Summary
Espianti coltura neurali di sezionato
Abstract
Il complesso processo di orientamento assone è dovuto in gran parte il cono di crescita, che è la struttura dinamica mobili sulla punta l'assone. Durante la conseguenza dell'assone, il cono di crescita deve integrare diverse fonti di informazioni di guida spunto per modulare la sua citoscheletro, al fine di spingere il cono di crescita in avanti e passare a trovare con precisione gli obiettivi specifici 1. Come tale integrazione avviene a livello citoscheletrico è ancora emergente, e l'esame di proteine del citoscheletro e dinamiche effettrici all'interno del cono di crescita può consentire la delucidazione di questi meccanismi. Xenopus laevis coni di crescita sono abbastanza grandi (10-30 micron di diametro) per eseguire elevata -risoluzione di immagini in tempo reale della dinamica del citoscheletro (ad esempio 2-4) e sono facili da isolare e manipolare in un laboratorio rispetto ad altri vertebrati. La rana è un sistema modello classico per gli studi di sviluppo, neurobiologia e importanti intuizioni iniziali in mic cono di crescitadinamiche rotubule sono stati inizialmente trovati con questo sistema 5-7. In questo metodo 8, uova vengono raccolte e fecondati in vitro, iniettato con RNA codifica etichetta fluorescente proteine di fusione o altri costrutti citoscheletro di manipolare l'espressione genica, e poi lasciata sviluppare alla fase tubo neurale. Tubi neurali sono isolati da dissezione e poi sono messi in coltura, e coni di crescita di neuriti che diventano troppo grandi vengono esposte. In questo articolo, si descrive come eseguire questo metodo, il cui obiettivo è quello di cultura di Xenopus laevis coni di crescita per la successiva analisi ad alta risoluzione delle immagini. Mentre forniamo l'esempio della proteina di fusione TIP + EB1-GFP, questo metodo può essere applicato a qualsiasi numero di proteine di chiarire loro comportamenti nel cono di crescita.
Protocol
Nota: descrivere la procedura descritta nelle prime due sezioni solo in breve, come protocolli eccellenti con le informazioni dettagliate sono state pubblicate altrove, che si concentrano in particolare su questi passaggi (ad esempio, 8-12). Inoltre, il protocollo generale di lavorare con i neuroni spinali di Xenopus in colture cellulari in tempo reale è stato precedentemente pubblicato in un articolo dettagliato metodi 8. Consigliamo vivamente di rivedere tale articolo come un complemento a questo video, anche se qui ci vengono fornite informazioni sufficienti per eseguire correttamente e risolvere i problemi la dissezione del tubo neurale e il protocollo placcatura al punto 3.
1. Fecondazione in vitro di uova di Xenopus
- Ottenere le uova di rane femmine che sono stati iniettati con gonadotropina corionica (400 unità / rana) 12-18 ore prima della raccolta delle uova. Raccogliere le uova in una soluzione di Ringer modificato 1X Marc (MMR) (0,1 M di NaCl, 2.0 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 2.0 mM CaCl 2, 5,0 mM di HEPES, pH 7,4) 9.
- Fecondare le uova in vitro con testicoli tritate, come descritto in precedenza 9.
- Dopo almeno 20 minuti, rimuovere embrione coat gelatina incubando embrioni in 2% di cisteina in 1X MMR (portata a pH 7,8 con NaOH) per 3-5 min. Lavare con 0,1 X. MMR (o 0.1X MBS (Modified Saline Barth, 1X ricetta: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO4, 2.5 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, pH 7,8)) 3 -5 ore e mantengono embrioni a temperatura ambiente fino iniezioni, o se desiderato, embrioni posti a 14-18 ° C per rallentare lo sviluppo.
2. Microiniezione di RNA
Nota: mentre si utilizza iniezione di RNA qui, queste tecniche non sono limitati a RNA e DNA, proteine, acidi nucleici o modificati per la manipolazione genetica può essere utilizzata e sono stati descritti in precedenza 12.
