Summary
Dissected से संवर्धन तंत्रिका explants
Abstract
अक्षतंतु मार्गदर्शन की जटिल प्रक्रिया काफी हद तक विकास शंकु, जो बढ़ती अक्षतंतु की नोक पर गतिशील गतिशील संरचना है के द्वारा संचालित है. अक्षतंतु परिणाम के दौरान विकास शंकु मार्गदर्शन क्यू जानकारी के कई स्रोतों को एकीकृत करने के लिए अपने cytoskeleton मिलाना के क्रम में विकास शंकु आगे प्रेरित है और इसे सही करने के लिए अपनी विशिष्ट 1 लक्ष्य मिल नेविगेट चाहिए. अभी भी यह कैसे एकीकरण cytoskeletal स्तर पर होता है, में उभर रहा है और cytoskeletal प्रोटीन और विकास शंकु के भीतर effector गतिशीलता की परीक्षा इन तंत्रों की व्याख्या की अनुमति दे सकते हैं Xenopus laevis विकास शंकु. पर्याप्त बड़ा (व्यास में 10-30 microns) के लिए उच्च प्रदर्शन cytoskeletal गतिशीलता का जीना इमेजिंग (2-4 जैसे) संकल्प और अलग करने के लिए और अन्य रीढ़ की तुलना में एक प्रयोगशाला स्थापित करने में हेरफेर करने के लिए आसान कर रहे हैं. मेंढक विकासात्मक तंत्रिका जीव विज्ञान के अध्ययन, विकास शंकु mic में और महत्वपूर्ण प्रारंभिक अंतर्दृष्टि के लिए एक क्लासिक मॉडल प्रणाली हैrotubule गतिशीलता शुरू में इस प्रणाली 5-7 का उपयोग करते हुए पाए गए. इस विधि में 8, अंडे एकत्र कर रहे हैं और इन विट्रो में निषेचित, आरएनए fluorescently टैग cytoskeletal संलयन प्रोटीन एन्कोडिंग या अन्य constructs के साथ इंजेक्शन जीन की अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए, और फिर न्यूरल ट्यूब चरण के लिए विकसित करने की अनुमति दी. न्यूरल ट्यूब विच्छेदन द्वारा अलग कर रहे हैं और फिर संवर्धित कर रहे हैं, और neurites outgrowing पर विकास शंकु हैं imaged. इस अनुच्छेद में, हम वर्णन कैसे प्रदर्शन करने के लिए इस पद्धति है, जो लक्ष्य की संस्कृति के बाद उच्च संकल्प छवि विश्लेषण के लिए Xenopus laevis विकास शंकु है. जब तक हम + टिप संलयन प्रोटीन EB1 - GFP उदाहरण प्रदान करते हैं, तो इस विधि प्रोटीन के किसी भी संख्या विकास शंकु के भीतर उनके व्यवहार को स्पष्ट करने के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
नोट: हम संक्षिप्त में केवल पहले दो वर्गों में कदम का वर्णन है, के रूप में विस्तृत जानकारी के साथ उत्कृष्ट प्रोटोकॉल कहीं प्रकाशित किया गया है कि इन कदमों पर ध्यान अधिक विशेष रूप से (8-12 उदाहरण के लिए). इसके अतिरिक्त, Xenopus रहते सेल संस्कृति में रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स के साथ काम करने की सामान्य प्रोटोकॉल पहले किया गया है एक विस्तृत तरीके 8 लेख में प्रकाशित किया. हम अत्यधिक इस वीडियो के लिए एक पूरक के रूप में है कि लेख की समीक्षा करने की सलाह देते हैं, हालांकि हम को सफलतापूर्वक प्रदर्शन और न्यूरल ट्यूब और चरण 3 में चढ़ाना प्रोटोकॉल विच्छेदन समस्या निवारण के लिए पर्याप्त जानकारी प्रदान करते हैं.
1. Xenopus अंडे के इन विट्रो निषेचन
- महिला मेंढ़क कि chorionic gonadotropin (400 इकाइयों / मेंढक) 12-18 घंटा के साथ अंडा संग्रह से पहले थे इंजेक्शन से अंडे प्राप्त. 1X मार्क संशोधित घंटी (एमएमआर) समाधान (0.1 एम NaCl, 2.0 मिमी KCl, 1.0 मिमी MgSO 4, 2.0 मिमी 2 CACL में अंडे ले लीजिए, 5.0 मिमी HEPES, 7.4 पीएच 9).
