Summary
解剖からの培養神経外植
Abstract
軸索ガイダンスの複雑なプロセスは、大きく成長している軸索の先端の動的運動性構造体である成長円錐によって駆動される。軸索伸長時には、成長円錐が前方成長円錐を推進し、正確にその具体的な目標1を見つけるために移動するために、その細胞骨格を調節するためのガイダンスキュー複数の情報源を統合する必要があります。この統合は、細胞骨格のレベルで起こり、まだ浮上していると成長円錐内の細胞骨格タンパク質およびエフェクターダイナミクスの検査は、これらのメカニズムの解明を可能にすることができる。 アフリカツメガエルの成長円錐は高い実行するのに十分（直径10〜30ミクロン）を大きくする方法解像度の細胞骨格の動態のライブイメージング（ 例 2-4）と他の脊椎動物に比べてラボ環境で隔離し、操作しやすい。カエルは、発達神経生物学研究、成長円錐のマイクプリアンプに重要な初期の洞察力のための古典的なモデルシステムであるrotubuleのダイナミクスは、当初このシステム5-7を使用して発見された。この方法8では、卵は収集され、 試験管内で受精し、遺伝子発現を操作するためにコードするRNA蛍光標識された細胞骨格融合タンパク質または他の構造物を注入し、その後神経管ステージに開発することができました。神経管は解剖によって分離され、その後培養し、神経突起outgrowingに成長円錐が結像される。本稿では、この方法では、その後の高解像度画像解析のための文化アフリカツメガエルの成長円錐になっているゴールを実行する方法について説明します。我々は+ TIPの融合タンパク質EB1-GFPの例を提供していますが、この方法は成長円錐内に自分の行動を明らかにするために、タンパク質の任意の数に適用することができます。
Protocol
注：詳細な情報と優れたプロトコルは、次の手順（ 例 8-12）に、より具体的に焦点を合わせることを他の場所で公開されているように、我々は、唯一の短い中で最初の2つのセクションの手順を説明します。さらに、生細胞培養におけるアフリカツメガエル脊髄ニューロンでの作業の一般的なプロトコルは、以前に詳細な方法の記事8に掲載されました。ここで我々は正常に実行し、ステップ3で、神経管の解剖とめっきプロトコルのトラブルシューティングを行うための十分な情報を提供していないが、我々は非常に、このビデオを補完するものとして、その記事を見直すことをお勧めします。
アフリカツメガエルの卵の1。 体外受精
- 採卵前絨毛性ゴナドトロピン（400単位/カエル）12-18時間を注射した女性のカエルの卵を入手してください。 1X Marcの修正リンガー溶液（MMR）（0.1MのNaCl、2.0mMのKClを、1.0mMのMgSO 4を 、2.0 mMのCaCl 2に卵を集める、5.0mMのHEPES、pH7.4の9）。
- 以前に9述べたように、みじん切りにした精巣を用いた in vitro で卵を受精させる。
- 少なくとも20分後、3〜5分間1X MMRの2％システイン（NaOHでpHを7.8に持って来た）で胚を培養することによって胚ゼリーコートを脱ぐ。 3：0.1X、MMR（88のNaCl、1mMのKCl、0.7 mMのCaCl 2、1mMののMgSO 4、2.5mMの飽和NaHCO 3、5mMのHEPES、pH7.8）にまたは0.1XのMBS（修正バルトの生理食塩水、1Xレシピ）で洗う-5回、注射するまで室温で胚を保つ、または必要に応じて、14から18で行わ胚°Cの開発を遅らせるため。
2。 RNAのマイクロインジェクション
注：私達はここにRNAの注入を利用しながら、これらの技術は、RNAに限られるものではなく、DNA、タンパク質、または遺伝子操作のために修飾された核酸を使用することもできますし、以前12に記載されている。
