से तंत्रिका Explant संस्कृति<em> Xenopus laevis</em
Summary
Dissected से संवर्धन तंत्रिका explants<em> Xenopus laevis</em> भ्रूण कि फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन व्यक्त विकास शंकु cytoskeletal गतिशीलता की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है.
Abstract
अक्षतंतु मार्गदर्शन की जटिल प्रक्रिया काफी हद तक विकास शंकु, जो बढ़ती अक्षतंतु की नोक पर गतिशील गतिशील संरचना है के द्वारा संचालित है. अक्षतंतु परिणाम के दौरान विकास शंकु मार्गदर्शन क्यू जानकारी के कई स्रोतों को एकीकृत करने के लिए अपने cytoskeleton मिलाना के क्रम में विकास शंकु आगे प्रेरित है और इसे सही करने के लिए अपनी विशिष्ट 1 लक्ष्य मिल नेविगेट चाहिए. अभी भी यह कैसे एकीकरण cytoskeletal स्तर पर होता है, में उभर रहा है और cytoskeletal प्रोटीन और विकास शंकु के भीतर effector गतिशीलता की परीक्षा इन तंत्रों की व्याख्या की अनुमति दे सकते हैं Xenopus laevis विकास शंकु. पर्याप्त बड़ा (व्यास में 10-30 microns) के लिए उच्च प्रदर्शन cytoskeletal गतिशीलता का जीना इमेजिंग (2-4 जैसे) संकल्प और अलग करने के लिए और अन्य रीढ़ की तुलना में एक प्रयोगशाला स्थापित करने में हेरफेर करने के लिए आसान कर रहे हैं. मेंढक विकासात्मक तंत्रिका जीव विज्ञान के अध्ययन, विकास शंकु mic में और महत्वपूर्ण प्रारंभिक अंतर्दृष्टि के लिए एक क्लासिक मॉडल प्रणाली हैrotubule गतिशीलता शुरू में इस प्रणाली 5-7 का उपयोग करते हुए पाए गए. इस विधि में 8, अंडे एकत्र कर रहे हैं और इन विट्रो में निषेचित, आरएनए fluorescently टैग cytoskeletal संलयन प्रोटीन एन्कोडिंग या अन्य constructs के साथ इंजेक्शन जीन की अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए, और फिर न्यूरल ट्यूब चरण के लिए विकसित करने की अनुमति दी. न्यूरल ट्यूब विच्छेदन द्वारा अलग कर रहे हैं और फिर संवर्धित कर रहे हैं, और neurites outgrowing पर विकास शंकु हैं imaged. इस अनुच्छेद में, हम वर्णन कैसे प्रदर्शन करने के लिए इस पद्धति है, जो लक्ष्य की संस्कृति के बाद उच्च संकल्प छवि विश्लेषण के लिए Xenopus laevis विकास शंकु है. जब तक हम + टिप संलयन प्रोटीन EB1 – GFP उदाहरण प्रदान करते हैं, तो इस विधि प्रोटीन के किसी भी संख्या विकास शंकु के भीतर उनके व्यवहार को स्पष्ट करने के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
Discussion
Xenopus laevis तंत्रिका explants 24 घंटे के द्वारा एक बहुत मजबूत तरीके से बाहर neurites laminin / पाली – lysine सब्सट्रेट पर चढ़ाना के बाद भेज अगर स्थितियों उपयुक्त हैं. इस सब्सट्रेट के साथ, विकास शंकु अत्यधिक गतिशील हैं और 1 मिमी क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के लिए प्रशिक्षण और मेंढक की सुविधा के उपयोग के लिए Kirschner प्रयोगशाला के लिए बॉब Freeman का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और समर्थन के लिए वान Vactor प्रयोगशाला के सदस्य हैं. हम चित्रा 1 में छवियों के लिए माइक्रोस्कोपी के साथ प्रकाश Nikon इमेजिंग सेंटर हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में सहायता के लिए धन्यवाद. इस काम निम्न द्वारा वित्त पोषित किया गया था: एनआरएसए NIH फैलोशिप और NIH K99 लाल करने के लिए फैलोशिप, बुनियादी विज्ञान भागीदारी धन ( https://bsp.med.harvard.edu/ DVV AEF के लिए), और RO1 NIH NS035909
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | C-HCG-ON-10 |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 |
| Ficoll | Sigma | F2637 |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 |
| Poly-l-lysine | Sigma | P-1399 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| NT3 | Sigma | N1905 |
| BDNF | Sigma | B3795 |
References
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