Summary
Ein Mausmodell für amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist klinisch geprüft und auf der Verhaltensebene. Als Voraussetzung für eine Begleitperson immunhistologische Analyse der Zubereitung des Rückenmarks wird im Detail dargestellt.
Abstract
Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine tödlich verlaufende neurodegenerative Erkrankung, die sich in progressive Degeneration der Motoneuronen. Peak-Erkrankungsalter liegt rund 60 Jahre für die sporadische Krankheit und rund 50 Jahre für die Erbkrankheit. Aufgrund seiner fortschreitenden Verlauf, sterben 50% der Patienten innerhalb von 30 Monaten nach Einsetzen der Symptome. Um neue Behandlungsmöglichkeiten für diese Krankheit zu bewerten, wurden genetische Mausmodelle der ALS basierend auf menschlichen familiäre Mutationen im SOD-Gens, wie die SOD1 (G93A) eine Mutation erzeugt. Die wichtigsten Aspekte, die im Modell ausgewertet werden müssen, sind das Gesamtüberleben, die klinische Verlauf und die Motorik. Hier haben wir die klinische Bewertung zu demonstrieren, zeigen die Leitung von zwei Verhaltens-motorischen Tests und liefern quantitative Scoring-Systeme für alle Parameter. Da eine eingehende Analyse des ALS-Maus-Modell erfordert in der Regel eine immunhistochemische Untersuchung des Rückenmarks zeigen wir, ihre Vorbereitung im Detail tun, die Anwendung derRsaI Laminektomie Methode. Beispielhafte histologischen Befunde werden demonstriert. Die umfassende Anwendung der dargestellten Untersuchungsmethoden in Studien am Mausmodell der ALS wird es dem Forscher, um zuverlässig zu testen zukünftige therapeutische Optionen, die eine Grundlage für spätere klinische Studien am Menschen liefern kann.
Protocol
Die Tiere wurden vom Jackson Laboratory (# 002726) 1 gekauft. Sie sind klinisch erzielte und einer Prüfung der motorischen Funktion (Rotarod Test) und der Muskelkraft (hängende Draht-Test). Alle diese Tests und die spätere Tötung der Tiere, um das Rückenmark vorbereitet haben in sehr enger Übereinstimmung mit den örtlichen Richtlinien für die ordnungsgemäße Durchführung von Tierversuchen durchgeführt worden.
1. Clinical Score
Neben der Beurteilung des Körpergewichts Mäuse auf Anzeichen von motorischen Defizit mit dem folgenden 4-Punkt-Scoring-System 2 untersucht:
4 Punkte: normal (keine Anzeichen für motorische Störungen)
3 Punkte: Hinterbein Zittern sind offensichtlich, wenn am Schwanz aufgehängt
2 Punkte: Gangstörungen vorhanden sind
1 Punkt: Ziehen von mindestens einem Hinterbein
0 Punkte: symmetrischLähmung, die Unfähigkeit, sich nach rechts oder Verlust von 20% der maximalen Körpergewicht, in diesem Fall werden die Tiere getötet und sofort das Experiment beendet
2. Tests der motorischen Funktion und Muskelkraft
Draht hängen
Dieser Test wird verwendet, um die Muskelkraft 3, 4 zu bewerten. Alle Tiere diesen Test mindestens ein oder zwei Tage nach dem Rotarod-Test. Jede Maus auf einem maßgeschneiderten Drahtdeckel mit Abständen von 0,8 cm gelegt und vorsichtig auf den Kopf gestellt, abgedeckt 60 cm über einem Strohhalm unten. Nach der Ausbildung in drei aufeinander folgenden Mal von mindestens 180 s die Latenz zu fallen, wird gemessen. Jede Maus wird bis zu drei Versuche zu halten, um den Deckel umgekehrt für maximal 180 s und die längste Periode aufgezeichnet wird.