- 細胞骨格やその他の構造arを標識するための実験、RNAに先立ちeはmMessage mMachineキット（Ambion）を用いて線形化されたDNA鋳型から転写された。 mRNAは、翻訳を促進し、胚の劣化を防止するために、5 'キャップと3'ポリアデニル化尾を必要とします。 PCS2 +は、この目的のために一般的に使用されるベクトルであり、転写キットは合成反応時のキャップアナログを含む。我々は、ヌクレアーゼフリー蒸留H 2 0で転写されたmRNAを再度サスペンド、500と2000の間にストック濃度でng /μLの、-80℃で保管プロンプトに続いて注射の前に、注射に適した濃度になるように蒸留H 2 0中のRNAを希釈します。わずかなボリュームが胚に注入されるように、バッファに再懸濁する必要はありません。私たちの最終的な注入濃度は、構造に応じて、通常は50から200 PG / NLであり、多くのラボは伝統の総容積の約1％である10 NL、最大注入するものの、我々は通常、胚あたり4 NLまで注入します胚。 RNAは高用量で毒性があること、および胚属あたりの線量ができます最大5 ngには、特定の遺伝子や純度に応じて許容することができるものの、リリー、10 pgのから1 ngの範囲である。しかし、イメージングタンパク質局在化のために、可能な限り低いレベルが過剰発現のアーチファクトを回避するために注入する必要があります。このプロトコルにおけるEB1-GFPのRNAが胚あたり250 pgの最終的な量で使用されています。
- 〜0.2μmの先端径に、ニードルプラー9キャピラリー引いて、注射針を用意します。熱644、プル125、速度70、時間250、しかし、これらのパラメータはマシンによって異なり、フィラメントを（私たちが現在2.5ミリメートルを使用し変更した後に再調整する必要があります。サッター、P-87プラーにより、我々は次の設定を使用ワイド2.5ミリメートル）である四角い箱フィラメント。顕微鏡下で、羽のような形状を生成するために角度を鉗子で針の先端を破る。そこに注射針を破壊し、充填のための他の方法（例11,12の場合）ですが、我々は小さなドロップ（0.5から1μl）を配置することにより、RNAと針を埋めるのバックエンドに針。胚にマイクロインジェクションするために、ピコインジェクター（メディカルシステムズ）、最も一般的な市販の注入システムの数、2、およびNanoject（ドラモンド·サイエンティフィック社は、）（詳細については11を参照）があります。我々は、一貫性のあるナノリットルボリュームを配信するために、時間のデジタル設定された期間のために圧縮ガスを使用するメディカルシステムズPLI-100ピコインジェクタを使用しています。注入量は、ステージのマイクロメーターを用いて、それぞれの新しいマイクロピペットに校正する必要があり、注入時間は、注入RNAの所望量を達成するために調整されるべきである。
- 1で受精した胚を置き - 4細胞期に0.1X MMRの5％フィコールを含むプラスチック皿に。鉗子で固定胚を保持、または保持プラットフォーム（塑像用又は歯科用のワックスと皿の底に付着した約1mmのグリッドを持つプラスチックメッシュ、、）に置くこと、（ステップ2.1を参照してください動物の割球に目的のボリュームを注入）注入量に関する詳細については。いくつかのLOCで配布（例えば、4細胞期胚のために、我々は通常、2細胞期のに対し、各割球で1〜2回注射するより均一な分布を得るために、動物の球のそれぞれに胚全体の管理ポイント、少なくとも1つの注入、胚、当社）は、各割球の2-4倍を注入します。 2から4細胞期まで待つことの利点は、胚が正常に切断するために始めていることを確認することです。時間が本質である場合は、あなたは注入される必要がある多くの胚以外の最終結果にはほとんど差が、1細胞期に開始することができます。古い段階の胚も同様に使用すると、特定の種類の細胞が注射を対象にしているなら、これは特に有用であるが、我々は一般的に、より幅広い表現を好むように、我々はより多数の注射の必要性を低減するために若い胚に注入することができます。
- 0.1X MMRを含むプラスチックシャーレに注入された胚を転送し、それらがステージ20から23 13まで開発することができます。 °Cの希望のSPEに応じて14から22に胚を培養する開発のED。 （翌日神経管の解剖については、後の日のために〜22℃を使用し、〜14℃を使用してください）
3。神経管の解剖とめっき