- कीमा बनाया हुआ testes साथ इन विट्रो में अंडे की खाद डालना, के रूप में पहले 9 वर्णित है.
- कम से कम 20 मिनट के बाद, 1X एमएमआर में 2% सिस्टीन (NaOH साथ 7.8 पीएच के लिए लाया) में 3-5 मिनट के लिए भ्रूण incubating द्वारा भ्रूण जेली कोट को हटा दें. 3: 0.1X एमएमआर (88 मिमी NaCl, 1 मिमी KCl, 0.7 मिमी CACL 2, 1 मिमी MgSO 4, 2.5 मिमी 3 NaHCO, 5 मिमी HEPES, 7.8 पीएच) या 0.1X (संशोधित बार्थ खारा, 1X नुस्खा एमबीएस) से धो कमरे के तापमान पर -5 बार, और भ्रूण रखने के इंजेक्शन जब तक, या अगर वांछित, 14-18 में जगह भ्रूण ° C विकास को धीमा करने के लिए.
2. शाही सेना के microinjection
नोट: जब तक हम आरएनए इंजेक्शन यहाँ का उपयोग, इन तकनीकों शाही सेना सीमित नहीं हैं और डीएनए, प्रोटीन, या संशोधित जीन हेरफेर के लिए न्यूक्लिक एसिड भी इस्तेमाल किया जा सकता है और 12 पहले से वर्णित किया गया है.
- पहले प्रयोग cytoskeletal या अन्य संरचनाओं की गिरफ्तारी के लिए लेबलिंग RNAsई linearized डीएनए mMessage mMachine किट (Ambion) का उपयोग टेम्पलेट्स से लिखित. mRNAs एक 5 'टोपी और एक 3' polyadenylation पूंछ अनुवाद को बढ़ावा देने और भ्रूण में गिरावट को रोकने की आवश्यकता है. pCS2 + इस उद्देश्य के लिए आमतौर पर इस्तेमाल वेक्टर है, और प्रतिलेखन किट संश्लेषण प्रतिक्रिया के दौरान एक टोपी अनुरूप भी शामिल है. हम nuclease मुक्त 2 DDH 0 में लिखित mRNA फिर से स्थगित करता है, 500 और 2000 के बीच एक शेयर एकाग्रता में एनजी / μl, -80 डिग्री सेल्सियस पर शीघ्र भंडारण द्वारा पीछा इंजेक्शन के लिए पहले, DDH 2 0 में शाही सेना के इंजेक्शन के लिए उपयुक्त एकाग्रता को पतला. के रूप में केवल एक छोटी मात्रा भ्रूण में इंजेक्ट किया जाएगा, बफर में resuspending आवश्यक नहीं है. हमारा अंतिम इंजेक्शन एकाग्रता आमतौर पर 50-200 स्नातकोत्तर / nl है, का निर्माण पर निर्भर करता है, और हम आम तौर पर भ्रूण प्रति nl 4, इंजेक्षन जाएगा हालांकि कई प्रयोगशालाओं परंपरागत nl 10, जो की कुल मात्रा का लगभग 1% है इंजेक्षन एक भ्रूण. आरएनए उच्च खुराक में विषाक्त हो सकता है, और सकता है भ्रूण पीढ़ी के प्रति खुराकlly 10 स्नातकोत्तर से 1 एनजी पर्वतमाला, हालांकि 5 एनजी विशेष जीन और पवित्रता के आधार पर सहन किया जा सकता है. हालांकि, इमेजिंग प्रोटीन स्थानीयकरण के लिए, कम से कम संभव स्तर अधिक अभिव्यक्ति कलाकृतियों से बचने के इंजेक्शन किया जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल में EB1 GFP के लिए शाही सेना भ्रूण प्रति 250 स्नातकोत्तर की अंतिम राशि पर किया जाता है.
