатомический ориентир поясничного расщеплениел шнур припухлость, который также присутствует в шейном отделе спинного мозга.
- После окончания ламинэктомия всего спинного мозга, убедитесь, что вы также секут все вентральных корешков и освободить спинной мозг из мозговой оболочки мозговых оболочек.
- Тогда шейного отдела спинного мозга режется краниально и вы начнете удалять спинной мозг.
- Наконец, спинной мозг также сократить на дистальном конского хвоста, чтобы быть полностью освобожден.
- В конечном счете, спинной мозг помещают в postfixating решения (например, 4% параформальдегид) в течение ночи и могут быть в дальнейшем обработаны. Мы обычно cryosection спинного мозга, чтобы подготовить его для immunohistological анализа.
4. Представитель Результаты
Методика подготовки спинной шнур представляет основное внимание в этом видео статьи. Это является необходимым условием для последующего срезов тканей и в конечном итоге immunohistological анализа расщеплениеразделы л мозга. В качестве примера конечный результат, иммуногистохимическое обследование в передней части рога мыши поясничного спинного мозга дикого типа (WT) и СОД G93A трансгена (ТГ) мыши продемонстрировали. Моторные нейроны могут быть идентифицированы с главным анти-ЧАТ антител и последующее флуоресцентные маркировки со средним Cy3 антител. Кроме того, ответного ядерного пятно DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндола) была выполнена (рис. 1).
Рисунок 1. Флуоресцентные микрофотографии визуализации иммунодетекции мотонейронов с анти-ЧАТ антител (красный) и клеточных ядер по борьбе с пятном на DAPI (синий) у мышей поясничного спинного мозга передних рогов дикого типа (WT) (слева) и SOD трансгенных G93A (ТГ) (справа) мыши в возрасте 130 дней. Шкала бар: 40 мкм.
Как иммуногистохимического анализаSOD G93A мышей не является основной рамки данной статьи можно найти в оригинальной публикации, в которых эти трансгенных мышей были характерны и более поздние, которые изучают терапевтических подходов для дальнейшего использования 1, 5, 6. Если терапевтический эффект должен быть дифференцированы по уровню immunohistological четко определены количественные алгоритмы оценки должны быть применены при поддержке стереологического программное обеспечение (см., например, 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SOD1 (G93A) генетические модели мышей является ценным животной модели для изучения течения заболевания от прогрессирующей потерей мотонейронов сравнима с человеческой боковым амиотрофическим склерозом 8. Различных парадигм лечения были оценены в этой модели и представляют собой основу для последующего тестирования в человеческой клинических исследований 8-10. Для того, чтобы быть в состоянии обнаружить существенные различия в экспериментальном исследовании лечения у этих мышей, оно имеет огромное значение для включения по меньшей мере 24 помет соответствием гендерного баланса мышей тот же генетический фон и следуйте двойного слепого дизайна 8. Сопоставимые с человека клинических исследований, один единый критерий конечной точки должны быть выбраны. Здесь наиболее часто используемые из них является неспособность животное само право в течение 30 секунд после размещения на его стороне. Если этот критерий не будет достигнуто животное приносится в жертву и ее срок службы учитывается как время выживания.
БизнеNT исследования могут быть запущены на пресимптоматической клинического состояния (например, в день жизни (DOL) 50 или даже на DOL 30), когда животные еще не проявляют никаких признаков дисфункции и двигатель будет забил с 4 очками в нашей клинической балльной системе . Другая возможность состоит в том, симптоматическое лечение подход, который должен начинаться при первых клинических симптомов появляется и задних конечностей толчки становятся очевидными, когда животное подвешивается за хвост. Это определяется как начало заболевания, и это начальная стадия заболевания оценивается с клиническими 3 балла. Значительные нарушения в испытаниях двигательных функций и мышечной силы в основном происходят только более чем через два-четыре недели позже. В среднем животные достигают первой клинической стадии заболевания около DOL 80, некоторые исследователи начать симптоматическое лечение для всех видов животных в этот момент времени в упрощенном подходе. В обоих параметров является обязательным для контроля прогрессирования заболевания. Это должна быть запущена в момент начала лечения для presympавтоматическому подопытных животных (DOL 50 DOL 30, соответственно) или DOL 70 симптоматическое лечение животных. Контроль прогрессирования заболевания включает в себя два раза в неделю определение массы тела, клинические неврологические счета и испытания двигательной функции и мышечной силы. Если животные достигают клинической оценки 1 (перетаскивание по крайней мере одной задней конечности), мы рекомендуем выполнять повседневные определения массы тела и клинического мониторинга, чтобы не пропустить клинической оценки точке 0 (симметричный паралич, неспособность право сам или потеря 20 % от максимальной массы тела), когда животные должны быть немедленно подвергнуты эвтаназии и эксперимент прекращен. Рекомендуется, чтобы в первый раз экспертом в своей деятельности руководствуется опытный исследователь животного, которое помогает обнаружить и тонкий клинических признаков прогрессии. Клинические 4 точки-балльной системе после Weydt и др. 2 хорошо зарекомендовали себя в области и надежная система с использованием критериев, которые могут быть четко дифференцированы.более тонкие дифференциации клинических симптомов может быть менее ясно и сильно зависимым эксперт.