- Prima di sperimentare, RNA per l'etichettatura delle strutture del citoscheletro o altre are trascritto da modelli di DNA linearizzato utilizzando la mMessage mmachine kit (Ambion). mRNA richiedono un 5 'cappello e una 3' di coda di poliadenilazione sulla promozione della traduzione e prevenire il degrado negli embrioni. pCS2 + è un vettore comunemente utilizzato per questo scopo, e il kit di trascrizione comprende un analogo tappo durante la reazione di sintesi. Abbiamo risospendere mRNA trascritto in nucleasi-free DDH 2 0, in concentrazione magazzino tra 500 e 2.000 ng / pl, seguita dalla conservazione pronta a -80 ° C. Prima dell'iniezione, diluire RNA in DDH 2 0 alla concentrazione appropriata per l'iniezione. Come solo un piccolo volume verrà iniettato in embrioni, risospendere in tampone non è necessario. La concentrazione di iniezione finale è tipicamente 50-200 pg / nl, a seconda del costrutto, e di solito si iniettare fino a 4 nl per embrione, sebbene molti laboratori tradizionalmente iniettare fino a 10 nl, che è circa 1% del volume totale di un embrione. RNA può essere tossico a dosi elevate, e la dose per generi embrionilly varia da 10 pg a 1 ng, anche fino a 5 ng può essere tollerata a seconda del particolare gene e purezza. Tuttavia, per la localizzazione di imaging proteine, il livello più basso possibile, deve essere iniettato per evitare sovra-espressione artefatti. RNA per EB1-GFP in questo protocollo viene utilizzato in quantità finale di 250 pg per embrione.
- Preparare aghi da iniezione tirando capillare con un estrattore ago 9, ad un diametro di punta di ~ 0,2 micron. Con un P-87 Sutter estrattore, utilizziamo le seguenti impostazioni: calore 644, tiro 125, velocità 70, ora 250, ma questi parametri variano a seconda della macchina e deve essere regolato dopo aver cambiato il filamento (attualmente si sta adoperando da 2,5 mm filamento casella quadrata che è di 2,5 mm di larghezza). Sotto un microscopio, rompere la punta dell'ago con una pinza ad un angolo di generare una penna, come forma. Esistono altri metodi per rompere e riempimento aghi per iniezione (per esempio 11,12), ma riempire l'ago con RNA ponendo una piccola goccia (0,5 - 1 pl) all'estremità posteriore delago. Per microinjecting in embrioni, ci sono una serie di sistemi di iniezione disponibili in commercio, due dei più comuni è il Pico-iniettore (Medical Systems), e il Nanoject (Drummond scientifico) (vedi 11 per ulteriori informazioni). Usiamo il Medical Systems PLI-100 Pico-iniettore, che utilizza gas compresso digitalmente per un periodo di tempo stabilito per fornire volumi nanolitri coerenti. Volume di iniezione deve essere calibrato per ogni micropipetta nuovo utilizzando un micrometro, e tempo di iniezione deve essere regolata per ottenere quantità desiderata di RNA iniettati.
- Luogo embrioni fecondati in 1 - a 4 cellule in un piatto di plastica contenente il 5% Ficoll in MMR 0,1 X.. Tenendo l'embrione in posizione con le pinze, o l'immissione in possesso di una piattaforma (una maglia di plastica, con una griglia di 1 mm ~, ha aderito al fondo del piatto con la plastilina o cera dentale), iniettare volume desiderato in blastomeri animali (vedi passo 2.1 per i dettagli relativi volumi di iniezione). Distribuire in diversi loczioni tutta embrione, almeno una iniezione in ciascuno dei blastomeri animali, per ottenere una distribuzione più uniforme (per esempio, per un 4-cellula embrionale fase, si iniettano tipicamente 1-2 volte in ogni blastomero, mentre in una cella 2-stadio embrione, si iniettano 2-4 volte in ogni blastomero). Un vantaggio di aspettare fino alla fase 2-4 cellulare è che si assicura l'embrione ha cominciato a fendere normalmente. Tuttavia, se il tempo è l'essenza, si può partire dalla fase 1-cella, con una piccola differenza nel risultato finale diverso da quello che hanno bisogno di più embrioni da iniettare. Embrioni allo stadio anziani può essere utilizzato come bene, e ciò è particolarmente utile se specifici tipi cellulari sono mirati per iniezione, ma come si preferiscono generalmente un'espressione più ampia, si inietta in giovani embrioni per ridurre la necessità di iniezioni più numerosi.
