Summary
Dyrkning af neurale eksplantater fra dissekeret
Abstract
Den komplicerede proces med axon vejledning er i høj grad drevet af væksten kegle, hvilket er den dynamiske motile struktur på spidsen af den voksende axon. Under Axon udvækst må væksten kegle integrere flere kilder til vejledning cue information at modulere sin cytoskeleton for at drive væksten kegle fremad og præcist navigere for at finde de specifikke mål 1. Hvordan denne integration forekommer ved cytoskeletal niveau stadig opstår, og undersøgelse af cytoskeletprotein og effektor dynamik i vækst kegle kan tillade belysning af disse mekanismer. Xenopus laevis vækstkegler er stor nok (10 til 30 mikron i diameter) for at udføre høj opløsning direkte billedvisning af cytoskeletale dynamik (fx 2-4) og er lette at isolere og manipulere i et laboratorium indstilling i forhold til andre hvirveldyr. Frøen er en klassisk model for udviklingsmæssige neurobiologi undersøgelser, og vigtige tidlige indsigt i vækst kegle microtubule dynamik blev oprindeligt fundet ved hjælp af dette system 5-7. I denne metode 8 bliver æg opsamles og befrugtes in vitro, injiceret med RNA, der koder fluorescerende mærkede cytoskeletale fusionsproteiner eller andre konstruktioner til at manipulere genekspressionen, og fik derefter lov til at udvikle sig til neuralrøret fase. Neurale rør isoleres ved dissektion og derefter dyrkes, og vækstkegler på outgrowing neuritter afbildes. I denne artikel beskriver vi, hvordan at udføre denne fremgangsmåde, hvis formål er at kultur Xenopus laevis vækstkegler til efterfølgende høj opløsning billedanalyse. Mens vi giver som eksempel + TIP fusionsprotein EB1-GFP, kan denne fremgangsmåde anvendes til ethvert antal proteiner at belyse deres adfærd i vækst kegle.
Protocol
Bemærk: Vi beskriver trinene i de to første afsnit kun i kort, som fremragende protokoller med detaljerede oplysninger er blevet offentliggjort andetsteds, der fokuserer mere specifikt på disse trin (f.eks 8-12). Derudover har den generelle protokol at arbejde med Xenopus spinale neuroner i levende cellekultur tidligere blevet offentliggjort i et detaljeret metoder artikel 8. Vi stærkt anbefale, at artiklen som et supplement til denne video, men her vi giver nok information til succesfuldt at udføre og fejlfinding neuralrøret dissektion og plating protokol i trin 3.
1. Befrugtet in vitro Xenopus Æg
- Opnå æg fra kvindelige frøer, der blev injiceret med choriongonadotropin (400 enheder / frog) 12-18 timer før ægudtagningen. Indsamle æg i 1X Marc ændrede Ringer-opløsning (MFR) (0,1 M NaCl, 2,0 mM KCI, 1,0 mM MgSO4, 2,0 mM CaCl2, 5,0 mM HEPES, pH 7.4 9).
- Befrugte æg in vitro med hakket testikler som beskrevet tidligere 9.
- Efter mindst 20 minutter, fjern embryo jelly coat ved at inkubere embryoner i 2% cystein i 1X MMR (bragt til pH 7,8 med NaOH) i 3-5 min. Vask med 0,1 X MMR (eller 0,1 X MBS (modificeret Barth saltvand, 1X opskrift: 88 mM NaCI, 1 mM KCI, 0,7 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 2,5 mM NaHCO3, 5 mM HEPES, pH 7,8)) 3 -5 gange, og holde embryoer ved stuetemperatur, indtil injektioner, eller om ønsket sted embryoer ved 14-18 ° C for at forsinke udvikling.
2. Mikroinjektion af RNA
Bemærk: mens vi anvender RNA injektion her, er disse teknikker ikke begrænset til RNA og DNA, proteiner, eller modificerede nukleinsyrer til genmanipulation kan også anvendes og er blevet beskrevet tidligere 12.
