Summary
explants העצבי culturing מגזור
Abstract
התהליך המורכב של הדרכת האקסון מונע בעיקר על ידי חרוט הצמיחה, שהוא המבנה הדינמי ניע בקצה האקסון הולך וגדל. במהלך תולדת האקסון, חרוט הצמיחה חייב לשלב מספר מקורות מידע קיו הדרכה לווסת cytoskeleton כדי להניע את הצמיחה קדימה קונוס ומדויק לנווט למצוא מטרות הספציפיות שלה 1. איך השילוב הזה מתרחש ברמת cytoskeletal עדיין מתפתחים, והבדיקה של חלבון cytoskeletal ודינמיקת מפעיל בתוך חרוט הצמיחה יכולה לאפשר הבהרת המנגנונים אלה. קונוסים צמיחת laevis Xenopus הם גדולים מספיק (10-30 מיקרונים בקוטר) לביצוע גבוה ההדמיה ברזולוצית חיה של דינמיקת cytoskeletal (למשל 2-4) והם קלים לבודד ולטפל בסביבת מעבדה בהשוואה לבעלי חוליות אחרים. הצפרדע היא מערכת מודל קלסית למחקרים התפתחותיים נוירוביולוגיה, ותובנה מוקדמות חשובות למיקרופון חרוט צמיחהדינמיקת rotubule תחילה נמצאה באמצעות מערכת זו 5-7. בשיטה 8 זה, ביצים נאספות ומופרה במבחנה, הזריקה רנ"א קידוד חלבוני היתוך cytoskeletal מתויג fluorescently או מבנים אחרים כדי לתפעל ביטוי גנים, ולאחר מכן אפשרו לפתח לבמת הצינור העצבית. צינורות עצביים מבודדים על ידי נתיחה ואז מתורבתים, וקונוסים צמיחה בneurites נגמל הם צלמו. במאמר זה יתאר כיצד לבצע בשיטה זו, שמטרתה היא לקונוסים תרבות Xenopus laevis צמיחה לניתוח תמונה הבא ברזולוציה גבוהה. למרות שאנו מספקים את הדוגמא של חלבון היתוך עצה + EB1-GFP, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מספר של חלבונים על מנת להבהיר את התנהגותם בתוך חרוט הצמיחה.
Protocol
הערה: אנו מתארים את השלבים בשני הסעיפים הראשונים רק בקצרה, כמו פרוטוקולים מצוינים עם מידע מפורט שפורסמו במקומות אחרים המתמקדים באופן ספציפי יותר בשלבים הבאים (לדוגמה 8-12). בנוסף, הפרוטוקול הכללי של עבודה עם תאי עצב בעמוד שדרת Xenopus בתרבות תא החייה כבר פורסם בעבר במאמר שיטות מפורט 8. אנו ממליצים בחום לבדוק את המאמר כהשלמה לסרטון הזה, למרות שכאן אין לנו לספק מספיק מידע כדי לבצע בהצלחה ולפתור את הנתיחה העצבית צינור ופרוטוקול ציפוי בשלב 3.
1. הפריה במבחנה של Xenopus ביצים
- להשיג ביצים מצפרדעים נשיות שהוזרקו כוריוני 12-18 שעות גונדוטרופין (400 יחידות / צפרדע) לפני איסוף הביצים. איסוף ביצים בפתרון של 1X מארק השתנה רינגר (MMR) (0.1 מ 'NaCl, 2.0 mM KCl, 1.0 mM 4 MgSO, 2.0 mM CaCl 2, HEPES 5.0 מ"מ, pH 7.4 9).
- להפרות ביציות במבחנה עם אשכים טחונים, כפי שתואר לעיל 9.
- אחרי לפחות 20 דקות, הסר את מעייל ריבת עובר על ידי עוברים דוגרים בציסטאין 2% ב1X MMR (הובא ל-pH 7.8 עם NaOH) במשך 3-5 דקות. לשטוף עם 0.1x MMR (או 0.1x MBS (המתכון השתנה של בארת' המלוח, 1X: 88 המ"מ NaCl, 1 המ"מ KCl, 0.7 המ"מ CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 2.5 המ"מ 3 NaHCO, 5 HEPES מ"מ, pH 7.8)) 3 -5 פעמים, ולשמור על עוברים בטמפרטורת חדר עד לזריקות, או אם ירצו, עוברי מקום ב14-18 מעלות צלזיוס להאט פיתוח.
