Neurale Explantatie Culturen van<em> Xenopus laevis</em
Summary
Kweken neurale explantaten van ontleed<em> Xenopus laevis</em> Embryo's die fluorescerende fusie eiwitten tot expressie zorgt voor beeldvorming van de groei kegel cytoskelet dynamiek.
Abstract
Het complexe axon begeleiding wordt voornamelijk veroorzaakt door de groei cone, dat de dynamische beweeglijke structuur aan het uiteinde van de groeiende axon. Tijdens axon uitgroei, moet de groei kegel integreren meerdere bronnen van begeleiding cue informatie voor het moduleren van de cytoskelet om de groei kegel vooruit te stuwen en nauwkeurig navigeren naar de specifieke doelstellingen ervan vinden 1. Hoe deze integratie vindt plaats op het cytoskelet niveau is nog steeds in opkomst, en onderzoek van het cytoskelet eiwitten en effector dynamiek binnen de groei conus kan de opheldering van deze mechanismen toe te staan. Xenopus laevis groei kegels zijn groot genoeg (10-30 micron in diameter) aan op hoge resolutie beeldvorming van levende cytoskelet dynamiek (bijvoorbeeld 2-4) en zijn gemakkelijk te isoleren en in een laboratoriumomgeving manipuleren vergelijking met andere vertebraten. De kikker is een klassiek model voor de ontwikkelingsbiologie neurobiologie studies en belangrijke vroege inzichten in de groei kegel microtubule dynamiek werden in eerste instantie gevonden met behulp van dit systeem 5-7. In deze werkwijze 8 worden verzameld en eitjes bevrucht in vitro, geïnjecteerd met RNA dat codeert fluorescent gelabeld cytoskelet fusie-eiwitten of andere constructies om genexpressie te manipuleren, en vervolgens liet men ontwikkelen om de neurale buis fase. Neurale buizen worden geïsoleerd door dissectie en vervolgens gekweekt en groei kegels op uitgroeiende neurieten worden afgebeeld. In dit artikel beschrijven we hoe u deze methode, waarvan het doel is om de cultuur Xenopus laevis groei kegels voor de volgende afbeelding in hoge resolutie analyse uit te voeren. Terwijl wij het voorbeeld van + TIP fusieproteïne EB1-GFP, kan deze werkwijze worden toegepast op een aantal eiwitten om hun gedrag verduidelijken in de groeikegel.
Protocol
Discussion
Xenopus laevis neurale explantaten sturen neurieten in een robuuste wijze door 24 uur na het uitplaten van de laminine / poly-lysine substraat als de omstandigheden nodig. Met dit substraat groei kegels zijn zeer beweeglijke en kunnen axon lengtes bereiken 1 mm, die in alle richtingen naar buiten uit het explantaat, hoewel typische lengtes 100 urn of meer. Als neurieten niet groeien, zijn er een beperkt aantal redenen het geval. Een mogelijkheid is dat de neurale explantaten niet goed hechten aan de schotel. Zo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Bob Freeman bedanken voor de opleiding en de Kirschner lab voor het gebruik van de kikker faciliteit, en leden van de Van Vactor lab voor ondersteuning. Wij danken de Nikon Imaging Center aan de Harvard Medical School voor hulp bij lichtmicroscopie voor de afbeeldingen in figuur 1. Dit werk werd gefinancierd door het volgende: NRSA NIH gemeenschap en NIH K99 gemeenschap te LAL, Basic Science Partnership financiering ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) naar AEF, en NIH RO1 NS035909 naar DVV
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | C-HCG-ON-10 |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 |
| Ficoll | Sigma | F2637 |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 |
| Poly-l-lysine | Sigma | P-1399 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| NT3 | Sigma | N1905 |
| BDNF | Sigma | B3795 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).
- Lee, H. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 42, 913-926 (2004).
- Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones. Dev. Neurobiol. , (2011).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).
- Tanaka, E., Kirschner, M. W. The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries. J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).
- Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).
- Gomez, T. M. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females. J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).
- Lavery, D. L., Hoppler, S. Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus. Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1994).
- Guirland, C. Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).
- Turney, S. G., Bridgman, P. C. Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity. Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).
- Weinl, C. On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5. Development. 130, 1635-1643 (2003).
- Knoll, B. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).
- Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos. Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).