- Forud for forsøget, RNA'er til mærkning cytoskeletale eller andre strukturer are transkriberet fra lineariserede DNA-skabeloner ved hjælp af mMessage mMachine kittet (Ambion). mRNA'er kræver en 5'-hætte og en 3'-polyadenylerings-hale for at fremme translation og forhindre nedbrydning i embryoner. pCS2 + er en almindeligt anvendt vektor til dette formål, og transkriptionen kit omfatter en hætte analog under syntesereaktionen. Vi resuspendere transkriberet mRNA i nuclease-free ddH 2 0, med en stamkoncentration mellem 500 og 2.000 ng / ul, efterfulgt af hurtig opbevaring ved -80 ° C. Før injektion fortyndes RNA i ddH 2 0 til den passende koncentration til injektion. Da kun et lille volumen vil blive injiceret i embryoner, resuspendering i puffer ikke er nødvendig. Vores endelige injektion koncentrationen er typisk fra 50 til 200 pg / nl, afhængigt af konstruktionen, og vi normalt vil injicere op til 4 nl pr embryo, selv om mange laboratorier traditionelt injicere op til 10 nl, der er ca 1% af den samlede mængde et foster. RNA kan være toksiske ved høje doser, og dosis pr embryo slægterlly området fra 10 pg til 1 ng, selv op til 5 ng kan tolereres afhængigt af den bestemte gen og renhed. Men for billedbehandling protein lokalisering, bør den lavest mulige niveau injiceres for at undgå over-ekspression artefakter. RNA for EB1-GFP i denne protokol anvendes ved den endelige mængde på 250 pg pr foster.
- Forbered injektionsnåle ved at trække kapillar med en nål aftrækker 9, til en spids diameter ~ 0,2 um. Med en Sutter P-87 aftrækker, bruger vi følgende indstillinger: varme 644, pull 125, hastighed 70, tid 250, men disse parametre varierer afhængigt af maskinen og skal re-justeres efter ændring af glødetråden (vi bruger i øjeblikket en 2,5 mm firkantet kasse glødetråd, der er 2,5 mm bred). Under et mikroskop, bryde nålespidsen med pincet i en vinkel for at generere et fjerpen-lignende form. Der findes andre metoder til at bryde og påfyldning injektionsnåle (for eksempel 11,12), men vi fylder nålen med RNA ved at placere en lille dråbe (0,5-1 ul) til den bageste ende afnål. For microinjecting i embryoner, er der en række kommercielt tilgængelige indsprøjtningssystemer, to af de mest almindelige er Pico-injektor (Medical Systems) og Nanoject (Drummond Scientific) (se 11 for mere information). Vi bruger Medical Systems PLI-100 Pico-Injector, som anvender komprimeret gas til en digitalt indstillet tidsperiode med henblik på at levere ensartede nanoliter mængder. Injektionsvolumen skal kalibreres for hver ny mikropipette med et trin mikrometer, og injektionstid bør justeres for at opnå den ønskede mængde af injiceret RNA.
- Sted befrugtede embryoner i 1 - til 4-celle stadiet i en plastik skål indeholdende 5% Ficoll i 0,1 X MMR. Hold foster på plads med en pincet, eller anbringelse i en bedrift platform (en plastik mesh, med en ~ 1 mm gitter, klæbet til bunden af skålen med modellervoks eller dental voks), injiceres ønskede volumen i animalske blastomeres (se trin 2,1 for nærmere oplysninger vedrørende injektionsvolumener). Fordel i flere loctioner hele embryoet, til mindst en injektion i hver dyre blastomeres, giver en mere ensartet fordeling (fx en 4-celle stadiet embryo vi typisk injiceres 1-2 gange i hver blastomer, mens der i en 2-celle stadiet embryo, vi injicerer 2-4 gange i hver blastomer). En fordel ved at vente, indtil de 2-4 cellestadiet er, at du sikrer embryonet er begyndt at spalte normalt. Hvis tiden er afgørende, kan man starte fra 1-cellestadiet, med ringe forskel i slutresultatet end flere embryoner har behov for at blive injiceret. Ældre embryoer kan bruges som godt, og dette er især nyttig, hvis bestemte celletyper er målrettet til injektion, men da vi generelt foretrækker mere bredt udtryk, vi injicerer på yngre embryoner til at reducere behovet for mere talrige injektioner.