2. Microinjection של רנ"א
הערה: בעוד שאנו מנצלים הזרקת RNA כאן, טכניקות אלה אינן מוגבלות לRNA, ו-DNA, חלבונים, חומצות גרעין או שונות למניפולציה גנטית יכול לשמש גם וכבר תארו בעבר 12.
- לפני הניסוי, RNAs עבור תיוג מבני cytoskeletal או אחרים arדואר משועתק מתבניות DNA לינארית באמצעות mMessage mMachine הערכה (Ambion). mRNAs דורש 'כובע ו3' 5 זנב polyadenylation לקדם תרגום ותמנע פגיעה בעוברים. pCS2 + הוא וקטור נפוץ בשימוש למטרה זו, וערכת השעתוק כוללת אנלוגית כובע במהלך תגובת הסינתזה. אנחנו מחדש להשעות mRNA תומלל בnuclease ללא DDH 2 0, בריכוז מניות בין 500 ל -2000 ng / μl, ואחרי האחסון מהיר ב-80 ° C. לפני הזריקה, לדלל RNA בDDH 2 0 לריכוז המתאים להזרקה. כפי שהזריק נפח קטן בלבד לעוברים, resuspending במאגר אינו הכרחי. ריכוז הזריקה הסופית שלנו הוא בדרך כלל 50-200 pg / nl, תלוי במבנה, ואנחנו בדרך כלל תהיינה להזריק עד 4 nl לעובר, אם כי מעבדות רבות באופן מסורתי להזריק עד 10 nl, אשר הוא כ 1% מהנפח הכולל של עובר. RNA יכול להיות רעיל במינונים גבוהים, והמנה כל סוגי עוברlly נע בין 10 pg לng 1, אם כי עד 5 ng יכול להיות נסבל תלוי בגן ובטהרה בפרט. עם זאת, ללוקליזציה חלבון הדמיה, הרמה הנמוכה ביותר האפשרית צריכה להיות מוזרקת למנוע לכלוכים על ביטוי. רנ"א לEB1-GFP בפרוטוקול זה משמש בסכום סופי של 250 עמ 'לעובר.
- הכן את מחטי הזרקה על ידי משייכת נימים עם מחט 9 חולץ, לקוטר קצה ~ 0.2 מיקרומטר. עם P-87 חולץ סאטר, אנו משתמשים בהגדרות הבאות: החום 644, משיכה 125, מהירות 70, זמן 250, אבל פרמטרים אלה משתנים בהתאם למכונה ויש סדרו לאחר שינוי הנימה (אנו משתמשים כיום 2.5 מ"מ נימת תיבה מרובעת שהיא 2.5 מ"מ רחב). תחת מיקרוסקופ, לשבור מחט קצה עם מלקחיים בזווית כדי ליצור צורת נוצה, כמו. ישנן שיטות אחרות לשבירה ומילוי מחטי הזרקה (לדוגמה 11,12), אבל אנחנו ממלאים את המחט עם רנ"א ידי הצבת ירידה קטנה (0.5 - μl 1) לקצה האחורי שלמחט. לmicroinjecting לעוברים, יש מספר מערכות הזרקה זמינות מסחרי, שתיים מן שכיח ביותר להיות פיק ההזרקה (מערכות רפואיות), וNanoject (דראמונד המדעי) (ראה עמוד 11 למידע נוסף). אנו משתמשים במערכות הרפואית PLI-100 Pico-Injector, שמשתמש בגז דחוס לתקופה מוגדרת של זמן דיגיטלי כדי לספק כרכי nanoliter עקביים. נפח הזרקה חייב להיות מכויל לכל micropipette החדש באמצעות מיקרומטר במה, וזמן הזרקה צריך להיות מותאם להשגת כמות רצויה של רנ"א המוזרק.