- Trasferimento embrioni iniettati in un piatto di plastica contenente 0,1 X. MMR e permettere loro di sviluppare sino alla fase 20-23 13. Embrioni incubare a 14 a 22 ° C a seconda spe desideratoed di sviluppo. (Per sezionare i tubi neurali il giorno seguente, utilizzare ~ 22 ° C. Per il giorno dopo, usare ~ 14 ° C)
3. Tubo neurale e Dissezione Placcatura
- Prima di eseguire le dissezioni, preparare i piatti della cultura 14. Primo, coprioggetti cappotto con soluzione abbastanza di 200 ug / ml di poli-lisina in PBS alla piscina sulla superficie del vetrino, di una o Mattek Lab-Tek piastre di coltura, e incubare per un'ora (in alternativa, si potrebbe usare coprioggetto seduta sciolto in una capsula di Petri, per il posizionamento in seguito su vetrini per l'imaging e immunocitochimica). Aspirare e lavare con un eccesso di PBS 3 volte, e lasciare asciugare. Poi i piatti cappotto con 10 mg / ml di laminina in PBS (di solito uso 500 microlitri per coprioggetto, basta mettere in comune su tutta la superficie) per un'ora a 37 gradi. Aspirare soluzione laminina e lavare 3 volte con un eccesso di PBS, facendo attenzione a non far laminina rivestite superfici esposte diventano all'interfaccia aria. Sostituendoe mezzi di coltura con PBS (50% di Ringer, 49% di L-15 supporti, 1% siero fetale bovino, oltre 50 ug / ml di penicillina / streptomicina, gentamicina e pH 7,4 e sterilizzato per filtrazione). (Ringer media, 115 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 10 mM Hepes pH 7.4, 0.5 mM EDTA). Mentre il nostro protocollo utilizza questo supporto, si deve rilevare che si tratta di un supporto comune più ricco per le vecchie culture gangliari della retina di Xenopus, in cui i neuroni hanno ridotto di energia riservati. Giovani culture del midollo spinale si sopravvivere e crescere per più di 24 ore in media Ringers puro, senza altri fattori di crescita, e questo è davvero uno dei vantaggi di utilizzare questo sistema. Opzionale: aggiungere NT3 e BDNF (a concentrazioni finali di 25 ng / ul ciascuno) per terreni di coltura per aumentare la conseguenza assone.
- A causa della variabilità nell'espressione di mRNA iniettato, embrioni possono esibire un mosaico di fluorescenza. Prima di eseguire dissezioni, embrioni di schermo per la presenza di fluorescenza, per identificare questi embrioni expremere la proteina fluorescente fusione nel tubo neurale. Posizionare embrioni allo stadio fluorescenti 20-23 in un piatto di agarosio rivestita di plastica pieno di supporti Steinberg (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca (NO 3) 2, 1,3 mM MgSO 4, 4,6 mM Tris, pH 7,8 per poi autoclavato) 5. Per rendere l'agarosio rivestita piatto, fondo mano di piatto di plastica con il fuso 1% agarosio a 0,1 X. MMR e lasciare indurire. Ciò fornisce una superficie morbida in modo che non si verifichi danni ai pinza sottile e aghi tungsteno utilizzati durante le fasi successive di dissezione. Dissezione di embrioni di là stadio 23 è possibile, ma è più difficile da tessuti aderiscono più strettamente tra loro e quindi richiedono un trattamento più lungo con collagenasi.
- Sotto un ambito dissezione, rimuovere la membrana vitellina con pinza sottile, e quindi isolare l'intera porzione dorsale dell'embrione, facendo una serie di incisioni. Mentre uno pinza tenere l'embrione in posizione, utilizzare il secondo per fare un'incisione sullalato dell'embrione per esporre l'interno cavo. Quindi, utilizzare entrambe le pinze per stringere lungo il tessuto tra le due metà dorsale e ventrale dell'embrione, quindi riducendo l'embrione a metà per isolare la parte dorsale che contiene il tubo neurale.
- Posizionare l'espianto dorsale in una provetta Eppendorf con 2 mg / ml di collagenasi in mezzi Steinberg per 15-20 minuti su un agitatore, per allentare i tessuti, e quindi espianto pipetta dorsale in una plastica agarosio rivestita piatto con soluzione fresca Steinberg. In alternativa, l'espianto può essere introdotto in una piastra Petri contenente la soluzione di collagenasi per 15 minuti, in cui la dissezione intera potrebbe quindi essere effettuata.
- Usando un paio di pinze, delicatamente sezionare il tubo neurale dall'epidermide dorsale e ventrale della notocorda. Far scorrere la punta della pinza tra l'epidermide e il tessuto sottostante e lentamente tirare indietro l'epidermide, rivelando il tubo neurale sottostante. Quindi, utilizzare uno pinze per tenere il tessuto ed un altro per far scorrere la punta tra l'tubo neurale e notocorda. Infine, utilizzare pinze per rimuovere i somiti su entrambi i lati del tubo.
