Dan Sinir Eksplantasyon Kültürleri<em> Xenopus laevis</em
Summary
Disseke gelen ekimi nöral eksplantlar<em> Xenopus laevis</em> Floresan füzyon proteinleri ifade embriyoların büyüme konisinin sitoskeletal dinamiklerinin görüntüleme için izin verir.
Abstract
Akson rehberlik karmaşık bir süreç büyük ölçüde büyüyen akson ucundaki dinamik hareketli yapısı büyüme konisi tarafından tahrik edilir. Akson akıbet sırasında, büyüme konisi ileri büyüme konisinin itmek ve doğru kendi hedeflerini 1 bulmak için gitmek için kendi iskeleti modüle rehberlik ipucu çeşitli bilgi kaynaklarından entegre olmalıdır. Bu entegrasyon sitoskeletal düzeyinde oluşur nasıl hala ortaya çıkıyor, ve hücre iskelet protein ve büyüme konisi içinde efektör dinamiklerin incelenmesi bu mekanizmaların aydınlatılması izin verebilirsiniz. Xenopus laevis büyüme konileri vardır (çapı 10-30 mikron) yeterince büyük yüksek gerçekleştirmek için çözünürlüklü sitoskeletal dinamikleri canlı görüntüleme (örneğin 2-4) ve diğer omurgalılar ile karşılaştırıldığında bir laboratuar ortamında yalıtmak ve işlemek için kolaydır. Kurbağa büyüme konisinin Mikrofona gelişimsel nörobiyoloji çalışmaları ve önemli erken anlayışlar için bir klasik model sistemirotubule dinamikleri başlangıçta bu sistemi 5-7 kullanılarak bulunmuştur. Bu yöntem, 8, yumurta toplanır ve in vitro olarak fertilize, gen ekspresyonu işlemek için RNA kodlama floresan etiketlendi sitoskeletal füzyon proteinleri ya da başka oluşumlar ile enjekte edilir ve daha sonra nöral tüp aşama geliştirmek için izin verildi. Nöral tüpler disseksiyon ile izole edilir ve sonra kültive edilir, ve fazla uzama neurites üzerinde büyüme koni görüntülü. Bu yazıda, bu yöntem, sonradan yüksek çözünürlüklü görüntü analizi için kültür Xenopus laevis büyüme konileri için hangi hedefi gerçekleştirmek için nasıl açıklar. Biz + TIP füzyon proteini EB1-GFP örnek sağlamakla birlikte, bu yöntem, büyüme koni içinde davranışları aydınlatmak için protein herhangi bir numaraya uygulanabilir.
Protocol
Discussion
Eğer şartlar uygun olursa Xenopus laevis nöral eksplantlar laminin / poli-lisin substrat üzerindeki kaplama sonra 24 saat ile çok sağlam bir şekilde dışarı neurites gönderebilirsiniz. Tipik bir uzunluk 100 um ya da daha fazla olmasına rağmen, bu alt-tabaka ile, büyüme koni son derece öldürücüdür ve eksplant dışa doğru her yönde uzanan, 1 mm 'ye kadar akson uzunlukları elde edilebilir. Neurites dışarı büyümek yoksa, durum bu nedenleri sınırlı sayıda vardır. Bir olasılık n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar kurbağa tesisin kullanımı için eğitim ve Kirschner laboratuar Bob Freeman teşekkür ve destek için Van Vactor laboratuar üyeleri olacaktır. Biz Şekil 1'de görüntüler için ışık mikroskobu ile yardım için Harvard Tıp Okulu'nda Nikon Görüntüleme Merkezi ederim. Bu çalışma aşağıdaki tarafından finanse edildi: NRSA NIH dostluk ve LAL NIH K99 dostluk, Temel Bilim Ortaklığı finansman ( https://bsp.med.harvard.edu/ to AEF) ve NIH RO1 NS035909 DVV için
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | C-HCG-ON-10 |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 |
| Ficoll | Sigma | F2637 |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 |
| Poly-l-lysine | Sigma | P-1399 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| NT3 | Sigma | N1905 |
| BDNF | Sigma | B3795 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).
- Lee, H. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 42, 913-926 (2004).
- Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones. Dev. Neurobiol. , (2011).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).
- Tanaka, E., Kirschner, M. W. The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries. J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).
- Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).
- Gomez, T. M. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females. J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).
- Lavery, D. L., Hoppler, S. Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus. Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1994).
- Guirland, C. Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).
- Turney, S. G., Bridgman, P. C. Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity. Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).
- Weinl, C. On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5. Development. 130, 1635-1643 (2003).
- Knoll, B. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).
- Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos. Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).