- המקום מופרה עובר ב1 - לשלב 4-תא לתוך צלחת פלסטיק המכילה Ficoll 5% בMMR 0.1x. מחזיק את העובר במקום עם מלקחיים, או הצבה בפלטפורמה מחזיקה (רשת פלסטיק, עם רשת ~ 1 מ"מ, דבקה בתחתית הצלחת בפלסטלינה או שעוות שיניים), להזריק לעצמה רצויה לסטומרים בעלי חיים (ראה שלב 2.1 לפרטים בדבר היקפי הזרקה). להפיץ בכמה locations ברחבי עובר, זריקה אחת לפחות לכל אחד מבעלי חי לסטומרים, לקבל התפלגות אחידה יותר (לדוגמה, לעובר בשלב 4-תא, אנחנו בדרך כלל להזריק 1-2 פעמים בכל blastomere, ואילו בשלב 2-תא עובר, אנחנו מזריקים 2-4 פעמים בכל blastomere). יתרון של מתנה עד שלב התא 2-4 הוא שאתה להבטיח את העובר החל לדבוק באופן נורמלי. עם זאת, אם הזמן הוא מהות, אתה יכול להתחיל בשלב 1-התא, עם הבדל קטן בתוצאה הסופית שאינן זקוקים יותר לעוברים להיות מוזרקים. עוברים בשלב בוגרים יותר יכולים לשמש גם כן, וזה שימושי במיוחד אם סוגי תאים ספציפיים ממוקדים להזרקה, אבל כמו שאנחנו מעדיפים בדרך כלל ביטוי רחב יותר, אנחנו מזריקים בעוברים צעירים כדי להפחית את הצורך בזריקות יותר רבות.
- העברת עוברים הזריקו לצלחת פלסטיק המכילה MMR 0.1x ולאפשר להם להתפתח עד שלב 20-23 13. דגירת עוברים ב14-22 ° C בהתאם spe הרצויעורך של פיתוח. (לביתור צינורות עצביים למחרת, השתמש ~ 22 ° C. עבור היום אחרי, השתמש ~ 14 ° C.)
3. Dissection צינור עצבי וציפוי
- קודם לביצוע הניתוחים, להכין את מנות תרבות 14. ראשית, coverslips מעייל עם מספיק פתרון של 200 מיקרוגרם / מ"ל פולי ליזין ב PBS לברכה על פני coverslip, של או מאטק או מנות תרבות Lab-Tek, ודגירה במשך שעה אחת (לחלופין, אפשר להשתמש בזכוכית יושבת coverslips רופף בצלחת פטרי, על מיקום מאוחר יותר בשקופיות זכוכית עבור הדמיה וimmunocytochemistry). לשאוב ולשטוף עם עודף של PBS 3 פעמים, ולתת להתייבש. אז מנות מעייל עם 10 מיקרוגרם / המ"ל laminin ב PBS (אנחנו בדרך כלל להשתמש ב500 μl לcoverslip, מספיק לברכה שמעל פני השטח) למשך שעה ב37 מעלות. לשאוב פתרון laminin ולשטוף 3 פעמים עם עודף של PBS, נזהר שלא לתת למשטחים laminin מצופים נחשפו לממשק האוויר. Replacהדואר PBS עם תרבות אמצעי תקשורת (צלצול של 50%, L-15 תקשורת 49%, סרום שור עוברי 1%, בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין וgentamycin, pH 7.4 ומסנן מעוקר). (מדיה רינגר, 115 המ"מ NaCl, KCl 2.5 מ"מ, 2 המ"מ CaCl 2, 10 mM pH Hepes 7.4, 0.5 המ"מ EDTA). בעוד הפרוטוקול שלנו משתמש באמצעי תקשורת זה, יש לציין כי מדובר במועשר תקשורת משותפת לתרבויות גנגליון רשתית מבוגרות Xenopus, שבו תאי העצב הפחיתו אנרגיה שמורה. תרבויות בעמוד שדרה צעירות לשרוד ולגדול ליותר מ 24 שעות בתקשורת של האצבעות טהורות ללא גורמי צמיחה נוספים, וזה אכן אחד היתרונות של שימוש במערכת זו. אופציונלי: תוספת NT3 וBDNF (לריכוזים סופיים של כל 25 ng / μl) לתקשורת התרבות להגדיל תולדת האקסון.
