Summary
En mus modell for amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er undersøkt klinisk og behaviorally. Som en forutsetning for en ledsagende immunhistokjemi analyse utarbeidelse av ryggmargen er avbildet i detalj.
Abstract
Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en fatal nevrodegenerativ lidelse som fører til progressiv degenerasjon av motoneurons. Peak av utbruddet er rundt 60 år for den sporadiske sykdommen og rundt 50 år for familiær sykdom. På grunn av sin progressive kurs, 50% av pasientene dør innen 30 måneder etter symptomdebut. For å kunne vurdere nye behandlingsalternativer for denne sykdommen, har genetiske musemodeller av ALS er generert basert på menneskelige familiære mutasjoner i SOD genet, som SOD1 (G93A) mutasjon. De fleste viktige aspekter som må vurderes i modellen er total overlevelse, klinisk forløp og motorisk funksjon. Her viser vi den kliniske vurderingen, viser gjennomføring av to atferdsmessige motoriske tester og gi kvantitative scoring systemer for alle parametere. Fordi en grundig analyse av ALS mus modell krever vanligvis en immunhistokjemisk undersøkelse av ryggmargen, viser vi til utarbeidelse i detalj bruk av dorsal laminektomi metode. Eksemplariske histologiske funn blir demonstrert. Den omfattende bruken av de avbildede undersøkelsesmetoder i studier på mus modell av ALS vil gjøre forskeren til pålitelig teste fremtidige terapeutiske muligheter som kan gi grunnlag for senere kliniske studier.
Protocol
Dyrene ble kjøpt fra Jackson Laboratory (# 002726) 1. De er klinisk scoret og utsatt for en test av motorisk funksjon (rotarod test) og muskulær styrke (hengende ledning test). Alle disse testene og senere avliving av dyrene for å forberede ryggmargen har blitt utført i tett henhold til de lokale retningslinjene for forsvarlig gjennomføring av dyreforsøk.
1. Klinisk Resultat
Bortsett fra vurderingen for kroppsvekt mus blir undersøkt for tegn på motor underskudd med følgende fire poengrekning system 2:
4 poeng: normal (ingen tegn til motorisk dysfunksjon)
3 poeng: bakbeina lem skjelvinger er tydelig når suspendert etter halen
2 poeng: ganglag abnormiteter er til stede
1 poeng: å dra på minst en hind lem
0 poeng: symmetrisklammelse, manglende evne til høyre selv eller tap av 20% av maksimal kroppsvekt, i dette tilfellet dyrene umiddelbart avlives og eksperimentet er avsluttet
2. Tester av motorikk og muskelstyrke
Hengende ledning
Denne testen brukes til å vurdere muskulær styrke tre, fire. Alle dyr utføre denne testen minst én eller to dager etter rotarod testen. Hver mus er plassert på en skreddersydd tråd lokk med intervaller på 0,8 cm og forsiktig snudd opp ned, dekket 60 cm over et strå bunn. Etter trening for tre ganger på rad på minst 180 er den ventetid for å falle måles. Hver mus gis opptil tre forsøk på å holde på den omvendte lokket til maksimalt 180 s og den lengste perioden er spilt.
Rotarod Test
3, 4. En god prestasjon krever en høy grad av sensorimotor koordinering. Maskinen bør plasseres i et rolig og ikke-forstyrrende miljøet å unngå distractive stimuli for den testede dyr. Det består av en datastyrt motordrevet roterende spindel og fem kjørefelt for fem mus. Falls of musene blir oppdaget automatisk av press på en plastplate i bunnen. Etter trening for tre ganger på rad på minst 180 s ved en konstant hastighet på 15 rpm tiden som et dyr kan være på roterende stang måles. Hvert dyr gjennomgår tre forsøk og den lengste ventetid uten å falle er registrert. Tiden på 180 s er valgt som cut-off tid fordi flertallet av betydelige forskjeller i motorisk koordinasjon er registrert i dette tidsrommet.
3. Spinal Cord Forberedelse
- Dyr blir drept av CO 2 innblåsning i samsvar med lokale retningslinjer, og er straks perfused transcardially med PBS løsning etterfulgt av en 4% paraformaldehyde løsning.
- For å forberede ryggmargen av det ofret musen, blir dyret plassert på en operasjon bord og fire lemmer er festet på siden for å avsløre baksiden av musen.
- En kort vask med en 70% etanol løsning renser stedet disseksjon og flater pels.