- एक सुई डांड़ी 9 के साथ केशिका खींच ~ 0.2 सुक्ष्ममापी की एक टिप व्यास द्वारा इंजेक्शन सुइयों तैयार. गर्मी 644, 125 पुल, 70 वेग, 250 समय है, लेकिन इन मापदंडों मशीन के आधार पर अलग किया जाना चाहिए और रेशा (हम वर्तमान में एक 2.5 मिमी का उपयोग बदलने के बाद फिर से समायोजित: एक Sutter पी 87 डांड़ी के साथ, हम निम्न सेटिंग्स का उपयोग चौकोर बॉक्स रेशा कि 2.5 मिमी चौड़े) है. एक खुर्दबीन के तहत, संदंश के साथ एक कोण पर सुई टिप एक कलम की तरह आकार उत्पन्न तोड़. तोड़ने और भरने इंजेक्शन सुइयों (11,12 उदाहरण के लिए) के लिए अन्य तरीके हैं, लेकिन हम शाही सेना के साथ एक छोटी सी बूंद (0.5 - μl 1) रखकर सुई को भरने के लिए के पीछे के अंतसुई. भ्रूणों में microinjecting के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इंजेक्शन प्रणाली के एक नंबर, दो सबसे पिको सुई लगानेवाला (मेडिकल सिस्टम्स) जा रहा है आम, और Nanoject (Drummond वैज्ञानिक) (अधिक जानकारी के लिए 11 देखें). हम मेडिकल सिस्टम्स पीएलआई-100 पिको - सुई लगानेवाला, जो समय की अवधि के लिए एक डिजिटल सेट संकुचित गैस का उपयोग करता है क्रम में लगातार nanoliter मात्रा देने का उपयोग करें. प्रत्येक नए micropipette के लिए एक मंच सुक्ष्ममापी का उपयोग इंजेक्शन मात्रा calibrated किया जाना चाहिए, और इंजेक्शन समय इंजेक्शन शाही सेना के वांछित राशि को प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.
- 1 स्थान पर भ्रूण निषेचित एक प्लास्टिक 0.1X एमएमआर में 5% Ficoll युक्त डिश में 4 कोशिका चरण. संदंश के साथ जगह में भ्रूण, होल्डिंग या एक होल्डिंग मंच (एक ~ 1 मिमी ग्रिड के साथ एक प्लास्टिक की जाली, प्लास्टिसिन या दंत मोम के साथ पकवान के नीचे का पालन) में रखने, पशु blastomeres में वांछित मात्रा इंजेक्षन (कदम 2.1 देखें इंजेक्शन संस्करणों के बारे में) जानकारी के लिए. कई नियंत्रण रेखा में बांटोभ्रूण भर ations, पशु blastomeres में से प्रत्येक में कम से कम एक इंजेक्शन, और अधिक समान वितरण को प्राप्त करने के लिए (उदाहरण के लिए, एक चरण 4 सेल भ्रूण के लिए, हम आमतौर पर प्रत्येक ब्लास्टोमीयर में 1-2 बार इंजेक्षन, जबकि एक 2-सेल चरण में भ्रूण, हम प्रत्येक ब्लास्टोमीयर में 2-4 बार इंजेक्षन). 2-4 कोशिका चरण तक इंतजार करने का एक लाभ यह है कि आप यह सुनिश्चित भ्रूण फोड़ना करने के लिए सामान्य रूप से शुरू कर दिया गया है. हालांकि, अगर समय का सार है, आप चरण एक सेल में अधिक इंजेक्शन होने की जरूरत भ्रूण के अलावा अन्य अंत परिणाम में थोड़ा अंतर के साथ शुरू कर सकते हैं. पुराने चरण भ्रूण के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है, और यह विशेष रूप से उपयोगी है यदि विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए लक्षित कर रहे हैं, लेकिन के रूप में हम आम तौर पर और अधिक व्यापक अभिव्यक्ति पसंद करते हैं, हम युवा भ्रूण में सुई अधिक कई इंजेक्शन के लिए कम करने की जरूरत है.