- 前に解剖を行うには、14の培養皿を準備します。まず、コートマテックまたはLab-Tek製の培養皿のいずれかのカバーガラスの表面上にプールへは200μg/ PBS中ポリリジンの十分な解決策とカバーガラス、そして代わりに1時間（インキュベート、人は座っていたカバーガラスを使用することができますイメージングと免疫細胞化学のためのスライドガラス上の後に配置するため、シャーレ内の緩い）。吸引除去し、PBSで3回の過剰で洗浄し、乾燥させます。その後、10μgの/ PBS中ラミニンでコートの料理は37度で1時間（私たちは、通常十分な表面上のプールにカバースリップあたり500μlを、使用してください）。ラミニン液を吸引除去し、ラミニン被覆表面はエアインタフェースにさらされるものにならないように注意しながら、PBSの過剰で3回洗浄する。 REPLAC文化メディアと電子のPBS（50％リンゲル、49％L-15培地、1％ウシ胎児血清、プラス50μg/ mlのペニシリン/ストレプトマイシンおよびゲンタマイシン、pH7.4およびフィルター滅菌）。 （リンゲルメディア、115 mMのNaCl、2.5mMのKCl、2mMのCaCl 2、10mMのHepes緩衝液（pH7.4）、0.5mMのEDTA）。私たちのプロトコルはこのメディアを使用していますが、これは神経細胞がエネルギーを保有減少している年上のアフリカツメガエルの網膜神経節文化のための一般的な濃縮されたメディアであることに留意すべきである。ヤング脊髄文化が生き残り、さらなる成長因子なしで純粋なリンガーのメディア以上の24時間で成長し、これは実際にこのシステムを使用することの利点の一つであるでしょう。オプション：追加NT3とBDNFの軸索伸長を高めるために培地へ（25 ng /μLのそれぞれの最終濃度まで）。
- なぜなら注入mRNAの発現の変動により、胚は蛍光のモザイクを示すかもしれません。事前EXPそれら胚を識別するために解剖、蛍光の存在のためのスクリーンの胚を、実行することに神経管の蛍光融合タンパク質をRESS。 Steinberg社のメディア（58 mMのNaCl、0.67のKCl、0.44 mMののCa（NO 3）2、1.3mMのMgSO 4を 、4.6 mMトリス、次に7.8のpHでいっぱいアガロースコーティングされたプラスチック製の皿に20から23の段階で蛍光胚を置きオートクレーブ処理したもの）5。アガロースコーティングされた皿、0.1X、MMRとlet硬化の溶融1％アガロースとプラスチックの皿のコートボトムを作る。そのダメージはその後の解剖手順中に使用される微細鉗子及びタングステン針には発生しませんので、これはソフト面を提供する。ステージ23を超えた胚の郭清は可能ですが、組織がお互いにもっと密接に付着するので、コラゲナーゼによる長期の治療を必要とすることがより困難である。
- 解剖スコープ]で、細かい鉗子で卵黄膜を除去した後、切開のシリーズを作ることによって、胚全体の背の部分を分離します。 1鉗子が所定の位置に胚を保持している間に、上の切開を作るために第二を使用中空内部を露出する胚の側。次に、神経管を含む背の部分を分離するために、それによって半分に胚を切断、胚の背側と腹側半分の間の組織に沿って挟まないように両方の鉗子を使用しています。
- 組織を緩めるために、回転子上の15から20分間、Steinberg社のメディアで2 mg / mlのコラゲナーゼとエッペンドルフチューブに背側外植片を配置して、新鮮なSteinbergの溶液を用いてアガロースプラスチックでコーティングされた皿に背側外植片をピペット。あるいは、外植片は、全体の郭清はその後行うことができた15分間、コラゲナーゼ溶液を含むペトリ皿に配置することができます。
- ピンセットを使って、そっと背側と腹側表皮脊索から神経管を解剖。表皮と皮下組織の間に鉗子の先端をスライドさせて、徐々に神経管の下を明らかにし、表皮を引き戻す。その後、間の先端をスライドさせて組織を保持するために1つ鉗子を使用し、別の神経管や脊索。最後に、チューブの両側に体節を削除するには、鉗子を使用しています。
- ステップ3.1で説明したように、培地を充填したアガロースコーティングされた皿に神経管を転送します。
- いくつかの神経管を集めた後、広がって、媒体（ステップ3.1で調製した）を充填した後、尖ったタングステン針やピンセット、プレート培養皿のピースを使って多くの作品（約20、全体のチューブが分離されている場合）に切る行に均等に植片。