- Så huden blir radert med en skarp skalpell i midtlinjen. For å lette kutte huden er strukket til begge sider. Hvis musklene skal utarbeides, har deres hud også å bli radert.
- Etter at huden snitt er ferdig, blir det trukket til side med en pinsett til å avdekke underliggende overfladiske fascien av kroppen.
- Muskulaturen i nakken og nuchal ligament må fjernes, og er carefully forberedt. Vær forsiktig så du ikke Incise til dypt og lesjon ryggmargen. De skulder muskler kan også fjernes for å bedre utsette ryggsøylen.
- Deretter paravertebral musklene er fjernet fra hele ryggsøylen.
- For å åpne ryggsøylen flere laminectomies må utføres. Man bør starte fra øvre kraniale del på stedet av den atlanto-occipital joint.
- Det er lettest å fjerne fiksering av de to øverste lemmer og overstrekke hals for å være bedre i stand til å utføre laminektomi av den første ryggvirvler. Disse er trukket vekk uten å berøre den eksponerte cervical ryggmargen.
- Mer ryggvirvlene er fjernet av første transecting ryggvirvel buene på begge sider med vinklet saks og deretter trekke på dorsal prosessene. Gjenværende laterale deler av ryggvirvlene bør fjernes for å lette senere fullstendig fjerning av ryggmargen.
- En anatomisk landemerke av korsryggen spinal ledningen er intumescence som også er tilstede i livmorhalsen ryggmargen.
- Etter å ha avsluttet laminektomi av hele ryggmargen, sørg for at du også transekt alle ventrale røtter og slipp ryggmargen fra dura mater av hjernehinnene.
- Da cervical ryggmargen er kuttet cranially og du begynner å fjerne ryggmargen.
- Endelig ryggmargen blir også kuttet på distale cauda-equina å være helt ut.
- Til syvende og sist, er ryggmargen plassert i en postfixating løsning (f.eks 4% paraformaldehyde) over natten og kan bearbeides videre. Vi pleier cryosection ryggmargen å forberede den for immunhistokjemi analyse.
4. Representative Resultater
Teknikken av ryggmargen forberedelse representerer fokuset i denne videoen artikkelen. Det er en viktig forutsetning for senere vev seksjonering og til slutt for immunhistokjemi analyse av spinal ledningen seksjoner. Som et eksempel på et endelig resultat, en immunhistokjemisk workup av fremre horn regionen musen lumbale ryggmarg av en hvete (WT) og av en SOD G93A transgene (TG) mus blir demonstrert. Motoriske nerveceller kan identifiseres med en primær anti-Chat antistoff og påfølgende fluorescerende merking med en sekundær Cy3 antistoff. I tillegg har en kjernefysisk mot flekken med DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) utført (figur 1).
Figur 1. Fluorescent photomicrographs visualisere immunodetection av motoneurons med anti-Chat antistoff (rødt) og cellulær atomkjerner counter-flekken ved DAPI (blå) i mus korsryggen ryggmargen fremre horn av en hvete (WT) (til venstre) og av en SOD G93A transgen (TG) (til høyre) mus i en alder av 130 dager. Scale bar: 40 mikrometer.
Som immunhistokjemisk analyse avde SOD G93A mus er ikke den primære omfanget av denne artikkelen kan du se den originale publikasjonen der disse transgene mus har blitt karakterisert og senere de som studerer terapeutiske tilnærminger for videre henvisning 1, 5, 6. Hvis terapeutiske effekter skal differensieres på immunhistokjemi nivå klart definert kvantitative evaluering algoritmer bør påføres støttes av en stereological programvare (for eksempel se 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den SOD1 (G93A) genetisk mus modell er et verdifullt dyr modell for å studere sykdommen løpet av progressiv motoneuron tap sammenlignes med menneskelig amyotrofisk lateral sklerose 8. En rekke ulike behandlingstilbud paradigmer har blitt evaluert i denne modellen, og representerer et grunnlag for senere testing i kliniske studier 8-10. For å kunne oppdage signifikante forskjeller i en eksperimentell behandlingsstudie i disse musene, er det av største viktighet å omfatte minst 24 kull-matchet kjønnsbalansert mus av samme genetiske bakgrunn og følger en dobbel-blindet design åtte. Sammenlignbart med kliniske studier, bør en enkelt ensartet endepunkt kriterium velges. Her er det mest brukte en manglende evne dyret til høyre selv i 30 sekunder etter å ha blitt plassert på sin side. Dersom dette kriteriet er nådd dyret er slaktet og dens levetid blir registrert som tiden for å overleve.