- एक प्लास्टिक 0.1X एमएमआर युक्त डिश के लिए इंजेक्शन भ्रूण स्थानांतरण और उन्हें 20-23 13 स्तर तक विकसित करने की अनुमति है. 14 में 22 भ्रूण सेते ° C वांछित विशेष पर निर्भर करता हैविकास के एड. (तंत्रिका ट्यूब अगले दिन विदारक के लिए दिन के लिए ~ 22 डिग्री सेल्सियस के बाद, ~ 14 डिग्री सेल्सियस)
3. न्यूरल ट्यूब विच्छेदन और चढ़ाना
- Dissections प्रदर्शन से पहले, संस्कृति 14 व्यंजन तैयार. सबसे पहले, 200 ग्राम / पीबीएस में पाली lysine मिलीलीटर की पर्याप्त coverslip की सतह पर या तो मटेक या लैब टेक संस्कृति व्यंजन के पूल, और एक घंटे के लिए (वैकल्पिक सेते समाधान के साथ कोट coverslips, एक गिलास बैठे coverslips इस्तेमाल कर सकते हैं कांच स्लाइड पर इमेजिंग और immunocytochemistry के लिए बाद में प्लेसमेंट के लिए एक पेट्री डिश) में ढीला. Aspirate और PBS 3 बार की एक अतिरिक्त के साथ धोने, और दो सूखी. फिर 37 डिग्री पर एक घंटे के लिए 10 ग्राम / मिलीलीटर पीबीएस में laminin के साथ कोट व्यंजन (हम आमतौर पर coverslip प्रति 500 μl, सतह पर पूल करने के लिए पर्याप्त का उपयोग करें). Laminin समाधान Aspirate और पीबीएस की एक अतिरिक्त के साथ 3 बार धोने, सावधान किया जा रहा है के लिए नहीं जाने laminin लिपटे सतहों हवा अंतरफलक को उजागर हो गया है. Replacसंस्कृति मीडिया के साथ ई पीबीएस (50% घंटी, 49% एल-15 मीडिया, 1% भ्रूण गोजातीय सीरम, प्लस 50 ग्राम / मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और gentamycin, पीएच 7.4 और फिल्टर निष्फल). (घंटी मीडिया, 115 मिमी NaCl, 2.5 मिमी KCl, 2 मिमी CACL 2, 10 मिमी HEPES पीएच 7.4, 0.5 मिमी EDTA). जबकि हमारे प्रोटोकॉल इस मीडिया का उपयोग करता है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस पुराने Xenopus रेटिनल नाड़ीग्रन्थि संस्कृतियों के लिए एक समृद्ध आम मीडिया, जहां न्यूरॉन्स को कम कर दिया है ऊर्जा सुरक्षित है. युवा रीढ़ की हड्डी की संस्कृतियों से जीवित है और अतिरिक्त वृद्धि कारकों के बिना शुद्ध Ringers के मीडिया में अधिक से अधिक 24 घंटे के लिए विकसित है, और यह वास्तव में इस प्रणाली का उपयोग कर के लाभ में से एक है. वैकल्पिक: ऐड NT3 और BDNF संस्कृति मीडिया अक्षतंतु परिणाम बढ़ाने (25 एनजी / μl प्रत्येक के अंतिम सांद्रता).
- इंजेक्शन mRNA की अभिव्यक्ति में परिवर्तनशीलता की वजह से, भ्रूण प्रतिदीप्ति की एक मोज़ेक प्रदर्शन कर सकते हैं. पिछले dissections, प्रतिदीप्ति की उपस्थिति के लिए स्क्रीन भ्रूण, प्रदर्शन करने के लिए उन भ्रूण जो ऍक्स्प की पहचान करने के लिएन्यूरल ट्यूब में फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन ress. 20-23 स्तर पर एक agarose लेपित प्लास्टिक स्टाइनबर्ग मीडिया (58 मिमी NaCl, 0.67 मिमी KCl, 0.44 मिमी Ca (3 सं) 2, 1.3 मिमी MgSO 4, 4.6 मिमी Tris, पीएच 7.8 तो साथ भरा पकवान में फ्लोरोसेंट भ्रूण प्लेस autoclaved) 5. Agarose लेपित पकवान, प्लास्टिक पकवान के साथ कोट नीचे 0.1X एमएमआर और चलो कठोर में पिघल 1% agarose. यह एक नरम सतह प्रदान करता है ताकि ठीक संदंश और टंगस्टन सुई बाद विच्छेदन चरणों के दौरान प्रयोग किया जाता है कि क्षति घटित नहीं करता है. 23 मंच परे भ्रूण के विच्छेदन संभव है, लेकिन इसे और अधिक चुनौतीपूर्ण है के रूप में ऊतकों को एक दूसरे से और अधिक बारीकी से पालन करना और इस प्रकार कोलैजिनेज के साथ लंबे समय तक उपचार की आवश्यकता होती है.