- בגלל השונות בביטוי של mRNA המוזרק, עוברים עשויים להפגין פסיפס של קרינה. קודם לביצוע נתיחות, עובר מסך לנוכחות של קרינה, כדי לזהות העוברים האלה שEXPציידת חלבון היתוך הניאון בצינור העצבי. הנח עוברי ניאון בשלב 20-23 לתוך קערת פלסטיק agarose מצופה מלאה בתקשורת של שטיינברג (58 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 0.44 mM Ca (NO 3) 2, 1.3 המ"מ 4 MgSO, 4.6 mM טריס, pH ל -7.8 אז autoclaved) 5. להכנת המנה agarose המצופה, מעייל התחתון של צלחת פלסטיק מומס עם 1% agarose ב0.1x MMR ובואו להתקשות. זה מספק משטח רך ולכן הניזק שאינו מתרחש למלקחיים העדינים ומחטי טונגסטן המשמשים במהלך שלבי נתיחה שלאחר מכן. הנתיחה של עוברים מעבר שלב 23 אפשרית, אבל זה מאתגר יותר כרקמות לדבוק באופן הדוק יותר זה לזה ולכן דורשות טיפול ארוך יותר עם collagenase.
- תחת ביתור, להסיר את קרום vitelline עם מלקחיים עדינים, ואז לבודד את החלק הגבה כולו של העובר, על ידי ביצוע סדרה של חתכים. כשאתה יושב ומלקחיים להחזיק את העובר במקום, השתמש שני לעשות חתך עלצד של העובר על מנת לחשוף את הפנים החלולים. לאחר מכן, השתמש בשני המלקחיים לצבוט לאורך הרקמה בין שתי מחציות גב וגחון של העובר, כך גזירת העובר בחצי לבודד את החלק הגבה מכיל את הצינור העצבי.
- הנח explant הגבה בצינור אפנדורף עם 2 מ"ג / המ"ל collagenase בתקשורת של טיינברג לדקות 15-20 במסובב, כדי לשחרר את הרקמות, ולאחר מכן explant הגבה פיפטה לתוך צלחת פלסטיק agarose מצופה עם הפתרון של טרי שטיינברג. לחלופין, explant ניתן להציב בצלחת הפטר שמכילה תמיסת collagenase במשך 15 דקות, שבו כל הנתיחה ואז אפשר תהיה פועל.
- בעזרת זוג מלקחיים, בעדינות לנתח את הצינור העצבי מהאפידרמיס הגבה וnotochord הגחון. חלק את קצה המלקחיים בין האפידרמיס והרקמה שמתחתיו ומושך באיטיות חזרה לאפידרמיס, וחושף את הצינור העצבי מתחת. לאחר מכן, השתמש 1 מלקחיים להחזיק את הרקמות ואחרות כדי להחליק את הקצה ביןצינור עצבי וnotochord. לבסוף, להשתמש במלקחיים כדי להסיר את somites בכל צד של הצינור.
- העברת הצינור העצבי למנת agarose מצופה מלאה בתרבית, כמתואר בשלב 3.1.
- אחרי האוסף של מספר צינורות עצביים, לחתוך אותם לחתיכות רבות (כ 20, אם כל הצינור מבודד) באמצעות מחטי טונגסטן חדד או מלקחיים, ולאחר מכן את החלקים בצלחת מנות התרבות מלאה במדיום (מוכן בשלב 3.1), והוא מתפשט את explants באופן שווה בשורות.
- לאחר ציפוי, אל תזוז את הכלים כי זה יפריע לתאים הקשורים. דגירת explants הצינור העצבי מצופה סביב 20-22 מעלות צלזיוס אנו נוהגים להשאיר את המנה של תאים על הספסל בטמפרטורת חדר למשך הלילה. אחד היתרונות של Xenopus laevis הנוירונים הוא שחממה מיוחדת לתרבית תאים המווסתת את רמות 2 או טמפרטורת CO אין צורך. Neurites קונוסים צמיחה יכולים להיות שנצפו וצולמו בטמפרטורת החדר 12-24 שעות לאחר ציפוי, למרות תולדה יכולה להיות מואצת עם התוספת של גורמי גדילה. באופן כללי, ביטוי של RNA או מוצר פלסמיד יגרום ביטוי משתנה בין תאים, ובכך ייתכן שיש מגוון של רמות ביטוי קרינה בין קונוסים צמיחה. אנו צפינו בביטוי RNA של חלבוני ניאון יישמרו גם 48 שעות לאחר ציפוי, למרות שזה תלוי במבנה המסוים.