Treatment studier kan bli startet på et presymptomatic klinisk tilstand (for eksempel på dagen i livet (DOL) 50 eller på DOL 30) når dyrene ennå ikke viser noen tegn til motorisk dysfunksjon og ville scoret med 4 poeng i vår kliniske scoring system . En annen mulighet består i en symptomatisk behandling tilnærming som skal starte når den første kliniske symptom vises og bakbeina lem skjelvinger er tydelig når dyret er suspendert etter halen. Dette er definert som sykdomsutbruddet og denne innledende sykdom scenen er gradert med klinisk vurdering 3. Vesentlige nedskrivninger i tester av motorisk funksjon og muskelstyrke som oftest bare mer enn to til fire uker senere. Som på gjennomsnittet dyrene nå første klinisk sykdom scenen rundt DOL 80, noen forskere begynner sin symptomatisk behandling for alle dyr på dette tidspunkt i en forenklet tilnærming. I begge innstillingene er det obligatorisk å overvåke sykdomsutvikling. Dette bør startes samtidig med behandlingsstart for presymptomatisk behandlet dyr (DOL 50 eller 30 DOL, henholdsvis) eller på DOL 70 for symptomatisk behandlede dyr. Overvåking av sykdomsprogresjon inkluderer en to ganger ukentlig bestemmelse av kroppsvekt, klinisk nevrologiske scoring og tester av motorikk og muskelstyrke. Dersom dyrene nå klinisk vurdering 1 (dra på minst en hind lem) anbefaler vi å utføre daglige bestemmelse av kroppsvekt og klinisk oppfølging for ikke å gå glipp av den kliniske poengsummen 0 poeng (symmetrisk lammelser, manglende evne til høyre selv eller tap av 20 % av maksimal kroppsvekt) når dyrene må avlives umiddelbart og eksperimentet er avsluttet. Det anbefales at en første gangs sensor styres av en erfaren dyr forsker som bidrar til å oppdage også subtile kliniske tegn på progresjon. Den kliniske 4 punkt-scoring system etter Weydt m.fl. 2 er godt etablert i feltet, og er en pålitelig system ved hjelp av kriterier som kan være tydelig differensiert. Amer subtil differensiering av kliniske symptomer vil være mindre klart og sterkt sensor avhengige.
For å oppdage atferdsmessige underskudd en rekke test paradigmer er tilgjengelig. De fleste forfattere favorisere rotarod test som evaluerer evne dyret til å kjøre på en roterende 4 sylinder, 11. I en studie som undersøkte betydningen av atferdsmessige tester i SOD1 G93A mus modell den rotarod testen viste seg å være svært sensitiv for å påvise signifikante forskjeller mellom hvete og transgene mus så tidlig som fra uke 16 av alder på 11. Mulige modifikasjoner inkluderer kjører med en konstant hastighet eller en økt hastighet løp. I alle fall dyrene må trenes før den første gyldige testing fordi noen kan trenge mer trening enn andre for å oppnå et minimumsnivå for motorisk koordinasjon. En begrensning er representert med ulikt motiverte dyr til å utføre denne oppgaven. Dette, derimot, kan kompenseres ved gjentatte tester på minst thRee ganger per eksamen dagen. En annen motor atferdsmessige testen som er veldig sensitiv for å påvise tidlige motoriske underskudd er fotavtrykket analysen 11. Men det er ganske arbeidskrevende fordi dyrene må bli motivert til å kjøre over en landgang etter å ha sine føtter dyppes i et reservoar av maling. Kvaliteten på plass kan variere i stor grad og en programvare-aided analyse er vanskelig. Derfor foretrekker vi rotarod test for evaluering av motorisk koordinasjon.
Den hengende ledning testen evaluert muskelstyrke av lemmer. Det er en ganske grov test som best oppdager tidlig muskulære underskudd noen uker etter oppstart av sykdom 4. Imidlertid er det svært enkelt å utføre og hele testing apparatet lett kan konstrueres. En mer utførlig test for muskelstyrke er bruken av en kraft svinger 12. Her er musen bedt om å ta en bar koblet til en kraft svinger med enten sin hind eller forgrunnenpoter. Andre funksjonstester som må vurderes omfatter måling av kjøre hjulet avstand eller evaluering av åpen felt aktivitet 3, 13. Men i vår erfaring kombinasjonen av rotarod og hengende ledning testen viste seg å være mest følsom, lett praktisk og tidseffektiv for evalueringen av de SOD1 G93A mus. Samlet sett bør en preklinisk studie på dyr utformes meget omhyggelig og skal følge grunnleggende prinsipper for en kliniske studier som beskrevet i de CONSORT retningslinjene ( www.consort-statement.org ) 14. Først da, kan bruk av dyr for preklinisk forskning begrunnes og resultatene kan til slutt føre til en vellykket oversettelse til et menneske klinisk anvendelse.
