Neurais culturas de explante de<em> Xenopus laevis</em
Summary
Explantes neurais de dissecados<em> Xenopus laevis</em> Embriões que expressam proteínas de fusão fluorescentes permite a imagiologia da dinâmica de crescimento do cone do citoesqueleto.
Abstract
O complexo processo de direccionamento axonal em grande medida pelo cone de crescimento, que é a estrutura dinâmica móveis na extremidade do axónio crescente. Durante o crescimento axonal, o cone de crescimento deve integrar múltiplas fontes de informação deixa de orientação para modular seu citoesqueleto, a fim de impulsionar o cone de crescimento para a frente e precisa navegar para encontrar seus alvos específicos 1. Como esta integração ocorre ao nível do citoesqueleto é ainda emergente, e exame da proteína do citoesqueleto e dinâmica efectoras dentro do cone de crescimento pode permitir a elucidação desses mecanismos. Cones de crescimento de Xenopus laevis são suficientemente grandes (10-30 microns de diâmetro), para realizar alta resolução de imagem ao vivo da dinâmica do citoesqueleto (por exemplo 2-4) e são fáceis de isolar e manipular em um ambiente de laboratório em comparação com outros vertebrados. A rã é um sistema modelo clássico para estudos de desenvolvimento da neurobiologia e importantes idéias iniciais em mic cone de crescimentodinâmica rotubule foram inicialmente encontrados usando este sistema 5-7. Neste método 8, os ovos são recolhidos e fertilizados in vitro, injectados com RNA que codifica as proteínas de fusão marcadas com fluorescência do citoesqueleto ou outras construções de manipular a expressão do gene, e depois deixou-se desenvolver até o estádio do tubo neural. Tubos neurais são isolados por dissecção e, em seguida, são cultivadas, e cones de crescimento de neurites superando são gravadas. Neste artigo, descreve-se como para executar este método, o objectivo da qual é a cultura de Xenopus laevis cones de crescimento para a análise de imagem subsequente de alta resolução. Enquanto nós fornecemos o exemplo da proteína de fusão + TIP EB1-GFP, este método pode ser aplicado a qualquer número de proteínas de elucidar o seu comportamento no interior do cone de crescimento.
Protocol
Discussion
Explantes de Xenopus laevis neurais enviar neurites de uma maneira muito robusta por 24 horas após o plaqueamento na laminina / poli-lisina substrato, se as condições são apropriadas. Com este substrato, cones de crescimento são altamente móveis e podem atingir comprimentos de axónios de até 1 mm, estendendo-se em todas as direcções para fora a partir do explante, embora comprimentos típicos são de 100 um ou mais. Se neurites não crescem para fora, há um número limitado de razões para que este s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Bob Freeman para treinamento e laboratório de Kirschner para a utilização do mecanismo sapo, e membros do laboratório Vactor Van de apoio. Agradecemos a Nikon Imaging Center da Harvard Medical School de assistência à microscopia de luz para as imagens na Figura 1. Este trabalho foi financiado pelo seguinte: NRSA NIH companheirismo e comunhão NIH K99 a LAL, Ciência Básica Parceria financiamento ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) a AEF, e NIH RO1 NS035909 para DVV
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | C-HCG-ON-10 |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 |
| Ficoll | Sigma | F2637 |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 |
| Poly-l-lysine | Sigma | P-1399 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| NT3 | Sigma | N1905 |
| BDNF | Sigma | B3795 |
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