4. נציג תוצאות
לאחר ביצוע הפרוטוקול, אשר סכם באיור 1A, explants הבריא, נתח-כהלכה ותרבית עצבי ישלח את האקסונים או neurites רבים בכל כיוון על laminin / מצע פולי ליזין, שמוצג בתרשים 1B. את הקונוסים הצמיחה בקצוות של אקסונים ניתן הדמיה על ידי או אופטיקה DIC, כפי שניתן לראות בתרשים 1C, לדינמיקת תנועתיות כוללת תמונה, או מיקרוסקופ פלואורסצנטי רזולוציה גבוהה לבחון את localization של חלבוני cytoskeletal מתויגים-fluorescently, למשל, EB1-GFP מוצג באיור 1D.
איור 1. סיכום של פרוטוקול ניסוי, ותוצאה צפויה. א) פרוטוקול זרימת תרשים. לראות את הסרט לפרטים בדבר נתיחה ביום 3. הצינור העצבי כולה צריך לחתוך לכ 20 חתיכות שווות בהגודל ומתפזר באופן שווה בשורות על coverslip. בקריקטורה זו, מספריים מתוארים לייצג חיתוך הרקמות עם מלקחיים עדינים. CG גונדוטרופין כוריוני B) תמונת דסק"ש של אקסונים או neurites צומחים מתוך explant (explant בפינה שמאלית עליונה). ג) תמונה גבוהה יותר הגדלה של חרוט צמיחה בקצה האקסון הולך וגדל. ד) תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של EB1-GFP בחרוט צמיחה. 10 מיקרומטר סרגל קנה מידה. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
explants העצבי Xenopus laevis לשלוח neurites בצורה מאוד חזקה על ידי 24 שעות לאחר הציפוי בlaminin / מצע פולי ליזין אם תנאים מתאימים. עם המצע הזה, קונוסים צמיחה הם מאוד ניע ויכולים להשיג אורכי האקסון של עד 1 מ"מ, המשתרעים לכל הכיוונים החיצוניים מexplant, למרות שאורכים אופייניים הם 100 מיקרומטר או יותר. אם neurites לא צומח, יש מספר מוגבל של סיבות לכך יהיה המקרה. אפשרות אחת היא שexplants העצבי לא עמד כראוי למנה. הקפד שלא לפגוע בקבצים על ידי הזזת הצלחת בטעות לאחר ציפוי. כמו כן, להבטיח כי מאכלי laminin ופולי ליזין מצופים נעשו בצורה נכונה עם כל ריאגנטים טריים. אפשרות נוספת לחוסר תולדה היא שתנאי תקשורת סלולרית התרבות לא יכולים להיות אופטימליים. בדוק את הפרוטוקול וחישובים כדי להבטיח שכל פתרוני התקשורת שגובשו בצורה נכונה. לבסוף, ייתכן כיעוברים שמהם explants התקבלו עשויים להיות לא בריאים, למרות שאם עוברים יכולים להתפתח לשלב הצינור העצבי, זה פחות להיות הבעיה. עם זאת, הדרך טובה ביותר היא לשמור על כמה עוברים שלמים ללא רבב בתרבית בMMR 0.1x יחד עם ניתוחים על מנת להבטיח כי המשך פיתוח מתרחש.
השלב הקריטי ביותר של פרוטוקול זה הוא נתיחת הצינור העצבית. בהשוואה לעובר מערכת מודל רב מייקר נתיחות מתות, זו היא טכניקה פשוטה יחסית ועוברי laevis Xenopus הם האחד היצורים הגדולים והסלחניים ביותר למנתחים. עם זאת, אם הניסוי הוא חדש לחלוטין לביצוע ניתוחים עובריים, שלב זה עשוי להימשך מספר שעות כדי לשכלל (פרוש הכי טוב לאורך 2-3 מפגשים). לאחר טיפול collagenase, חלק מעדיף להסיר הבא מזודרם, notochord, וsomites, ואחריו לאפידרמיס, ולכן תוצאה בצינור העצבי המבודד, בעוד שאחרים מעדיפים להתחיל עם הסרת האפידרמיס ולאחר מכןהפרדת רקמות אחרות מהצינור העצבי. מומלץ לנסות את שתי השיטות כדי לקבוע מה עובד הכי טוב עבור כל חוקר. כמו כן, להיזהר לא לשים יותר מדי עומס על הצינור העצבי במהלך בידודה. עדיף להסיר את הרקמות אחרות מהצינור העצבי, ולא להסיר את הצינור העצבי מהרקמות האחרות, כדי להפחית את המתח בתחתי ולמנוע ממנו מתפצל בטרם עת. לבסוף, אם רקמה שמסביבו חסידה מדי לצינור העצבי, לאחר מכן הנח את גב explant לפתרון collagenase במשך עוד כמה דקות. זה יהפוך את ההפרדה של הצינור העצבי מהרקמות הסובבות, במיוחד האפידרמיס, הרבה יותר הקלות. אורך טיפול collagenase תלוי בשלב של העובר, כעוברים מבוגרים דורשים טיפולים ארוכים יותר, עד 45 דקות או יותר בשלב 28 עוברים.