- एक विदारक दायरे के तहत ठीक संदंश के साथ पीतक झिल्ली निकालें, और फिर चीरों की एक श्रृंखला बनाने के द्वारा भ्रूण के पूरे पृष्ठीय भाग को अलग. जबकि एक संदंश जगह में भ्रूण पकड़, 2 का उपयोग करने पर एक चीरा बनानेखोखले इंटीरियर बेनकाब भ्रूण की ओर. फिर, दोनों संदंश का उपयोग करने के साथ भ्रूण के पृष्ठीय और उदर halves के बीच ऊतक चुटकी, जिससे पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब वाले हिस्से को अलग करने के लिए 1/2 में भ्रूण को काटने.
- Eppendorf ट्यूब में 2 मिलीग्राम / स्टाइनबर्ग मीडिया में मिलीलीटर कोलैजिनेज साथ एक अंग को घुमानेवाली पेशी पर 15-20 मिनट, ऊतकों को ढीला करने के लिए, और फिर विंदुक ताजा स्टाइनबर्ग के समाधान के साथ एक प्लास्टिक पकवान agarose लेपित में पृष्ठीय explant पृष्ठीय explant जगह. वैकल्पिक रूप से, explant 15 मिनट, जहां पूरे विच्छेदन तो बाहर किया जा सकता है के लिए कोलैजिनेज समाधान युक्त एक पेट्री डिश में रखा जा सकता है.
- संदंश की एक जोड़ी का प्रयोग, धीरे पृष्ठीय epidermis और उदर पृष्ठदंड से न्यूरल ट्यूब काटना. Epidermis और अंतर्निहित ऊतक के बीच संदंश की नोक स्लाइड और धीरे धीरे वापस खींच epidermis, न्यूरल ट्यूब नीचे खुलासा. फिर, एक संदंश का उपयोग करने के लिए ऊतक पकड़ और एक अन्य के बीच टिप स्लाइडन्यूरल ट्यूब और पृष्ठदंड. अंत में, संदंश का उपयोग करने के लिए ट्यूब के दोनों तरफ somites हटाने.
- एक agarose लेपित संस्कृति मीडिया के साथ भरा पकवान स्थानांतरण न्यूरल ट्यूब, के रूप में 3.1 चरण में वर्णित है.
- कई तंत्रिका ट्यूबों के संग्रह के बाद, उन्हें कई टुकड़े (20 लगभग अगर पूरी ट्यूब अलग है) बढ़ाई टंगस्टन सुई या संदंश, और फिर प्लेट संस्कृति व्यंजनों में टुकड़े मध्यम (3.1 चरण में तैयार) के साथ भर का उपयोग, बाहर फैल में कटौती पंक्तियों में समान रूप से explants.
- चढ़ाना के बाद, बर्तन नहीं कदम है क्योंकि यह संलग्न कोशिकाओं को परेशान करते हैं. 20-22 के आसपास मढ़वाया न्यूरल ट्यूब explants सेते डिग्री सेल्सियस हम आम तौर पर कमरे के तापमान पर बेंच पर कोशिकाओं के पकवान रातोंरात छोड़ दें. Xenopus laevis न्यूरॉन्स के लाभ में से एक यह है कि सेल संस्कृति के लिए एक विशेष इनक्यूबेटर कि सीओ 2 का स्तर या तापमान को नियंत्रित करने के लिए की जरूरत नहीं है. Neurites और विकास शंकु और देखा जा सकता है और कमरे के तापमान पर 12 imagedचढ़ाना के बाद -24 घंटा, हालांकि परिणाम वृद्धि कारकों के अलावा के साथ त्वरित किया जा सकता है. सामान्य में, एक शाही सेना या प्लाज्मिड उत्पाद की अभिव्यक्ति कोशिकाओं के बीच चर अभिव्यक्ति में परिणाम है, और इस प्रकार विकास शंकु के बीच प्रतिदीप्ति अभिव्यक्ति के स्तर की एक श्रृंखला हो सकता. हम फ्लोरोसेंट चढ़ाना के बाद 48 घंटे से परे जारी रहती प्रोटीन की शाही सेना अभिव्यक्ति मनाया है, हालांकि इस विशेष का निर्माण पर निर्भर करता है.