Rotarod-Test
3, 4 zu messen. Eine gute Leistung erfordert ein hohes Maß an sensomotorische Koordination. Die Maschine sollte in einem ruhigen und nicht störende Umwelt auf ablenkende Reize für das Tier zu vermeiden getestet platziert werden. Es besteht aus einer computergesteuerten motorisch drehbaren Spindel und fünf Spuren für fünf Mäusen. Fälle der Mäuse werden automatisch durch Druck auf eine Kunststoffplatte am Boden erkannt wird. Nach der Ausbildung in drei aufeinander folgenden Mal von mindestens 180 s bei einer konstanten Geschwindigkeit von 15 UpM die Zeit, für die ein Tier auf der Drehstange bleiben kann gemessen wird. Jedes Tier durchläuft drei Versuche und die längste Wartezeit, ohne zu fallen wird aufgezeichnet. Die Zeit von 180 s wird als Cut-Off-Zeit gewählt, weil die Mehrheit der signifikanten Unterschiede in der motorischen Koordination in diesem Zeitrahmen erkannt werden.
3. Spinal Cord Vorbereitung
- Die Tiere werden durch CO 2-Insufflation in Übereinstimmung mit den lokalen Richtlinien getötet und werden sofort transkardial mit PBS-Lösung mit einem 4% Paraformaldehyd-Lösung, gefolgt perfundiert.
- Um das Rückenmark der Maus geopfert herzustellen, wird das Tier auf einem Operationstisch angeordnet und die vier Glieder auf der Seite befestigt ist, um die Rückseite der Maus freizulegen.
- Ein kurzer Waschgang mit einer 70% igen Ethanol-Lösung reinigt die Stelle der Dissektion und flacht das Fell.
- Dann wird die Haut mit einem scharfen Skalpell in der Mittellinie eingeschnitten. Zur Erleichterung Schneiden der Haut auf beiden Seiten gestreckt wird. Falls Beinmuskeln müssen vorbereitet werden, hat sich ihre Haut auch eingeschnitten werden.
- Nach dem Hautschnitt abgeschlossen ist, wird es zur Seite mit einer Pinzette, um die zugrunde liegende oberflächliche Faszie des Körpers aussetzen gezogen.
- Die Muskulatur des Halses und des Lig. nuchae müssen entfernt werden und sind ca.refully vorbereitet. Achten Sie darauf, um tief und Läsion des Rückenmarks einzuschneiden. Die Schultermuskulatur kann auch entfernt werden, um besser entlarven die Wirbelsäule werden.
- Dann werden die paravertebralen Muskeln werden aus der gesamten Wirbelsäule entfernt.
- Zum Öffnen der Wirbelsäule mehrere Laminektomien müssen durchgeführt werden. Man sollte aus dem oberen Teil Schädelknochen an der Stelle der Gelenkverbindung Atlas-Hinterhauptbein starten.
- Am einfachsten ist es, die Fixierung der oberen zwei Gliedmaßen zu entfernen und überfordern den Hals, um besser in der Lage, um die Laminektomie des ersten Wirbel durchzuführen. Diese werden entfernt, ohne den freiliegenden zervikalen Rückenmarks gezogen.
- Mehr Wirbeln durch erste Durchschneiden der Wirbelbögen an beiden Seiten mit abgewinkelten Scheren und dann Ziehen an den Dornfortsätzen entfernt. Verbleibende seitlichen Teile der Wirbel zu entfernen, um später eine vollständige Entfernung des Rückenmarks zu erleichtern.
- Einen anatomischen Stützpunkt der Lenden-spinal Kabel ist die Anschwellung, die auch in der zervikalen Rückenmarks.
- Nach Abschluss der Laminektomie des gesamten Rückenmarks, stellen Sie sicher, dass Sie auch durchschneiden alle ventralen Wurzeln und lassen das Rückenmark von der Dura mater der Hirnhäute.
- Dann wird der zervikalen Rückenmarks nach kranial und schneiden Sie beginnen, um das Rückenmark zu entfernen.
- Schließlich das Rückenmark auch am distalen Cauda-equina geschnitten, um vollständig freigegeben.