- これは取り付ける細胞を乱すため、めっき後、お皿を移動しないでください。 20から22の周りにメッキされた神経管の外植片をインキュベート℃に我々は通常、室温で一晩ベンチ上での細胞の皿を残す。 アフリカツメガエルの神経細胞の利点の一つは、CO 2レベルまたは温度を調節する細胞培養のための特別な保育器が必要とされていないことです。神経突起と成長円錐は室温12で観察し、画像化することができるめっき後-24時間、伸長が成長因子の添加により加速することができますが。一般的には、RNAまたはプラスミド産物の発現は、細胞間の変数式になるでしょう、そして、その結果、成長円錐の間の蛍光発現レベルの範囲があるかもしれません。我々は、これは特定の構築にもよるが、めっき後48時間を超えて存続するために蛍光タンパク質のRNA発現を観察した。
4。代表的な結果
図1Aに要約されているプロトコルを実行した後、健康な、正しく解剖し、培養した神経外植片は、 図1Bに示すラミニン/ポリリジン基板上に、あらゆる方向に多数の軸索または神経突起を発送させていただきます。軸索先端の成長円錐は、LOを調べるために画像全体の運動力学に、 図1Cに見られるように、DIC光学、、、または高分解能蛍光顕微鏡法のいずれかによって結像させることができる蛍光タグを付けた細胞骨格タンパク質のcalizationは、例えば、EB1-GFPは、 図1Dに示されている。
図1：実験プロトコルと期待される成果の概要。 a）プロトコルのフローチャート。 3日目に解剖に関する詳細については、ムービーを参照してください。全体の神経管は、約20同じ大きさの片に切断し、カバースリップ上の行に均等に分散させる必要があります。この漫画では、はさみは、微細鉗子で組織を切断表現するために描かれている。外植片から出て成長中の軸索や神経突起のCG絨毛性ゴナドトロピンB）はDIC像（左上隅に植）。成長軸索の先端の成長円錐のC）の高倍率像。成長円錐におけるEB1-GFPのD）の蛍光顕微鏡画像。スケールバーは10μmである。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
条件が適切であるかどうかをアフリカツメガエルの神経外植片は、ラミニン/ポリリジン基板上にメッキ後24時間で、非常に堅牢な方法で神経突起を出す。典型的な長さが100μm以上であるが、この基板では、成長円錐の運動性は非常にあり、外植片から外側に向かって、すべての方向に延びる、1ミリメートルまでの軸索の長さを実現することができます。神経突起が出て成長していない場合は、ケースのように、その理由の数は限られています。一つの可能性は、神経外植片が正しく皿に付着しなかったということです。誤っめっき後皿を移動させることにより、添付ファイルを途中で中断しないようにしてください。また、ラミニンおよびポリ - リジンコートディッシュはすべて新たに調製した試薬を用いて正しく行われたことを確認してください。伸長の不足のためにもう一つの可能性は、細胞培養培地の条件が最適でないかもしれないということです。すべてのメディアソリューションが正しく定式化されていることを保証するためにプロトコルと計算をダブルチェック。最後に、それは可能性がある胚神経管ステージに開発することができたら、これは問題になる可能性が低いものの、外植片が得られたから胚は、不健康かもしれません。ただし、その継続的な開発が行われるようにするために解剖とともに0.1X MMRで培養し、いくつかの全体そのまま胚を維持する最善の方法です。
このプロトコルの中で最も重要なステップは、神経管の解剖です。多くのモデル系の胚のマイクロ解剖に比べて、これは比較的単純な技術であり、 アフリカツメガエルの胚は、解剖のための最大かつ最も寛容な生物の一つです。実験者は、胚解剖を行うには完全に新しいものただし、この手順は（最高の2から3のセッションに広がる）完璧に数時間かかることがあります。コラゲナーゼ処理した後、いくつかは、その後他の人が表皮の除去で開始することを好むしつつ、孤立した神経管で、その結果、表皮、続いて次の中胚葉、脊索、体節とを除去することを好むと神経管から他の組織を分離する。これは、各研究者のための最高の作品を決定するために、両方の方法を試してみることをお勧めします。また、その単離中に神経管にあまり負担をかけないように注意してください。これは、チューブの張力を低減し、途中で断片化を防ぐために、神経管から他の組織を取り除くのではなく、他の組織から神経管を除去することをお勧めします。周囲組織が神経管に付着しすぎている場合最後に、その後さらに数分間コラゲナーゼ溶液に植バックを配置します。これは、はるかに簡単に、特に周囲の組織、表皮から神経管の分離を行います。年上の胚は、最大28段階の胚では45分以上に、長く治療を必要とするため、コラゲナーゼ処理の長さは、胚の段階に依存します。
