Neurale eksplantatkulturer fra<em> Xenopus laevis</em

Summary

Dyrkning af neurale eksplantater fra dissekeret<em> Xenopus laevis</em> Embryoner, der udtrykker fluorescerende fusionsproteiner tillader afbildning af vækst kegle cytoskeletale dynamik.

Abstract

Den komplicerede proces med axon vejledning er i høj grad drevet af væksten kegle, hvilket er den dynamiske motile struktur på spidsen af ​​den voksende axon. Under Axon udvækst må væksten kegle integrere flere kilder til vejledning cue information at modulere sin cytoskeleton for at drive væksten kegle fremad og præcist navigere for at finde de specifikke mål ^1. Hvordan denne integration forekommer ved cytoskeletal niveau stadig opstår, og undersøgelse af cytoskeletprotein og effektor dynamik i vækst kegle kan tillade belysning af disse mekanismer. Xenopus laevis vækstkegler er stor nok (10 til 30 mikron i diameter) for at udføre høj opløsning direkte billedvisning af cytoskeletale dynamik (fx ^2-4) og er lette at isolere og manipulere i et laboratorium indstilling i forhold til andre hvirveldyr. Frøen er en klassisk model for udviklingsmæssige neurobiologi undersøgelser, og vigtige tidlige indsigt i vækst kegle microtubule dynamik blev oprindeligt fundet ved hjælp af dette system ^5-7. I denne metode ⁸ bliver æg opsamles og befrugtes in vitro, injiceret med RNA, der koder fluorescerende mærkede cytoskeletale fusionsproteiner eller andre konstruktioner til at manipulere genekspressionen, og fik derefter lov til at udvikle sig til neuralrøret fase. Neurale rør isoleres ved dissektion og derefter dyrkes, og vækstkegler på outgrowing neuritter afbildes. I denne artikel beskriver vi, hvordan at udføre denne fremgangsmåde, hvis formål er at kultur Xenopus laevis vækstkegler til efterfølgende høj opløsning billedanalyse. Mens vi giver som eksempel + TIP fusionsprotein EB1-GFP, kan denne fremgangsmåde anvendes til ethvert antal proteiner at belyse deres adfærd i vækst kegle.

Protocol

Bemærk: Vi beskriver trinene i de to første afsnit kun i kort, som fremragende protokoller med detaljerede oplysninger er blevet offentliggjort andetsteds, der fokuserer mere specifikt på disse trin (f.eks 8-12). Derudover har den generelle protokol at arbejde med Xenopus spinale neuroner i levende cellekultur tidligere blevet offentliggjort i et detaljeret metoder artikel 8. Vi stærkt anbefale, at artiklen som et supplement til denne video, men her vi giver nok information ti…

Discussion

Xenopus laevis neurale eksplantater sende neuritter i en meget robust måde ved 24 timer efter udpladning på laminin / poly-lysin substrat, hvis forholdene er passende. Med dette substrat, er vækstkegler meget motile og kan opnå axon længder på op til 1 mm, der strækker sig i alle retninger udad fra eksplantatet, men typiske længder er 100 um eller mere. Hvis neuritter ikke vokser ud, er der et begrænset antal grunde til, at dette er tilfældet. En mulighed er, at de neurale eksplantater ikke korrekt ho…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue Number
Chorionic Gonadotropin	Argent Chemical Laboratories	C-HCG-ON-10
Cysteine	Sigma-Aldrich	52-90-4
mMessage mMachine kit	Ambion	AM1340
Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID)	FHC	30-31-0
Ficoll	Sigma	F2637
Dumont #5 Biologie Inox Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Collagenase	Sigma-Aldrich	9001-12-1
Mattek dishes	Mat Tek Corporation	P35G-1.5-14-C
L-15	Invitrogen	21083-027
Poly-l-lysine	Sigma	P-1399
Laminin	Sigma	L2020
NT3	Sigma	N1905
BDNF	Sigma	B3795