- Letztlich wird das Rückenmark in einen postfixating Lösung (z. B. 4% Paraformaldehyd) über Nacht gelegt und kann weiter verarbeitet werden. Wir in der Regel Gefrier das Rückenmark, um es für immunhistologische Analyse vorzubereiten.
4. Repräsentative Ergebnisse
Die Technik des Rückenmarks Vorbereitung stellt den Schwerpunkt dieses Video Artikel. Es ist eine wesentliche Voraussetzung für den späteren Gewebe-Schnitte und letztlich für immunhistologische Analyse der Spinal Kabel Abschnitten. Als Beispiel für ein Endergebnis, eine immunhistochemische Aufarbeitung des Vorderhorn Bereich des Maus Lendenrückenmark einer Wildtyp (wt) und einer SOD G93A Transgen (tg) der Maus nachgewiesen wird. Motorneuronen mit einem primären Anti-ChAT-Antikörper und nachfolgender fluoreszierende Kennzeichnung mit einem sekundären Cy3-Antikörper identifiziert werden. Darüber hinaus hat eine nukleare Gegenfärbung mit DAPI (4,6-Diamino-2-phenylindol) durchgeführt (Abb. 1).
Abbildung 1. Fluorescent Mikrofotografien Visualisierung der Immundetektion von Motoneuronen mit Anti-ChAT-Antikörper (rot) und Zellkernen Gegenfärbung mit DAPI (blau) in der Maus Lendenrückenmark Vorderhorn eines Wildtyp (wt) (links) und der ein SOD G93A transgenen (tg) (rechts) Maus im Alter von 130 Tagen. Maßstab: 40 um.
Wie die immunhistochemische Analysedie SOD G93A Mäusen ist nicht das primäre Anwendungsbereich dieses Artikels entnehmen Sie bitte der Original-Publikation, in denen diese transgenen Mäuse charakterisiert worden sind und neuere therapeutische Ansätze, die studieren für weitere Referenz 1, 5, 6. Wenn therapeutische Wirkungen auf den immunhistologischen Ebene klar definiert sind differenziert werden quantitative Auswertung Algorithmen sollte von einem stereologische Software (siehe zum Beispiel 7) aufgebracht unterstützt werden.
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Discussion
Die SOD1 (G93A) genetisches Mausmodell ist ein wertvolles Tiermodell, um den Krankheitsverlauf der progressiven Motoneuron Verlust vergleichbar mit menschlichen amyotrophe Lateralsklerose 8 zu studieren. Eine Vielzahl von unterschiedlichen Behandlung Paradigmen in diesem Modell geprüft, und eine Grundlage für die spätere Prüfung in klinischen Studien am Menschen 8-10. Um der Lage sein, erhebliche Unterschiede in einer experimentellen Studie zur Therapie bei diesen Mäusen erkennen, ist es von eminenter Bedeutung, um mindestens 24 Wurf abgestimmt ausgewogenes Geschlechterverhältnis Mäusen des gleichen genetischen Hintergrund schließen und folgen einer doppel-blinden Design 8. Vergleichbar mit humanen klinischen Studien sollte eine einzige einheitliche Endpoint-Kriterium gewählt werden. Hier ist die am häufigsten verwendete die Unfähigkeit des Tieres nach rechts sich in 30 Sekunden, nachdem sie auf die Seite gelegt. Wenn dieses Kriterium erreicht das Tier geopfert und ihre Lebensdauer wird als Zeit des Überlebens aufgezeichnet.
