يزدرع الثقافات العصبية من<em> القيطم المورق</em
Summary
إإكسبلنتس زراعة العصبية من تشريح<em> القيطم المورق</em> الأجنة التي تعبر عن البروتينات الفلورية الانصهار يسمح للتصوير من مخروط النمو ديناميات هيكل الخلية.
Abstract
والدافع إلى حد كبير عملية معقدة من التوجيه من قبل محور عصبي مخروط النمو، والذي هو بنية ديناميكية متحركة في الطرف الجنوبي من محور عصبي المتنامية. خلال ثمرة محور عصبي، يجب على مخروط النمو تكامل مصادر متعددة من المعلومات جديلة التوجيه لتعديل الهيكل الخلوي في لدفع النمو قدما المخروط والتنقل للعثور بدقة أهدافها محددة 1. كيف يحدث هذا التكامل على المستوى هيكل الخلية والناشئة لا تزال، وفحص البروتين وديناميات هيكل الخلية المستجيب داخل مخروط النمو يمكن أن تسمح لتوضيح هذه الآليات. الأقماع القيطم المورق النمو كبيرة بما فيه الكفاية (10-30 ميكرون في القطر) لأداء عالية الدقة التصوير الحي للديناميات هيكل الخلية (على سبيل المثال 2-4) وسهلة لعزل والتلاعب في إعداد مختبر مقارنة الفقاريات الأخرى. الضفدع هو نظام النموذج التقليدي للدراسات التنموية بيولوجيا الأعصاب، والأفكار الهامة في وقت مبكر هيئة التصنيع العسكري مخروط النموتم العثور في البداية ديناميات rotubule باستخدام هذا النظام 5-7. في هذه الطريقة 8، يتم جمع البيض والمخصبة في المختبر، مع حقن الترميز RNA الموسومة fluorescently هيكل الخلية البروتينات الانصهار أو بنيات أخرى للتلاعب التعبير الجيني، ثم تترك لتطوير لمرحلة الأنبوب العصبي. يتم عزل الأنابيب العصبية عن طريق تشريح ومثقف ثم يتم، ويتم تصوير مخاريط النمو على neurites التي تعدى. في هذه المقالة، ونحن تصف كيفية تنفيذ هذه الطريقة، والهدف منها هو القيطم المورق الثقافة مخاريط النمو اللاحقة لتحليل الصور عالية الدقة. بينما نحن نقدم مثال TIP + البروتين GFP-EB1 الانصهار، يمكن تطبيق هذه الطريقة إلى أي عدد من البروتينات لتوضيح تصرفاتهم داخل مخروط النمو.
Protocol
Discussion
القيطم المورق إإكسبلنتس العصبية ترسل neurites التي بطريقة قوية للغاية من 24 ساعة بعد الطلاء على laminin / بولي يسين الركيزة إذا كانت الظروف مناسبة. مع هذا الركيزة، والأقماع هي النمو متحركة للغاية ويمكن تحقيق أطوال تصل إلى محوار 1 ملم، وتمتد في كل الاتجاهات من الخارج يزدر?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر بوب فريمان للتدريب ومختبر كيرشنر لاستخدام المرفق الضفدع، وأعضاء المختبر Vactor فان حصول على الدعم. نشكر مركز التصوير نيكون في كلية هارفارد الطبية للحصول على المساعدة مع المجهر الضوئي للصور في الشكل 1. وقد تم تمويل هذا العمل من خلال ما يلي: NRSA NIH الزمالة والزمالة NIH K99 إلى LAL، العلوم الأساسية الشراكة تمويل ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) لAEF، والمعاهد الوطنية للصحة لRO1 NS035909 DVV
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | C-HCG-ON-10 |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 |
| Ficoll | Sigma | F2637 |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 |
| Poly-l-lysine | Sigma | P-1399 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| NT3 | Sigma | N1905 |
| BDNF | Sigma | B3795 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).
- Lee, H. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 42, 913-926 (2004).
- Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones. Dev. Neurobiol. , (2011).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).
- Tanaka, E., Kirschner, M. W. The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries. J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).
- Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).
- Gomez, T. M. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females. J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).
- Lavery, D. L., Hoppler, S. Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus. Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1994).
- Guirland, C. Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).
- Turney, S. G., Bridgman, P. C. Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity. Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).
- Weinl, C. On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5. Development. 130, 1635-1643 (2003).
- Knoll, B. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).
- Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos. Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).