- Trasferire il tubo neurale ad un agarosio rivestita piatto riempito con terreni di coltura, come descritto al punto 3.1.
- Dopo la raccolta di diversi tubi neurali, tagliarli a pezzi numerosi (circa 20, se il tubo è isolato intero) utilizzando aghi di tungsteno affilati o pinze, e poi piastra i pezzi in capsule di Petri riempite con terreno (preparato secondo il punto 3.1), diffondendo gli espianti in modo uniforme in file.
- Dopo la placcatura, non spostare i piatti, perché questo avrebbe disturbato le cellule di fissaggio. Incubare gli espianti placcati del tubo neurale intorno a 20-22 ° C. Noi di solito lasciano il piatto di cellule in panchina a temperatura ambiente per una notte. Uno dei vantaggi di Xenopus laevis neuroni è che un incubatore per colture cellulari speciale che regola i livelli di CO 2 o di temperatura non è necessaria. Neuriti e coni di crescita può essere osservato e ripreso a temperatura ambiente 12-24 Ore dopo la placcatura, sebbene conseguenza può essere accelerata con l'aggiunta di fattori di crescita. In generale, l'espressione di un RNA o prodotto plasmide comporterà espressione variabile tra le cellule, e quindi non vi può essere una serie di livelli di espressione di fluorescenza tra i coni di crescita. Abbiamo osservato l'espressione di RNA di proteine fluorescenti a persistere oltre 48 ore dopo la placcatura, anche se questo dipende dalla particolare costrutto.
4. Risultati rappresentativi
Dopo aver seguito il protocollo, che è riassunta in Figura 1A, sano, corretto espianti-sezionati e coltivate neurali invierà numerosi assoni o neuriti in ogni direzione su laminina / poli-lisina substrato, mostrato nella Figura 1B. I coni di crescita alle estremità degli assoni possono essere esposte da entrambi DIC ottica, come si vede in Figura 1C, alle dinamiche della motilità immagine complessiva, o ad alta risoluzione microscopia a fluorescenza per esaminare la localizzazione di fluorescenza etichetta proteine citoscheletriche, per esempio, EB1-GFP è mostrato in figura 1D.
Figura 1. Sintesi del protocollo sperimentale e risultati attesi. A) Protocollo di diagramma di flusso. Guarda il filmato per i dettagli riguardanti la dissezione al giorno 3. Il tubo neurale intera deve essere tagliato in circa 20 pezzi della stessa dimensione e la diffusione in modo omogeneo in fila sul coprioggetto. In questo cartone animato, le forbici sono raffigurati per rappresentare il taglio del tessuto con una pinza sottile. CG gonadotropina corionica B) immagine DIC degli assoni o neuriti che crescono di espianto (espianto in alto a sinistra). C) ingrandimenti superiore del cono di crescita a punta di un assone. D) l'immagine di microscopia a fluorescenza EB1-GFP in cono di crescita. Scala bar 10 micron. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Xenopus laevis espianti neurali inviare neuriti in modo molto robusto per 24 ore dopo placcatura sul laminina / poly-lisina substrato se le condizioni sono appropriate. Con questo substrato, coni di crescita sono altamente mobili e possono raggiungere lunghezze assone fino a 1 mm, si estende in tutte le direzioni verso l'esterno dal espianto, sebbene lunghezze tipiche sono 100 um o più. Se neuriti non crescono fuori, ci sono un numero limitato di ragioni per questo essere il caso. Una possibilità è che gli espianti neurali non correttamente aderire al piatto. Assicurarsi di non disturbare gli allegati accidentalmente spostando il piatto dopo placcatura. Inoltre, assicurarsi che i piatti laminina-e poli-lisina rivestite sono state fatte correttamente con tutti preparati al momento reagenti. Un'altra possibilità per mancanza di conseguenza è che le condizioni di coltura di cellule di media può non essere ottimale. Doppio controllo protocollo e calcoli per garantire che tutte le soluzioni multimediali sono stati correttamente formulati. Infine, è possibile cheembrioni da cui sono stati ottenuti gli espianti potrebbe essere malsano, anche se in grado di sviluppare gli embrioni allo stadio tubo neurale, è meno probabile che sia il problema. Tuttavia, è meglio tenere alcuni embrioni interi intatti coltivate in 0,1 X. MMR con dissezioni per garantire che lo sviluppo continua verifica.