TreatmeNT-Studien können zu einem präsymptomatischen klinischen Zustand gestartet werden (zB am Tag des Lebens (DOL) 50 oder sogar auf DOL 30), wenn die Tiere noch nicht zeigen kann irgendein Zeichen von motorischen Dysfunktion und würde mit 4 Punkten in unserer klinischen Scoring-System gewertet . Eine andere Möglichkeit besteht in einer symptomatischen Behandlung Ansatz, der beginnt, wenn der erste klinische Symptom erscheint und hinteren Gliedmaßen Zittern liegen auf der Hand, wenn das Tier am Schwanz aufgehängt sollte. Dies wird als Beginn der Erkrankung definiert, und diese erste Stadium der Erkrankung ist mit dem klinischen Score 3 benotet. Erhebliche Beeinträchtigungen in den Tests der motorischen Funktion und der Muskelkraft meist nur mehr als zwei bis vier Wochen später auftreten. Als die Tiere im Durchschnitt der ersten klinischen Stadium der Erkrankung zu erreichen um DOL 80, beginnen einige Forscher ihre symptomatische Behandlung für alle Tiere zu diesem Zeitpunkt in einem vereinfachten Ansatz. In beiden Einstellungen ist es obligatorisch, um den Krankheitsverlauf zu überwachen. Dies sollte zu dem Zeitpunkt nach Beginn der Behandlung für presymp gestartet werdentisch behandelten Tieren (DOL 50 oder DOL 30, jeweils) oder bei DOL 70 für symptomatisch behandelt Tiere. Überwachung des Fortschreitens der Erkrankung umfasst eine zweimal wöchentlich Bestimmung des Körpergewichts, der klinischen neurologischen Scoring und Tests der motorischen Funktion und Muskelkraft. Wenn die Tiere klinische Score 1 (Ziehen von mindestens einem Hinterbein) zu erreichen, empfehlen wir die tägliche Bestimmung des Körpergewichts und eine klinische Überwachung durchzuführen, um nicht den klinischen Score 0 Punkt (symmetrische Lähmung, die Unfähigkeit, sich selbst Recht oder Verlust von 20 verpassen % der maximalen Körpergewicht), wenn die Tiere sofort eingeschläfert werden und das Experiment beendet haben. Es wird empfohlen, zum ersten Mal von einem erfahrenen Untersucher Tier Forscher, der auch erkennen feine klinischen Anzeichen einer Progression hilft geführt wird. Die klinische 4-Punkt-Scoring-System nach Weydt et al 2 wird auch auf dem Gebiet gegründet und ist ein zuverlässiges System mit Hilfe von Kriterien, die eindeutig unterscheidbar sind. Einfeinere Differenzierung der klinischen Symptome wäre weniger eindeutig und hoch Untersucher abhängig.
Um Verhaltensdefiziten erkennt eine Vielzahl von Test-Paradigmen zur Verfügung steht. Die Autoren wird die Rotarod-Test, die die Fähigkeit des Tieres auf einen rotierenden Zylinder 4, 11 ausgeführt ergibt. In einer Studie zur Bedeutung von Verhaltenstests in der SOD1 G93A Mausmodell der Rotarod Test erwies sich als sehr empfindlich bei der Aufdeckung von signifikanten Unterschiede zwischen Wildtyp und transgenen Mäusen bereits ab der 16. Woche im Alter von über 11. Mögliche Modifikationen umfassen ausgeführt mit einer konstanten Geschwindigkeit oder mit einer beschleunigten Geschwindigkeit laufen. In jedem Fall müssen die Tiere vor der ersten Prüfung gültig trainiert werden, weil einige mehr als andere Ausbildung brauchen kann, um ein grundlegendes Maß an motorischer Koordination zu erhalten. Eine Einschränkung wird durch unterschiedlich motivierte Tieren vertreten, um diese Aufgabe durchzuführen. Dies kann jedoch durch wiederholte Tests von mindestens th kompensiert werdenREE-mal pro Tag einer Klausur. Ein weiterer Motor Verhaltenstest die sehr empfindlich bei der Aufdeckung von frühen motorischen Defiziten ist die Footprint-Analyse 11. Es ist jedoch recht aufwendig, weil die Tiere motiviert werden, laufen über eine Gangway, nachdem sie ihre Füße eingetaucht in ein Reservoir von Farbe werden müssen. Die Qualität der Aufstandsfläche kann weitgehend variieren und eine softwaregestützte Analyse ist schwierig. Deshalb bevorzugen wir die Rotarod Test zur Beurteilung der motorischen Koordination.
