からの神経外植文化<em>アフリカツメガエル</em
Summary
解剖からの培養神経外植<em>アフリカツメガエル</em>蛍光融合タンパク質を発現する胚は成長円錐の細胞骨格ダイナミクスのイメージングを可能にします。
Abstract
軸索ガイダンスの複雑なプロセスは、大きく成長している軸索の先端の動的運動性構造体である成長円錐によって駆動される。軸索伸長時には、成長円錐が前方成長円錐を推進し、正確にその具体的な目標1を見つけるために移動するために、その細胞骨格を調節するためのガイダンスキュー複数の情報源を統合する必要があります。この統合は、細胞骨格のレベルで起こり、まだ浮上していると成長円錐内の細胞骨格タンパク質およびエフェクターダイナミクスの検査は、これらのメカニズムの解明を可能にすることができる。 アフリカツメガエルの成長円錐は高い実行するのに十分（直径10〜30ミクロン）を大きくする方法解像度の細胞骨格の動態のライブイメージング（ 例 2-4）と他の脊椎動物に比べてラボ環境で隔離し、操作しやすい。カエルは、発達神経生物学研究、成長円錐のマイクプリアンプに重要な初期の洞察力のための古典的なモデルシステムであるrotubuleのダイナミクスは、当初このシステム5-7を使用して発見された。この方法8では、卵は収集され、 試験管内で受精し、遺伝子発現を操作するためにコードするRNA蛍光標識された細胞骨格融合タンパク質または他の構造物を注入し、その後神経管ステージに開発することができました。神経管は解剖によって分離され、その後培養し、神経突起outgrowingに成長円錐が結像される。本稿では、この方法では、その後の高解像度画像解析のための文化アフリカツメガエルの成長円錐になっているゴールを実行する方法について説明します。我々は+ TIPの融合タンパク質EB1-GFPの例を提供していますが、この方法は成長円錐内に自分の行動を明らかにするために、タンパク質の任意の数に適用することができます。
Protocol
Discussion
条件が適切であるかどうかをアフリカツメガエルの神経外植片は、ラミニン/ポリリジン基板上にメッキ後24時間で、非常に堅牢な方法で神経突起を出す。典型的な長さが100μm以上であるが、この基板では、成長円錐の運動性は非常にあり、外植片から外側に向かって、すべての方向に延びる、1ミリメートルまでの軸索の長さを実現することができます。神経突起が出て成長していない…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、訓練とキルシュナー鋼ラボカエル施設の使用、およびサポートのためのバン·バクター·ラボのメンバーのボブ·フリーマンに感謝したいと思います。我々は、 図1の画像のための光学顕微鏡での支援のためにハーバード大学医学部ニコンイメージングセンターに感謝します。この作業は、次の要素によって賄われていた：NRSA NIHのフェローシップとLALにNIHのK99交わり、ベーシックサイエンス·パートナーシップ資金（ https://bsp.med.harvard.edu/ AEF）、およびNIHのRO1 NS035909をDVVへ
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | C-HCG-ON-10 |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 |
| Ficoll | Sigma | F2637 |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 |
| Poly-l-lysine | Sigma | P-1399 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| NT3 | Sigma | N1905 |
| BDNF | Sigma | B3795 |
References
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