La fase più critica di questo protocollo è la dissezione del tubo neurale. Rispetto a molti embrione sistema modello micro-dissezione, questa è una tecnica relativamente semplice e Xenopus laevis embrioni sono uno degli organismi più grandi e perdona per dissezione. Tuttavia, se lo sperimentatore è completamente nuovo di eseguire dissezioni embrionali, questo passaggio potrebbe richiedere diverse ore per perfezionare (meglio distribuite su 2-3 sedute). Dopo il trattamento con collagenasi, alcuni preferiscono rimuovere successivo mesoderma, notocorda e somiti, seguita dalla epidermide, risultando così in tubo isolato neurale, mentre altri preferiscono iniziare con rimozione dell'epidermide e quindiseparando gli altri tessuti del tubo neurale. Si consiglia di provare entrambi i metodi per determinare quale funziona meglio per ogni ricercatore. Inoltre, fare attenzione a non mettere troppa tensione sul tubo neurale durante il suo isolamento. È meglio rimuovere gli altri tessuti del tubo neurale, piuttosto che rimuovere il tubo neurale dagli altri tessuti, in modo da ridurre la tensione sul tubo e impedirgli di frammentazione prematuramente. Infine, se i tessuti circostanti sono troppo aderente al tubo neurale, quindi posizionare la parte posteriore espianto nella soluzione collagenasi per diversi minuti. Questo renderà la separazione del tubo neurale dai tessuti circostanti, specialmente l'epidermide, molto più facile. La durata del trattamento con collagenasi dipende dallo stadio dell'embrione, come vecchi embrioni richiedono trattamenti più lunghi, fino a 45 minuti o più per la fase 28 embrioni.
Oltre a espianti tubo neurale coltura, tubi neurali potrebbe anche essere dissociato prima placcatura, in order per singole celle di immagine. Protocolli per questo metodo sono descritti in 8, 15. Un vantaggio di questo metodo è che la morfologia neuronale e la lunghezza dei neuriti può essere esaminato, come il corpo cellulare non è oscurata all'interno espianto. Inoltre, espianti neurali possono essere coltivate su substrati vari motivi geometrici. Ad esempio, la cue "saggio striscia" guida è stato utilizzato per valutare i cambiamenti nella dinamica del cono di crescita in risposta a incontrare confini substrato di cultura 16, 17. Un protocollo dettagliato per la preparazione di fantasie a righe di spunti è stato descritto 18. Questo può consentire l'analisi delle dinamiche citoscheletriche mentre il cono di crescita subisce orientamento decisioni sterzo cue.
Ci sono una serie di vantaggi di utilizzare Xenopus laevis per esperimenti di coltura neurali espianti. Rispetto ad altri sistemi, coltura di tali neuroni primari sono relativamente facili da ottenere e richiedono basso costo. In quanto possono essere coltivate e ripreso a temperatura ambiente,incubatori costose non sono necessari. embrioni di Xenopus sono facilmente accessibili e possono essere ottenuti in grandi quantità, si sviluppano rapidamente, e sono abbastanza grandi da sezionare con una formazione minima. Così, questo sistema è particolarmente adatto per laboratori didattici.
Un altro vantaggio dell'utilizzo di embrioni di rana è che sono suscettibili di manipolazioni di livelli di espressione genica, mRNA, o proteine, a seconda delle esigenze di un particolare esperimento. Ad esempio, un vantaggio di utilizzare mRNA è che la concentrazione e volume di iniezione può essere titolata attentamente per controllare il livello di espressione risultante, mentre iniettando DNA, invece, consente la creazione di embrioni transgenici in cui l'espressione del gene può essere controllato spaziale o temporale promotore specifico (ad esempio 19). Quindi, questo metodo espianto neurale può essere applicato a molteplici situazioni per comprendere il comportamento e funzione delle proteine d'interesse durante outgrowth dell'assonee la crescita cono dinamica.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Bob Freeman per la formazione e il laboratorio Kirschner per l'utilizzo della struttura rana, ed i membri del laboratorio di Víctor Van per il supporto. Ringraziamo la Nikon Imaging Center della Harvard Medical School per l'assistenza con microscopio ottico per le immagini in Figura 1. Questo lavoro è stato finanziato dal seguente: NRSA NIH comunione e NIH K99 borsa di studio per LAL, Basic Science Partnership finanziamento ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) a AEF, e NIH RO1 NS035909 al DVV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Labs | C-HCG-ON-10 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 | |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC, Inc. | 30-31-0 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P-1399 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| NT3 | Sigma-Aldrich | N1905 | |
| BDNF | Sigma-Aldrich | B3795 |
References
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