培養神経管の外植片に加えて、神経管もオードで、プレーティング前に解離させることができる画像単一細胞からR。このメソッドのプロトコルは8日、15日に記載されている。この方法の利点は、神経形態であり、細胞本体は外植片の内側に隠されていないように神経突起の長さを調べることができます。また、神経外植片はまた、様々なパターン化された基板上に培養することができる。例えば、指導の手がかり"ストライプアッセイは"文化16、17に基板の境界に遭遇に対応して成長円錐のダイナミクスの変化を評価するために使用されてきました。手がかりの縞模様を調製するための詳細なプロトコールは、18に記載されている。成長円錐は、ガイダンスキューステアリングの決定を受けながら、これは、細胞骨格の動態の解析を可能にすることができる。
神経外植片の培養実験のためにアフリカツメガエルを使用する利点はいくつかあります。他のシステムと比較すると、これらの培養一次ニューロンは、低コストを取得し、必要とすることは比較的容易です。それらは、室温で培養し、画像化することができるように高価なインキュベーターは、アフリカツメガエル胚は簡単にアクセスできます。必要とされず、大量に得ることができます、彼らは急速に発展、そして、彼らは最小限のトレーニングで解剖するのに十分な大きさである。したがって、このシステムは、特に教育研究室に適しています。
カエル胚を使用してのもう一つの利点は、彼らが特定の実験のニーズに応じて遺伝子、mRNA、またはタンパク質の発現レベルの操作に適しているということです。例えば、mRNAを使用することの利点は、濃度、注入量を慎重に他の一方で、DNAを注入しながら、得られた発現レベルを制御するために滴定することができるということである遺伝子発現によって制御することができるトランスジェニック胚の作成が可能空間的または時間的な特異的プロモーター（ 例えば 19）。したがって、この神経植法は軸索伸長中にタンパク質の関心の動作と機能を理解するためのさまざまな状況に適用することができますと成長円錐のダイナミクス。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、訓練とキルシュナー鋼ラボカエル施設の使用、およびサポートのためのバン·バクター·ラボのメンバーのボブ·フリーマンに感謝したいと思います。我々は、 図1の画像のための光学顕微鏡での支援のためにハーバード大学医学部ニコンイメージングセンターに感謝します。この作業は、次の要素によって賄われていた：NRSA NIHのフェローシップとLALにNIHのK99交わり、ベーシックサイエンス·パートナーシップ資金（ https://bsp.med.harvard.edu/ AEF）、およびNIHのRO1 NS035909をDVVへ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Labs | C-HCG-ON-10 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 | |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC, Inc. | 30-31-0 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P-1399 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| NT3 | Sigma-Aldrich | N1905 | |
| BDNF | Sigma-Aldrich | B3795 |
References
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