Нейронных культур эксплантов от<em> Xenopus Хепориз</em
Summary
Культивирование нейронных эксплантов от расчлененного<em> Xenopus Хепориз</em> Эмбрионов, которые выражают флуоресцентных белков слияния позволяет изображений конуса роста динамики цитоскелета.
Abstract
Сложный процесс руководства аксонов в значительной степени обусловлено ростом конус, который является динамическим подвижные структуры на кончике растущего аксона. Во время аксона результат, рост конуса должна включать различные источники информации руководства кия, чтобы модулировать ее цитоскелета того, чтобы продвинуть вперед конуса роста и точно перемещаться, чтобы найти его конкретных целей 1. Как эта интеграция происходит на уровне цитоскелета только формируется, и изучение цитоскелета, белки и эффектор динамику в пределах конуса роста может позволить выяснение этих механизмов. Xenopus конусов Хепориз роста достаточно большие (10-30 мкм в диаметре) для выполнения высокой разрешение изображений живых динамики цитоскелета (например, 2-4) и легко изолировать и манипулировать в лабораторных условиях по сравнению с другими позвоночными. Лягушка является классическим модельной системой для развития исследований нейробиологии, и важно раннее понимание рост микрофон конусаrotubule динамика изначально были найдены с помощью этой системы 5-7. В этом методе 8, яйца собирают и оплодотворенных в пробирке, вводили РНК, кодирующей флуоресцентно отмеченных белки цитоскелета слияния или другими конструкциями манипулировать экспрессии генов, а затем позволили разработать на стадии нервной трубки. Нейронные трубы изолированы путем рассечения, а затем культивируют, и рост шишек на перерастает нейриты загружаются. В этой статье мы расскажем, как выполнять этот метод, цель которой заключается в культуре Xenopus Хепориз конусы роста для последующих изображений с высоким разрешением анализ. Хотя мы и предоставляем пример + TIP гибридного белка EB1-GFP, этот метод может быть применен к любому количеству белков выяснения их поведения в конус роста.
Protocol
Discussion
Xenopus Хепориз нейронных эксплантов отправить нейритов в очень надежным способом, через 24 часа после покрытия на ламинин / поли-лизин подложку, если условия являются приемлемыми. При этом подложка, конусы роста очень подвижны и могут достичь аксона длиной до 1 мм, расширения во всех н?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Боба Фримена для обучения и Kirschner лабораторию для использования лягушка-центр и члены лаборатории Ван Vactor за поддержку. Мы благодарим Nikon Imaging Центр Медицинской школы Гарварда за помощью световой микроскопии для изображения на рисунке 1. Эта работа финансировалась в следующей редакции: АЯРБ NIH общение и NIH K99 общение с LAL, фундаментальной науки партнерства финансирования ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) для AEF, и NIH RO1 NS035909 для DVV
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | C-HCG-ON-10 |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 |
| Ficoll | Sigma | F2637 |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 |
| Poly-l-lysine | Sigma | P-1399 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| NT3 | Sigma | N1905 |
| BDNF | Sigma | B3795 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).
- Lee, H. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 42, 913-926 (2004).
- Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones. Dev. Neurobiol. , (2011).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).
- Tanaka, E., Kirschner, M. W. The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries. J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).
- Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).
- Gomez, T. M. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females. J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).
- Lavery, D. L., Hoppler, S. Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus. Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1994).
- Guirland, C. Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).
- Turney, S. G., Bridgman, P. C. Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity. Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).
- Weinl, C. On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5. Development. 130, 1635-1643 (2003).
- Knoll, B. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).
- Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos. Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).