- Overførsel injicerede embryoner til en plastisk skål indeholdende 0,1 x MFR og give dem mulighed for at udvikle sig, indtil trin 20 til 23 13. Inkuber embryoer ved 14 til 22 ° C afhængigt af den ønskede speed udvikling. (For dissekering neurale rør den følgende dag, bruge ~ 22 ° C. For dagen efter, skal du bruge ~ 14 ° C)
3. Neural Tube Dissection og Plating
- Forud for udførelse af dissektioner, forberede dyrkningsskålene 14. Dels coat dækglas med tilstrækkelig opløsning af 200 ug / ml poly-lysin i PBS til pool over overfladen af dækglasset, i enten Mattek eller Lab-Tek dyrkningsskåle, og inkuber i en time (alternativt kan man anvende dækglas siddende løst i en petriskål, til senere anbringelse på objektglas til billeddannelse og immuncytokemi). Aspirér og vask med et overskud af PBS 3 gange, og lad tørre. Derefter overtrække retter med 10 ug / ml laminin i PBS (vi normalt bruger 500 pi pr dækglas, nok til pool over overfladen) i en time ved 37 °. Aspirér laminin løsning og vask 3 gange med et overskud af PBS, og pas på ikke at lade laminin-belagte overflader bliver udsat for luft-grænsefladen. Træder i stedete PBS med dyrkningsmedium (50% Ringers, 49% L-15 media, 1% kalvefosterserum plus 50 ug / ml penicillin / streptomycin og gentamycin, pH 7,4 og filtersteriliseres). (Ringers medie, 115 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 2 mM CaCl2, 10 mM Hepes pH 7,4, 0,5 mM EDTA). Mens vores protokol anvender dette medie, skal det bemærkes, at dette er et beriget medium fælles for ældre Xenopus retinale ganglion kulturer, hvor neuroner har reduceret energi reserveret. Unge rygmarv kulturer vil overleve og vokse i mere end 24 timer i rene Ringers medier uden yderligere vækstfaktorer, og dette er faktisk en af fordelene ved at bruge dette system. Valgfrit: add NT3 og BDNF (til slutkoncentrationer på 25 ng / ul hver) til dyrkningsmedier for at øge axon-udvækst.
- På grund af variationer i ekspressionen af injiceret mRNA, kan embryoer udviser en mosaik af fluorescens. Forud for udførelse af dissektioner, skærm embryoner for tilstedeværelsen af fluorescens, at identificere de embryoner, som expRESS det fluorescerende fusionsproteinet i neuralrøret. Anbring fluorescerende embryoner i trin 20-23 i en agarose-coated plastskål fyldt med Steinberg medier (58 mM NaCl, 0,67 mM KCI, 0,44 mM Ca (NO3) 2, 1,3 mM MgSO4, 4,6 mM Tris, pH til 7,8 og derefter autoklaveret) 5. At gøre agarose-coated dish, coat bund plastskål med smeltet 1% agarose i 0,1 x MFR og lad hærde. Dette giver en blød overflade, således at skaden ikke sker til de fine pincet og wolfram nåle, der anvendes i løbet af de efterfølgende dissektion trin. Dissektion af embryoner ud over scenen 23 er muligt, men det er mere udfordrende som væv klæber tættere til hinanden og derfor kræver længere behandling med collagenase.
- Under et dissektionsmikroskop, fjernes vitellinmembranen med fine tænger, og derefter isolere hele den dorsale del af embryo, ved at en serie af indsnit. Mens den ene tang holder foster på plads, skal du bruge den anden til at gøre et snit påside af embryonet at blotlægge det hule indre. Derefter bruge begge pincet til at klemme langs vævet mellem dorsale og ventrale halvdele af embryonet, hvilket begrænser embryo i halvdelen at isolere den dorsale del indeholdende det neurale rør.
- Anbring den dorsale eksplantat i et Eppendorf-rør med 2 mg / ml collagenase i Steinberg medier i 15-20 minutter på en rotator, at løsne væv, og derefter afpipetteres dorsal eksplantat i en plastik agarose-coatet skål med frisk Steinberg opløsning. Alternativt kan eksplantatet anbringes i en petriskål indeholdende collagenase opløsningen i 15 minutter, hvor hele dissektion kan derefter udføres.
- Ved hjælp af en pincet eller lignende, forsigtigt dissekere neuralrøret fra den dorsale hud og den ventrale rygstrengen. Skub spidsen af tangen mellem epidermis og det underliggende væv og langsomt trække sig tilbage epidermis, afslører neuralrøret nedenunder. Brug derefter en pincet til at holde vævet og en anden til at glide spidsen mellemneuralrøret og notochord. Endelig med pincet til at fjerne somitter på hver side af røret.
- Overfør neuralrøret til en agarose-coatet skål fyldt med dyrkningsmedium, som beskrevet i trin 3.1.
