培养神经外植体解剖<em>非洲爪蟾</em表达荧光融合蛋白的胚胎,使成像的生长锥细胞骨架的动态。
轴突引导的复杂过程,主要是由,这是动态能动结构的尖端处的生长的轴突生长锥。在轴突生长,生长锥必须整合多种来源的指导提示信息,调节细胞的骨架,以推动生长锥和准确定位找到它的具体目标1。这种整合发生在细胞骨架的水平如何,仍是新兴的,在生长锥细胞骨架蛋白和效应动力学检查可以让这些机制的阐明。 非洲爪蟾生长锥足够大(直径10-30微米)进行高的高分辨率实时成像细胞骨架的动态( 如 2-4),很容易分离和操作在实验室设置比其他脊椎动物。青蛙是一个典型的模型系统发育神经生物学研究,以及重要的早期洞察生长锥话筒最初发现使用该系统5-7 rotubule动态。在此方法中8,鸡蛋收集受精卵在体外 ,注入与RNA编码荧光标记的细胞骨架的融合蛋白或其他结构,操纵基因的表达,然后使其发展到神经管阶段。神经管分离解剖,然后进行培养,和不敷神经突起生长锥成像。在这篇文章中,我们将介绍如何执行此方法,我们的目标,就是要培养非洲爪蟾生长锥为后续的高清晰度图像分析。虽然我们提供+ TIP融合蛋白EB1-GFP的例子中,此方法可应用于任意数量的蛋白质生长锥内澄清他们的行为。
非洲爪蟾神经外植体发出神经突起,在一个非常强大的方式24小时后电镀层粘连蛋白/聚赖氨酸基板上,如果条件合适的。该基板上,生长锥高度运动,并可以实现轴突长度可达1毫米,在所有方向上从外植体向外延伸,虽然典型的长度为100微米或以上。如果神经突起不生长出来,有这种情况的原因是这种情况的数量是有限的。一种可能性是,神经外植体没有正确坚持的菜。确保不破坏附件?…
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢鲍勃·弗里曼为培训和克氏针实验室的使用的青蛙设施,凡向量子实验室的支持。我们感谢哈佛医学院的尼康影像中心寻求帮助,在光学显微镜图1中的图像。这项工作是由以下内容:NRSA美国国立卫生研究院的奖学金和NIH K99奖学金拉尔,基础科学伙伴关系的资金( https://bsp.med.harvard.edu/ )AEF和NIH RO1 NS035909 DVV