Los cultivos neuronales de explantes de<em> Xenopus laevis</em
Summary
Cultivo de explantes neuronales de disección<em> Xenopus laevis</em> Embriones que expresan proteínas fluorescentes de fusión permite la obtención de imágenes de cono de crecimiento dinámica del citoesqueleto.
Abstract
El complejo proceso de orientación axón está impulsado principalmente por el cono de crecimiento, que es la estructura dinámica móviles en la punta del axón en crecimiento. Durante axón resultado, el cono de crecimiento debe integrar múltiples fuentes de información de guía señal para modular su citoesqueleto con el fin de propulsar el cono de crecimiento hacia adelante y precisa navegar a encontrar sus objetivos específicos 1. Cómo esta integración se produce a nivel del citoesqueleto todavía está emergiendo, y el examen de proteína del citoesqueleto y la dinámica efectoras dentro del cono de crecimiento puede permitir la elucidación de estos mecanismos. Xenopus laevis conos de crecimiento son lo suficientemente grandes (10-30 micras de diámetro) para realizar alta resolución de imagen en directo de la dinámica del citoesqueleto (por ejemplo, 2-4) y son fáciles de aislar y manipular en un ambiente de laboratorio en comparación con otros vertebrados. La rana es un sistema modelo clásico de desarrollo de los estudios de neurobiología e importantes reflexiones tempranas en mic cono de crecimientodinámica rotubule se encontraron inicialmente utilizando este sistema de 5-7. En este método 8, se recogen los huevos y fertilizados in vitro, inyectados con ARN que codifica las proteínas de fusión etiquetadas fluorescentemente citoesqueleto o de otras construcciones para manipular la expresión génica, y luego se dejó desarrollar a la etapa del tubo neural. Tubos neurales están aislados por la disección y luego cultivadas son, y los conos de crecimiento de neuritas outgrowing fotografiado está. En este artículo, se describe cómo llevar a cabo este método, el objetivo de las cuales es para los conos de crecimiento de cultivo de Xenopus laevis para su posterior análisis de imágenes de alta resolución. Si bien damos el ejemplo de proteína de fusión + TIP EB1-GFP, este método se puede aplicar a cualquier número de proteínas para dilucidar sus comportamientos en el cono de crecimiento.
Protocol
Discussion
Xenopus laevis explantes neuronales enviar neuritas de una manera muy robusta por 24 hr después de la siembra en la laminina / poli-lisina sustrato, si las condiciones son apropiadas. Con este sustrato, los conos de crecimiento son muy móviles y pueden alcanzar longitudes de los axones de hasta 1 mm, que se extiende en todas las direcciones hacia el exterior a partir del explante, aunque longitudes típicas son 100 micras o más. Si neuritas no crecen hacia fuera, hay un número limitado de razones para que e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Bob Freeman para la formación y el laboratorio de Kirschner para la utilización de las instalaciones de rana, y los miembros del laboratorio Van Vactor para el apoyo. Damos las gracias a la Nikon Imaging Center de la Harvard Medical School de asistencia con microscopía de luz para las imágenes de la figura 1. Este trabajo fue financiado por el texto siguiente: NRSA NIH NIH K99 comunión y compañerismo con LAL, Ciencias Básicas Asociación financiación ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) a AEF, y NIH RO1 NS035909 para DVV
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | C-HCG-ON-10 |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 |
| Ficoll | Sigma | F2637 |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 |
| Poly-l-lysine | Sigma | P-1399 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| NT3 | Sigma | N1905 |
| BDNF | Sigma | B3795 |
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