Neural Explantatkulturen aus<em> Xenopus laevis</em
Summary
Kultivierung neuronalen Explantaten aus seziert<em> Xenopus laevis</em> Embryonen, die fluoreszierende Fusionsproteine ausdrücken können zur Abbildung von Wachstum Kegel Zytoskelett Dynamik.
Abstract
Der komplexe Prozess der Axon Führung weitgehend durch das Wachstum Kegel, der die dynamische beweglichen Struktur an der Spitze des wachsenden Axon ist angetrieben. Während Axon Auswuchs, muss der Wachstumskegel integrieren mehrere Stromquellen Signalstoff Informationen zu modulieren ihre Zytoskelett um die Wachstumskegel vorwärts zu treiben und genau zu navigieren, um die spezifischen Ziele 1 finden. Wie diese Integration auf der Zytoskelett-Ebene auftritt, wird noch im Entstehen begriffen, und Prüfung der Zytoskelettprotein und Effektor Dynamik innerhalb der Wachstums Kegel kann die Aufklärung dieser Mechanismen ermöglichen. Xenopus laevis Wachstum Kegel groß genug (10-30 Mikrometer im Durchmesser), um hohe auflösenden Echtzeit-Bildgebung von Zytoskelett Dynamik (z. B. 2-4) und sind einfach zu isolieren und in einer Testumgebung manipulieren Vergleich zu anderen Wirbeltieren. Der Frosch ist ein klassisches Modellsystem für Entwicklungsneurobiologie Studien und wichtige frühe Einblicke in das Wachstum Kegel microtubule Dynamik wurde zunächst festgestellt, mit diesem System 5-7. Bei diesem Verfahren wird 8 sind Eier gesammelt und in vitro befruchtet, injiziert mit RNA kodierenden fluoreszenzmarkiertes Zytoskelett-Fusionsproteine oder andere Konstrukte, die Genexpression zu manipulieren, und konnte sich dann auf dem Neuralrohr Stadium entwickeln. Neural Rohre werden durch Dissektion isoliert und dann kultiviert werden, und das Wachstum Kegel auf entwachsen Neuriten abgebildet werden. In diesem Artikel beschreiben wir, wie Sie diese Methode, deren Ziel die Kultur Xenopus laevis Wachstum Kegel für nachfolgende Bild mit hoher Auflösung Analyse durchzuführen. Während wir das Beispiel + TIP Fusionsprotein EB1-GFP bereitzustellen, kann dieses Verfahren auf eine beliebige Anzahl von Proteinen, um deren Verhalten in der Wachstumskegel aufzuklären aufgebracht werden.
Protocol
Discussion
Xenopus laevis neuronalen Explantaten aus senden Neuriten in einem sehr robusten Weise durch 24 Stunden nach dem Ausstreichen auf dem Laminin / Poly-Lysin Substrat, wenn die Bedingungen angemessen sind. Mit diesem Substrat sind Wachstumskegeln höchst beweglich und kann Axon Längen von bis zu 1 mm zu erreichen, die sich in allen Richtungen nach außen aus dem Explantat, obwohl typische Längen 100 um oder mehr sind. Wenn Neuriten nicht wachsen, gibt es eine begrenzte Anzahl von Gründen der Fall sein. Eine Mö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Bob Freeman für die Ausbildung und die Kirschner-Labor für den Einsatz des Frosches Anlage danken, und die Mitglieder der Van Vactor Labor für die Unterstützung. Wir danken der Nikon Imaging Center an der Harvard Medical School für die Unterstützung bei der Lichtmikroskopie für die Bilder in Abbildung 1. Diese Arbeit wurde durch die folgende finanziert: NRSA NIH Gemeinschaft und NIH K99 Stipendium für LAL, Basic Science Partnership Finanzierung ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) zu AEF und NIH RO1 NS035909 DVV
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | C-HCG-ON-10 |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 |
| Ficoll | Sigma | F2637 |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 |
| Poly-l-lysine | Sigma | P-1399 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| NT3 | Sigma | N1905 |
| BDNF | Sigma | B3795 |
References
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