- Efter opsamling af flere neurale rør, skær dem i talrige stykker (ca. 20, hvis hele røret er isoleret) ved hjælp af skærpede wolfram nåle eller pincet, og derefter plade brikkerne i dyrkningsskålene fyldt med medium (fremstillet i trin 3,1), strækning eksplantaterne jævnt i rækker.
- Efter plating, ikke flytte retter, fordi det ville forstyrre de knyttede celler. Inkuber de pletterede neurale rør eksplantater omkring 20-22 ° C. Vi typisk forlader skålen af celler på bænken ved stuetemperatur natten over. En af fordelene ved Xenopus laevis neuroner er, at en særlig inkubator til celledyrkning, som regulerer CO 2-niveauer eller temperaturen ikke er nødvendig. Neuritter og vækst kegler kan observeres og afbildes ved stuetemperatur 12-24 Timer efter udpladning, selv udvækst kan fremskyndes ved tilsætning af vækstfaktorer. Generelt vil ekspression af et RNA-eller plasmid produkt medføre variabel ekspression mellem cellerne, og derfor kan der være en række fluorescens-ekspressionsniveauer mellem vækstkegler. Har vi observeret RNA-ekspression af fluorescerende proteiner vedvare ud over 48 timer efter udpladning, selv om dette afhænger af den særlige konstruktion.
4. Repræsentative resultater
Efter at have fulgt den protokol, som er sammenfattet i figur 1A, vil sunde, korrekt-dissekeret og dyrket neurale eksplantater sende talrige axoner eller neuritter i hver retning på laminin / poly-lysin substrat, der er vist i figur 1B. De vækstkegler på spidserne af axoner kan afbildes ved enten DIC optik, som det ses i figur 1C, til billede overordnede motilitet dynamik eller høj opløsning fluorescens mikroskopi at undersøge localization af fluorescens-mærkede cytoskeletale proteiner, for eksempel EB1-GFP vist i figur 1D.
Figur 1. Resumé af forsøgsprotokol og forventede resultat. A) Protokol flow-chart. Se film for detaljer vedr dissektion på dag 3. Hele neuralrøret skal skæres i omkring 20 lige store stykker og spredt jævnt ud i rækker på dækglasset. I denne tegneserie, er saks afbildet til at repræsentere skære vævet med fine pincet. CG choriongonadotropin B) DIC billede af axoner eller neuritter vokser ud af eksplantation (eksplantat i øverste venstre hjørne). C) Højere forstørrelse billede af vækst kegle på spidsen af en voksende Axon. D) Fluorescensmikroskopi billede af EB1-GFP i vækst kegle. Målestokken 10 um. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenopus laevis neurale eksplantater sende neuritter i en meget robust måde ved 24 timer efter udpladning på laminin / poly-lysin substrat, hvis forholdene er passende. Med dette substrat, er vækstkegler meget motile og kan opnå axon længder på op til 1 mm, der strækker sig i alle retninger udad fra eksplantatet, men typiske længder er 100 um eller mere. Hvis neuritter ikke vokser ud, er der et begrænset antal grunde til, at dette er tilfældet. En mulighed er, at de neurale eksplantater ikke korrekt holde sig til fadet. Sørg for ikke at forstyrre vedhæftede filer ved et uheld flytte skålen efter udpladning. Også, at laminin-og poly-lysin-coatede skåle blev gjort korrekt med alle friskfremstillede reagenser. En anden mulighed for manglende udvækst er, at celledyrkningsmedier betingelser måske ikke optimale. Dobbelttjek protokol og beregninger for at sikre, at alle medieløsninger er korrekt formuleret. Endelig er det muligt, atembryoer fra hvilke eksplantaterne blev opnået kan være usunde, selv hvis fostre kan udvikle sig til neuralrøret fase, er mindre sandsynligt, at problemet. Det er imidlertid bedst at holde nogle hele intakte embryoer dyrket i 0,1 X MMR sammen med dissektioner for at sikre, at fortsat udvikling forekommer.