С целью выявления нарушений поведения различных тестов парадигмы имеется. Большинство авторов пользу rotarod тест, который оценивает способность животного для запуска на вращающийся цилиндр 4, 11. В ходе исследования, оценки значимости поведенческих тестов в мышиной модели SOD1 G93A тест rotarod оказались очень чувствительны в обнаружении существенных различий между дикого типа и трансгенных мышей, в начале недели с 16 лет на 11. Возможные изменения включают работает с постоянной скоростью или ускорением скорости бега. В любом случае, животные должны быть обучены до первого тестирования, так как некоторые, возможно, потребуется дополнительное обучение, чем другие, чтобы получить базовый уровень координации движений. Ограничение представлено по-разному мотивированные животных для выполнения этой задачи. Это, однако, могут быть компенсированы повторным испытаниям по крайней мере, яРЗЭ раза в день рассмотрения. Другой тест моторный поведенческих которые очень чувствительны в выявлении ранних дефицита двигателя след анализ 11. Тем не менее, это достаточно трудоемкий, потому что животные должны быть мотивированы, чтобы работать над проходом после того, как их ноги погружают в резервуар с краской. Качество отпечатка может варьироваться в значительной степени и программное обеспечение автоматизированного анализа трудно. Поэтому мы предпочитаем rotarod тест для оценки координации движений.
Висящие провода тест оценивается мышечная сила в конечностях. Это довольно грубый тест, который определяет лучших ранних мышечных дефицита через несколько недель после начала заболевания 4. Тем не менее, это очень легко выполнить, и весь аппарат тестирования могут быть легко построены. Более сложный тест на силу мышц заключается в использовании датчик силы 12. Здесь, мышь предлагается захватить бар подключен к датчик силы либо задние или передниелапы. Другие функциональные тесты, которые должны быть рассмотрены, включают измерение расстояния ходового колеса или даже оценки открытом поле деятельности 3, 13. Однако, по нашему опыту сочетания rotarod и висят провода тест оказался наиболее чувствительным, легко осуществимо и эффективное время для оценки SOD1 мышей G93A. В целом, доклинические исследования на животных должны быть разработаны очень тщательно и должны следовать основным принципам клинические испытания на человеке, как описано в CONSORT принципов ( www.consort-statement.org ) 14. Только в этом случае, использование животных для проведения доклинических исследований может быть оправдано, и результаты могут в конечном итоге приведет к успешному переводу в человека клинического применения.
Эти клинические и поведенческие данные должны всегда быть соотнесены с анализом патологии нервно-мышечной единицы в том числе спинного мозга мотонейрона, аксон и нервно-мышечном соединении 14. Здесь качественный анализ ЦНС спинного мозга патологии является необходимым условием для интерпретации эффектов в выживание или развитие болезни. Поскольку тщательное фиксации тканей является критическим, перфузии животных с 4% параформальдегид содержащей PBS-решения должны быть стандартизированы хорошо. Для того, чтобы иметь возможность тщательно удалить спинной мозг рассечение стол должен быть установлен вместе с фиксированным микроскоп эксплуатации и прекрасно хирургические инструменты должны быть доступны (см. список ниже хирургические инструменты). После всего спинного мозга была удалена, она может быть обработана в соответствующий метод срезов (например, vibratome или замораживающий микротом) и, наконец, может быть подвергнут immunohistological анализа. Здесь основными параметрами оценки являются числа мотонейронов спинного мозга и активированы или проникновения глиальных клеток 10, 15. В зависимости от первоначального вопроса исследования, дополнительные иммуногистохимического мarkers как СОД агрегаты ЦНС или эндотелия целостность может быть оценена. Кроме того, периферической нервной системы, заболевания патология может быть оценена путем исследования периферических аксонов нервных и нервно-мышечных контактов. Лишь сочетание клинических и иммуногистохимических анализов ЦНС и ПНС обеспечивает полное представление общей патологии ALS, которая должна быть связана с клиническими проявлениями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
LT получил грантовую поддержку от Forschungsförderungsprogramm Университета медицины Геттинген. PL и MB были поддержаны DFG научно-исследовательского центра молекулярной физиологии мозга (CMPB), Геттингене. Авторы благодарят доктора Ларса Tatenhorst для помощи видеосъемки и Биргит Либау за помощью аудио и видео редактирования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rota-Rod for Mice | Ugo Basile | # 47600 | |
| Hanging wire device | Custom Made | ||
| Operation Table Operation lamp Protective gloves | |||
| “Iris” Scissors, angled to side | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Micro forceps | Hammacher, Solingen, Germany | HWC 111-10 | |
| Scalpel “präzisa plus” | Dahlhausen, Köln, Germany | 11.000.00.510, FIG 10 |
References
- Gurney, M. E. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Weydt, P. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
- Miana-Mena, F. J. Optimal methods to characterize the G93A mouse model of ALS. Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord. 6 (1), 55-62 (2005).
- Zhong, Z. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Invest. 119 (11), 3437-3449 (2009).
- Pitzer, C. Granulocyte-colony stimulating factor improves outcome in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131 (Pt. 12), 3335-3347 (2008).
- Gowing, G. Ablation of proliferating microglia does not affect motor neuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis caused by mutant superoxide dismutase. J. Neurosci. 28 (41), 10234-10244 (2008).
- Scott, S. interpretation of studies in the standard murine model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).
- Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
- Corse, A. M. Preclinical testing of neuroprotective neurotrophic factors in a model of chronic motor neuron degeneration. Neurobiol Dis. 6 (5), 335-346 (1999).
- Knippenberg, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behav Brain Res. 213 (1), 82-87 (2010).
- Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Neuromuscular disease models and analysis. Methods Mol. Biol. 602, 347-393 (2010).
- Hayworth, C. R., Gonzalez-Lima, F. Pre-symptomatic detection of chronic motor deficits and genotype prediction in congenic B6.SOD1(G93A) ALS mouse model. Neuroscience. 164 (3), 975-985 (2009).
- Ludolph, A. C. Guidelines for preclinical animal research in ALS/MND: A consensus meeting. Amyotroph Lateral Scler. 11 (1-2), 38-45 (2010).
- Boillee, S. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 5778 (3), 1389-1392 (2006).