Der Draht hängen Test ausgewertet Muskelkraft der Beine. Es ist eine eher grobe Prüfung, die am besten erkennt frühzeitig muskuläre Defizite wenige Wochen nach Beginn der Erkrankung 4. Es ist jedoch sehr einfach durchzuführen und die gesamte Testvorrichtung leicht ausgebildet werden. Eine ausführlichere Test für Muskelkraft ist die Verwendung von einem Kraftaufnehmer 12. Hier wird die Maus zur Eingabe eines bar mit einem Kraftaufnehmer entweder mit den Hinterbeinen oder seinem vorderen greifenPfoten. Andere funktionale Tests, die berücksichtigt werden müssen, beinhalten die Messung des Laufrades Abstand oder sogar die Auswertung von Open-field-Aktivität 3, 13. Aber nach unserer Erfahrung die Kombination aus dem Rotarod und dem Draht hängen Test erwies sich als am empfindlichsten, leicht durchführbar und zeitsparend für die Auswertung der SOD1 G93A Mäuse. Insgesamt sollte ein präklinischen Studie an Tieren sehr sorgfältig geplant werden und sollte Grundprinzipien einer klinischen Studien am Menschen folgen wie in den CONSORT Richtlinien (beschrieben www.consort-statement.org ) 14. Nur dann kann der Einsatz von Tieren für die präklinische Forschung begründet werden und die Ergebnisse können letztendlich zu einer erfolgreichen Übersetzung in eine menschliche klinische Anwendung führen.
Diese klinischen Befunde und Verhaltensstörungen sollte immer auf einer Analyse der Pathologie des neuromuskulären Einheit einschließlich Rückenmark moto korreliert werdenNeuron, Axon und neuromuskulären Endplatte 14. Hier ist eine hochwertige Analyse von ZNS-Pathologie des Rückenmarks eine Voraussetzung für die Interpretation der Auswirkungen der Überlebenszeit oder Fortschreiten der Erkrankung. Da gründliche Gewebefixierung kritisch ist, muss die Durchblutung der Tiere mit einer 4% Paraformaldehyd mit PBS-Lösung standardisiert gut. Um der Lage sein, entfernen Sie vorsichtig das Rückenmark ein Seziertisch sollte zusammen mit einem festen Operationsmikroskop installiert werden und feine chirurgische Instrumente verfügbar sein müssen (siehe Liste von chirurgischen Instrumenten unten). Nachdem die gesamte Wirbelsäule entfernt worden ist, kann es an die entsprechende Schnitte Technik (z. B. Vibratom oder Kryotom) verarbeitet werden und kann schließlich zu immunhistologische Analyse unterzogen werden. Hier sind Grundlagenermittlung Parameter die Zahl der Motoneuronen des Rückenmarks und aktiviert oder Infiltrieren Gliazellen 10, 15. Abhängig von der ursprünglichen Fragestellung, zusätzliche immunhistochemische markers wie SOD-Aggregate oder ZNS-Endothel Integrität bewertet werden kann. Darüber hinaus können peripheren Nervensystems Krankheitspathologie durch Untersuchung der peripheren Nerven Axone und der neuromuskulären Endplatten ausgewertet werden. Nur die Kombination von klinischen und immunhistochemischen Analysen von ZNS und PNS eine gründliche Blick auf Gesamt-ALS-Pathologie, die mit den klinischen Befunden korreliert werden muss.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
LT hat Zuschüsse aus dem Forschungsförderungsprogramm der Universitätsmedizin Göttingen erhalten. PL und MB wurden von der DFG-Forschungszentrum für Molekulare Physiologie des Gehirns (CMPB), Göttingen unterstützt. Die Autoren danken Dr. Lars Tatenhorst um Unterstützung bei der Videografie und Birgit Liebau für die Hilfe bei Audio-und Videobearbeitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rota-Rod for Mice | Ugo Basile | # 47600 | |
| Hanging wire device | Custom Made | ||
| Operation Table Operation lamp Protective gloves | |||
| “Iris” Scissors, angled to side | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Micro forceps | Hammacher, Solingen, Germany | HWC 111-10 | |
| Scalpel “präzisa plus” | Dahlhausen, Köln, Germany | 11.000.00.510, FIG 10 |
References
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