Dyrkning af neurale eksplantater fra dissekeret<em> Xenopus laevis</em> Embryoner, der udtrykker fluorescerende fusionsproteiner tillader afbildning af vækst kegle cytoskeletale dynamik.
Den komplicerede proces med axon vejledning er i høj grad drevet af væksten kegle, hvilket er den dynamiske motile struktur på spidsen af den voksende axon. Under Axon udvækst må væksten kegle integrere flere kilder til vejledning cue information at modulere sin cytoskeleton for at drive væksten kegle fremad og præcist navigere for at finde de specifikke mål 1. Hvordan denne integration forekommer ved cytoskeletal niveau stadig opstår, og undersøgelse af cytoskeletprotein og effektor dynamik i vækst kegle kan tillade belysning af disse mekanismer. Xenopus laevis vækstkegler er stor nok (10 til 30 mikron i diameter) for at udføre høj opløsning direkte billedvisning af cytoskeletale dynamik (fx 2-4) og er lette at isolere og manipulere i et laboratorium indstilling i forhold til andre hvirveldyr. Frøen er en klassisk model for udviklingsmæssige neurobiologi undersøgelser, og vigtige tidlige indsigt i vækst kegle microtubule dynamik blev oprindeligt fundet ved hjælp af dette system 5-7. I denne metode 8 bliver æg opsamles og befrugtes in vitro, injiceret med RNA, der koder fluorescerende mærkede cytoskeletale fusionsproteiner eller andre konstruktioner til at manipulere genekspressionen, og fik derefter lov til at udvikle sig til neuralrøret fase. Neurale rør isoleres ved dissektion og derefter dyrkes, og vækstkegler på outgrowing neuritter afbildes. I denne artikel beskriver vi, hvordan at udføre denne fremgangsmåde, hvis formål er at kultur Xenopus laevis vækstkegler til efterfølgende høj opløsning billedanalyse. Mens vi giver som eksempel + TIP fusionsprotein EB1-GFP, kan denne fremgangsmåde anvendes til ethvert antal proteiner at belyse deres adfærd i vækst kegle.
Xenopus laevis neurale eksplantater sende neuritter i en meget robust måde ved 24 timer efter udpladning på laminin / poly-lysin substrat, hvis forholdene er passende. Med dette substrat, er vækstkegler meget motile og kan opnå axon længder på op til 1 mm, der strækker sig i alle retninger udad fra eksplantatet, men typiske længder er 100 um eller mere. Hvis neuritter ikke vokser ud, er der et begrænset antal grunde til, at dette er tilfældet. En mulighed er, at de neurale eksplantater ikke korrekt ho…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Bob Freeman for uddannelse og Kirschner laboratorium for brug af frøen rum og medlemmer af Van Vactor lab for support. Vi takker Nikon Imaging Center ved Harvard Medical School for assistance med lysmikroskopi for billederne i figur 1. Dette arbejde blev finansieret af følgende: NRSA NIH fællesskab og NIH K99 fællesskab til LAL, Basic Science Partnership finansiering ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) til AEF, og NIH RO1 NS035909 til DVV
Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | C-HCG-ON-10 |
Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 |
mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 |
Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 |
Ficoll | Sigma | F2637 |
Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 |
Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C |
L-15 | Invitrogen | 21083-027 |
Poly-l-lysine | Sigma | P-1399 |
Laminin | Sigma | L2020 |
NT3 | Sigma | N1905 |
BDNF | Sigma | B3795 |