Summary

에서 신경 Explant의 문화<em> Xenopus laevis</em

Published: October 15, 2012
doi:

Summary

해부에서 배양 신경 explants<em> Xenopus laevis</em> 형광 융합 단백질을 표현하는 배아는 성장 콘 cytoskeletal 역학의 이미지 할 수 있습니다.

Abstract

축삭지도의 복잡한 과정은 크게 성장 축삭의 끝에서 동적 운동성 구조입니다 성장 콘에 의해 구동된다. 축삭의 가지 동안 성장 콘 앞으로의 성장 콘을 추진하고 정확하게 특정 목표 1을 (를) 찾을 수로 이동하기 위해 자사의 세포 골격을 조절하는 가이드 큐 정보를 여러 소스를 통합해야합니다. 이 통합은 cytoskeletal 수준에서 발생하는 방법을 계속 대두되고, cytoskeletal 단백질과 성장 콘에서 이펙터 역학 시험이 메커니즘의 해설을 할 수 있습니다. Xenopus laevis 성장 콘이됩니다 (직경 10-30 미크론) 충분히 큰 높은 수행 할 수 해상도 cytoskeletal 역학의 라이브 영상 (예 2-4)과는 다른 vertebrates에 비해 실험실 환경에서 분리하고 조작하기 쉽습니다. 개구리 성장 원뿔 마이크에 발달 신경 생물학 연구, 중요한 초기 분석을위한 고전 모델 시스템입니다rotubule 역학은 처음이 시스템은 5-7를 사용 발견되었습니다. 이 방법 8, 계란 수집하고 체외에서 수정 된, 유전자 발현을 조작하는 RNA 인코딩 휘황 태그 cytoskeletal 융합 단백질 또는 다른 구조로 주입 한 다음, 신경 튜브 단계로 발전 할 수있었습니다. 신경 튜브는 절개로 분리 한 후 배양하고 있으며, outgrowing neurites의 성장 콘은 이미징 있습니다. 이 문서에서는, 우리는이 방법 이후의 고해상도 이미지 분석을위한 문화 Xenopus laevis의 성장 콘에게있는 목표를 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 우리가 + TIP 융합 단백질 EB1-GFP의 예를 제공하지만,이 방법은 성장 콘 이내에 행동을 명료하게하다하는 단백질의 수에 적용 할 수 있습니다.

Protocol

참고 : 자세한 정보와 함께 우수한 프로토콜이 그 초점을 더 구체적으로 다음 단계에서 (예 : 8-12) 다른 곳에서 출판 된대로 우리 만 간단한에서 처음 두 절에 나와있는 단계를 설명합니다. 또한, 라이브 세포 배양에 Xenopus 척추 뉴런 작업의 일반적인 프로토콜은 이전에 자세한 방법 제 8 조에서 출판되었습니다. 여기에 우리가 성공적으로 수행하고 3 단계에서 신경 튜?…

Discussion

조건이 적절한 경우 Xenopus laevis 신경 explants는 laminin / 폴리 라이신 기판에 도금 후 24 시간으로 매우 강력한 방식으로 neurites을 보낼 수 있습니다. 일반적으로 길이가 100 μm 이상 있지만,이 기판과, 성장 콘은 높은 운동성하고 explant에서 바깥쪽으로 모든 방향으로 연장, 1 mm까지의 축삭의 길이를 얻을 수 있습니다. neurites 알아 성장하지 않으면 경우가이 이유 제한된 수의가 있습니다. 하나의 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 개구리 시설의 사용에 대한 교육과 Kirschner 연구실에 밥 프리먼을 감사하고, 지원 밴 Vactor 연구실의 구성원 것이다. 우리는 그림 1의 이미지에 빛을 현미경으로 도움이 하버드 의과 대학에서 니콘 이미징 센터를 감사합니다. 이 작품은 다음에 의해 추진하는 사업 : NRSA NIH 교제와 랄에 NIH K99 교제, 기초 과학 협력 기금 ( https://bsp.med.harvard.edu/ AEF에), 그리고 NIH RO1 NS035909을 DVV에

Materials

Name of Reagent Company Catalogue Number
Chorionic Gonadotropin Argent Chemical Laboratories C-HCG-ON-10
Cysteine Sigma-Aldrich 52-90-4
mMessage mMachine kit Ambion AM1340
Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) FHC 30-31-0
Ficoll Sigma F2637
Dumont #5 Biologie Inox Forceps Fine Science Tools 11252-20
Collagenase  Sigma-Aldrich  9001-12-1
Mattek dishes Mat Tek Corporation P35G-1.5-14-C
L-15 Invitrogen 21083-027
Poly-l-lysine Sigma P-1399
Laminin Sigma L2020
NT3 Sigma N1905
BDNF Sigma B3795

References

  1. Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
  2. Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).
  3. Lee, H. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 42, 913-926 (2004).
  4. Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones. Dev. Neurobiol. , (2011).
  5. Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).
  6. Tanaka, E., Kirschner, M. W. The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries. J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).
  7. Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).
  8. Gomez, T. M. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
  9. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , (2010).
  10. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females. J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).
  11. Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).
  12. Lavery, D. L., Hoppler, S. Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus. Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).
  13. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1994).
  14. Guirland, C. Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).
  15. Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).
  16. Turney, S. G., Bridgman, P. C. Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity. Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).
  17. Weinl, C. On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5. Development. 130, 1635-1643 (2003).
  18. Knoll, B. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).
  19. Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos. Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).

Play Video

Cite This Article
Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. Neural Explant Cultures from Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (68), e4232, doi:10.3791/4232 (2012).

View Video