בנוסף לexplants צינור העצבי culturing, צינורות עצביים יכולים להיות גם ניתקו לפני הציפוי, ביורדוr לתמונת תאים בודדים. פרוטוקולים לשיטה זו מתוארים ב8, 15. יתרון של שיטה זו היא שהמורפולוגיה עצבית ואורך neurite ניתן לבחון, כגוף התא אינו מוסתר בתוך explant. יתר על כן, explants העצבי יכול גם להיות מתורבת על מצעים בדוגמת שונים. לדוגמה, "assay הפס" הדרכת קיו נעשה שימוש כדי להעריך את השינויים בדינמיקת קונוס צמיחה בתגובה למפגש גבולות מצע ב16 תרבות, 17. פרוטוקול מפורט להכנת דפוסי פסים של רמזים תואר 18. זה יכול לאפשר לניתוח דינמיקת cytoskeletal תוך חרוט הצמיחה עובר החלטות היגוי קיו הדרכה.
ישנם מספר יתרונות לשימוש בlaevis Xenopus לניסויי culturing explant עצביים. בהשוואה למערכות אחרות, culturing הנוירונים ראשוניים אלה הם יחסית קלים להשגה ודורש עלות נמוכה. כפי שהם יכולים להיות מתורבתים וצלמו בטמפרטורת חדר,חממות יקרות אינן נדרשות. עוברי Xenopus נגישים בקלות וניתן לקבלו בכמויות גדולות, הם מתפתחים במהירות, והם גדולים מספיק כדי לנתח עם הכשרה מינימאלית. לכן, מערכת זו מתאימה במיוחד למעבדות הוראה.
יתרון נוסף של שימוש בעוברי צפרדע הוא שהם נוחים למניפולציות של גנים, ה-mRNA, או חלבון רמות ביטוי, תלויים בצרכימים של ניסוי מסוים. לדוגמה, יתרון של שימוש בmRNA הוא שהריכוז ונפח הזרקה ניתן טיטרציה זהירות כדי לשלוט ברמת הביטוי שנוצרה, ואילו הזרקת DNA, לעומת זאת, מאפשר ליצירה של עוברים מהונדסים שבו ניתן לשלוט על ביטוי גנים אמרגן ספציפי המרחבי או זמני (למשל 19). לכן, שיטת explant עצבית זה יכול להיות מיושם על מצבים מרובים להבנת ההתנהגות והתפקוד של חלבונים, של אינטרס במהלך תולדת האקסוןודינמיקת קונוס צמיחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לבוב פרימן לאימונים וקירשנר המעבדה לשימוש במתקן הצפרדע, וחברי מעבדת Vactor אן על תמיכה. אנו מודים לניקון מרכז ההדמיה בבית הספר לרפואה ברווארד לקבלת סיוע במיקרוסקופ אור לתמונות באיור 1. עבודה זו מומנה על ידי הבא: NRSA NIH המלגה ומלגת K99-NIH לאל, מדע בסיסי שותפות מימון (https://bsp.med.harvard.edu/) לAEF, וNIH RO1 NS035909 לDVV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Labs | C-HCG-ON-10 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 | |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC, Inc. | 30-31-0 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P-1399 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| NT3 | Sigma-Aldrich | N1905 | |
| BDNF | Sigma-Aldrich | B3795 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).
- Lee, H. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 42, 913-926 (2004).
- Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones. Dev. Neurobiol. , (2011).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).
- Tanaka, E., Kirschner, M. W. The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries. J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).
- Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).
- Gomez, T. M. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females. J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).
- Lavery, D. L., Hoppler, S. Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus. Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Guirland, C. Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).
- Turney, S. G., Bridgman, P. C. Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity. Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).
- Weinl, C. On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5. Development. 130, 1635-1643 (2003).
- Knoll, B. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).
- Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos. Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).