Det mest kritiske trin i denne protokol er den neuralrøret dissektion. Sammenlignet med mange modelsystem embryo micro-dissektioner, er dette en relativt simpel teknik og Xenopus laevis embryoer er en af de største og mest tilgivende af organismer til dissekering. Men hvis forsøgslederen er helt nyt for udførelse af embryonale dissektioner, kan dette trin tage flere timer at perfektionere (bedst spredt ud over 2-3 sessioner). Efter collagenase-behandling, foretrækker nogle til næste fjerne mesoderm, notochord og somitter, efterfulgt af epidermis, hvilket resulterer i den isolerede neurale rør, mens andre foretrækker at starte med epidermis fjernelse og derefteradskillelse af de andre væv fra neuralrøret. Det anbefales at prøve begge metoder til at bestemme hvad der virker bedst for den enkelte forsker. Også være omhyggelig med at ikke lægge for meget pres på neuralrøret under sin isolation. Det er bedre at fjerne andet væv fra neuralrøret, snarere end at fjerne det neurale rør fra andre væv, for at reducere spændingen på røret og forhindre det i fragmentering tidligt. Endelig, hvis omgivende væv er for klæbende til neuralrøret, derefter anbringe eksplantatet tilbage i collagenaseopløsning i adskillige minutter. Dette vil gøre adskillelsen af neuralrøret fra de omgivende væv, især epidermis, meget lettere. Længden af collagenase behandling afhænger af det stadium af embryonet, som ældre fostre kræver længere behandlinger, op til 45 min eller mere for trin 28 embryoner.
Ud over dyrkning neurale rør eksplantater, kan neurale rør også adskilles før udpladning, in order til billede enkelte celler. Protokoller for denne fremgangsmåde er beskrevet i 8, 15. En fordel ved denne fremgangsmåde er, at neuronal morfologi og neurit længde kan undersøges, som cellelegemet ikke er skjult inde i eksplantatet. Desuden kan neurale eksplantater også dyrkes på forskellige mønstrede substrater. For eksempel har den vejledning cue "stripe assay" blevet anvendt til at vurdere ændringer i vækst kegle dynamik som reaktion på at støde substrat grænser i kultur 16, 17. En detaljeret protokol til fremstilling stribet mønstre af stikord er blevet beskrevet 18. Dette kan give mulighed for analyse af cytoskeletale dynamik mens væksten kegle undergår vejledning cue rat beslutninger.
Der er en række fordele ved at bruge Xenopus laevis for neurale eksplantations dyrkning eksperimenter. Sammenlignet med andre systemer, dyrkning af disse primære neuroner er relativt let at opnå og kræver lave omkostninger. Da de kan dyrkes og afbildes ved stuetemperatur,dyre kuvøser er ikke påkrævet. Xenopus embryoer er let tilgængelige og kan fås i store mængder, de udvikler sig hurtigt, og de er store nok til at dissekere med minimal træning. Således er dette system særlig velegnet til undervisningslaboratorier.
En anden fordel ved anvendelse af froeembryoner er, at de er modtagelige for manipulationer af genet, mRNA eller protein ekspressionsniveauer afhængigt af behovene i en bestemt eksperiment. For eksempel er en fordel ved anvendelse af mRNA, at koncentrationen og injektionsvolumen kan titreres forsigtigt for at kontrollere den resulterende ekspressionsniveau, mens injektion af DNA på den anden side muliggør etablering af transgene embryoner, hvor genekspression kan styres ved rumlig eller temporal promotor (fx 19). Således kan denne neurale eksplantatfremgangsmåden anvendes til flere situationer for forståelsen af adfærd og funktionen af proteiner af interesse i axon-udvækstog vækst kegle dynamik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Bob Freeman for uddannelse og Kirschner laboratorium for brug af frøen rum og medlemmer af Van Vactor lab for support. Vi takker Nikon Imaging Center ved Harvard Medical School for assistance med lysmikroskopi for billederne i figur 1. Dette arbejde blev finansieret af følgende: NRSA NIH fællesskab og NIH K99 fællesskab til LAL, Basic Science Partnership finansiering ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) til AEF, og NIH RO1 NS035909 til DVV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Labs | C-HCG-ON-10 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 | |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC, Inc. | 30-31-0 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P-1399 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| NT3 | Sigma-Aldrich | N1905 | |
| BDNF | Sigma-Aldrich | B3795 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).
- Lee, H. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 42, 913-926 (2004).
- Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones. Dev. Neurobiol. , (2011).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).
- Tanaka, E., Kirschner, M. W. The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries. J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).
- Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).
- Gomez, T. M. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females. J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).
- Lavery, D. L., Hoppler, S. Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus. Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Guirland, C. Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).
- Turney, S. G., Bridgman, P. C. Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity. Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).
- Weinl, C. On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5. Development. 130, 1635-1643 (2003).
- Knoll, B. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).
- Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos. Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).