Disse kliniske og atferdsmessige funn bør alltid være korrelert til en analyse av patologi av den nevromuskulære enheten inklusive ryggmargen motonervecellen, axon og nevromuskulær veikryss 14. Her er en høy kvalitet analyse av CNS ryggmarg patologi en forutsetning for tolkningen av effekter i overlevelse eller sykdom progresjon. Fordi grundig vev fiksering er kritisk, bør perfusjon av dyrene med en 4% paraformaldehyde inneholder PBS-løsningen være standardisert godt. For å kunne forsiktig fjerne ryggmargen en disseksjon tabell bør monteres sammen med en fast drift mikroskop og fine kirurgiske instrumenter må være tilgjengelig (se liste av kirurgiske instrumenter nedenfor). Etter hele ryggmargen er fjernet, kan det bli behandlet på riktig seksjonering teknikk (f.eks vibratome eller cryotome) og kan endelig bli utsatt for immunhistokjemi analyse. Her grunnleggende evaluering parametrene er tallene av ryggmarg motoneurons og aktiveres eller infiltrere gliaceller 10, 15. Avhengig av original problemstilling, i tillegg immunhistokjemisk markers som SOD tilslag eller CNS endotelet integritet kan evalueres. Videre kan perifere nervesystemet sykdom patologi skal vurderes ved undersøkelse av perifere nerveaxoner og nevromuskulære veikryss. Bare kombinasjonen av både kliniske og immunhistokjemiske analyser av CNS og PNS gi en grundig bakgrunn av det totale ALS patologi som må være korrelert med de kliniske funn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
LT har mottatt stipend støtte fra Forschungsförderungsprogramm ved Universitetet Medicine Göttingen. PL og MB ble støttet av DFG Research Center for molekylær fysiologi av hjernen (CMPB), Göttingen. Forfatterne takker Dr. Lars Tatenhorst for hjelp med videography og Birgit Liebau for hjelp med lyd-og videoredigering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rota-Rod for Mice | Ugo Basile | # 47600 | |
| Hanging wire device | Custom Made | ||
| Operation Table Operation lamp Protective gloves | |||
| “Iris” Scissors, angled to side | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Cohan-Vannas Spring Scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-10 | |
| Micro forceps | Hammacher, Solingen, Germany | HWC 111-10 | |
| Scalpel “präzisa plus” | Dahlhausen, Köln, Germany | 11.000.00.510, FIG 10 |
References
- Gurney, M. E. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Weydt, P. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).
- Crawley, J. N. Behavioral phenotyping strategies for mutant mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
- Miana-Mena, F. J. Optimal methods to characterize the G93A mouse model of ALS. Amyotroph. Lateral Scler. Other Motor Neuron Disord. 6 (1), 55-62 (2005).
- Zhong, Z. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Invest. 119 (11), 3437-3449 (2009).
- Pitzer, C. Granulocyte-colony stimulating factor improves outcome in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131 (Pt. 12), 3335-3347 (2008).
- Gowing, G. Ablation of proliferating microglia does not affect motor neuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis caused by mutant superoxide dismutase. J. Neurosci. 28 (41), 10234-10244 (2008).
- Scott, S. interpretation of studies in the standard murine model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).
- Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
- Corse, A. M. Preclinical testing of neuroprotective neurotrophic factors in a model of chronic motor neuron degeneration. Neurobiol Dis. 6 (5), 335-346 (1999).
- Knippenberg, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behav Brain Res. 213 (1), 82-87 (2010).
- Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Neuromuscular disease models and analysis. Methods Mol. Biol. 602, 347-393 (2010).
- Hayworth, C. R., Gonzalez-Lima, F. Pre-symptomatic detection of chronic motor deficits and genotype prediction in congenic B6.SOD1(G93A) ALS mouse model. Neuroscience. 164 (3), 975-985 (2009).
- Ludolph, A. C. Guidelines for preclinical animal research in ALS/MND: A consensus meeting. Amyotroph Lateral Scler. 11 (1-2), 38-45 (2010).
- Boillee, S. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 5778 (3), 1389-1392 (2006).