4. प्रतिनिधि परिणाम
प्रोटोकॉल है, जो चित्र 1 ए में संक्षेप का पालन करने के बाद, स्वस्थ, सही ढंग से dissected और सुसंस्कृत तंत्रिका explants laminin / पाली lysine सब्सट्रेट, चित्रा 1 बी में दिखाया गया पर हर दिशा में कई या axons neurites भेज देंगे. axons के सुझावों पर विकास शंकु या तो डीआईसी प्रकाशिकी, के रूप में चित्रा 1C में देखा छवि समग्र गतिशीलता गतिशीलता, या उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged किया जा सकता है लो की जांचcalization fluorescently टैग cytoskeletal प्रोटीन की, उदाहरण के लिए, EB1 GFP चित्रा 1D में दिखाया है.
चित्रा 1 प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और उम्मीद परिणाम का सारांश. ए) प्रोटोकॉल प्रवाह चार्ट. 3 दिन पर विच्छेदन के बारे में जानकारी के लिए फिल्म देखें. पूरे न्यूरल ट्यूब 20 के बारे में समान रूप से आकार के टुकड़ों में कटौती की जानी चाहिए और बाहर coverslip पर पंक्तियों में समान रूप से फैला. इस कार्टून में, कैंची को ठीक संदंश के साथ ऊतक काटने का प्रतिनिधित्व करने के लिए चित्रित कर रहे हैं. तटरक्षक chorionic gonadotropin) या axons neurites explant (ऊपरी बाएँ कोने में explant) के बाहर बढ़ती डीआईसी छवि बी. सी) उच्च विकास शंकु के एक से बढ़ अक्षतंतु की नोक पर बढ़ाई छवि. डी) विकास शंकु में EB1 GFP प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि. स्केल बार 10 सुक्ष्ममापी. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
Xenopus laevis तंत्रिका explants 24 घंटे के द्वारा एक बहुत मजबूत तरीके से बाहर neurites laminin / पाली - lysine सब्सट्रेट पर चढ़ाना के बाद भेज अगर स्थितियों उपयुक्त हैं. इस सब्सट्रेट के साथ, विकास शंकु अत्यधिक गतिशील हैं और 1 मिमी की अक्षतंतु लंबाई प्राप्त कर सकते हैं, explant जावक से सभी दिशाओं में विस्तार, हालांकि ठेठ लंबाई 100 मीटर या उससे अधिक हैं. यदि neurites बाहर जाना नहीं है, वहाँ इस के लिए कारणों की एक सीमित संख्या के मामले में हो रहे हैं. एक संभावना यह है कि तंत्रिका explants पकवान करने के लिए ठीक से पालन नहीं किया है. गलती से चढ़ाना के बाद पकवान हिल द्वारा बाधित करने के लिए नहीं संलग्नक लिए सुनिश्चित करें. यह भी सुनिश्चित करना है कि laminin और पाली lysine लेपित व्यंजन सही ढंग से सभी हौसले तैयार अभिकर्मकों के साथ किए गए थे. परिणाम की कमी के लिए एक और संभावना है कि सेल संस्कृति मीडिया स्थितियों इष्टतम नहीं हो सकता है कि. डबल प्रोटोकॉल और गणना की जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी मीडिया समाधान को सही ढंग से तैयार किया गया है. अंत में, यह संभव है किभ्रूण explants जिसमें से प्राप्त किया गया अस्वस्थ हो सकता है, हालांकि अगर भ्रूण न्यूरल ट्यूब चरण के लिए विकसित कर सकते हैं, इस मुद्दे को होने की संभावना कम है. हालांकि, यह सबसे अच्छा है dissections के साथ कुछ पूरे बरकरार 0.1X एमएमआर में सुसंस्कृत भ्रूण रखने के लिए यह सुनिश्चित करना है कि निरंतर विकास होता है.
इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम न्यूरल ट्यूब विच्छेदन है. कई मॉडल प्रणाली सूक्ष्म dissections भ्रूण की तुलना में, यह एक अपेक्षाकृत सरल तकनीक है और Xenopus laevis भ्रूण विदारक के लिए सबसे बड़ा और सबसे क्षमा जीवों में से एक हैं. हालांकि, अगर experimenter भ्रूण dissections प्रदर्शन करने के लिए पूरी तरह से नया है, इस कदम के कई घंटे लेने के लिए एकदम सही है (सबसे अच्छा 2-3 सत्रों में बाहर फैल) हो सकता है. कोलैजिनेज उपचार के बाद, कुछ करने के लिए अगले mesoderm, पृष्ठदंड, और somites, epidermis द्वारा पीछा हटाने, इस प्रकार पृथक न्यूरल ट्यूब में जिसके परिणामस्वरूप पसंद करते हैं, जबकि दूसरों को epidermis हटाने के साथ शुरू करना पसंद करते हैं और फिरन्यूरल ट्यूब से अन्य ऊतकों को अलग. यह निर्धारित करने के लिए जो प्रत्येक शोधकर्ता के लिए सबसे अच्छा काम करता है के लिए दोनों तरीकों की कोशिश करने के लिए सिफारिश की है. इसके अलावा, न्यूरल ट्यूब पर अपने अलगाव के दौरान बहुत अधिक दबाव नहीं डाल करने के लिए सावधान रहना. न्यूरल ट्यूब से अन्य ऊतकों को हटाने के बजाय अन्य ऊतकों से न्यूरल ट्यूब को हटाने, ट्यूब पर तनाव को कम करने के लिए है और यह समय से पहले fragmenting से रोकने के क्रम में यह बेहतर है. अंत में, अगर आसपास के ऊतकों भी न्यूरल ट्यूब के अनुयायी हैं, तो कोलैजिनेज समाधान में explant कई मिनट के लिए वापस जगह है. यह आसपास के ऊतकों, विशेष रूप से epidermis, बहुत आसान से न्यूरल ट्यूब को अलग कर देगा. कोलैजिनेज उपचार की लंबाई भ्रूण के स्तर पर निर्भर करता है, पुराने भ्रूण के रूप में लंबे समय तक उपचार, ऊपर चरण के लिए 45 मिनट या अधिक से अधिक 28 भ्रूण की आवश्यकता होती है.
संवर्धन न्यूरल ट्यूब explants के अलावा, न्यूरल ट्यूब भी dissociated चढ़ाना करने से पहले हो सकता है orde में,छवि एकल कक्षों के लिए आर. इस विधि के लिए प्रोटोकॉल 8, 15 में वर्णित हैं. इस पद्धति का एक लाभ यह है कि neuronal आकारिकी है और neurite लंबाई, जांच की जा सकती है, के रूप में सेल शरीर explant के अंदर छिप नहीं है. इसके अलावा, तंत्रिका explants भी विभिन्न substrates पर नमूनों संवर्धित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, मार्गदर्शन क्यू "धारी परख" संस्कृति 16, 17 में सब्सट्रेट सीमाओं का सामना करने के लिए जवाब में विकास शंकु गतिशीलता में परिवर्तन का आकलन किया गया है. Cues की धारीदार पैटर्न तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल 18 में वर्णित किया गया है. यह cytoskeletal गतिशीलता के विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं, जबकि विकास शंकु प्रक्रिया मार्गदर्शन क्यू स्टीयरिंग निर्णय कर सकते हैं.
तंत्रिका explant संवर्धन प्रयोगों के लिए Xenopus laevis का उपयोग करने के लिए लाभ का एक नंबर रहे हैं. अन्य प्रणालियों की तुलना में, संवर्धन इन प्राथमिक न्यूरॉन्स को प्राप्त करने और कम लागत की आवश्यकता अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं. के रूप में वे और संवर्धित किया जा सकता है कमरे के तापमान पर imaged,महंगा इन्क्यूबेटरों आवश्यक Xenopus भ्रूण आसानी से सुलभ हैं और बड़ी मात्रा में प्राप्त किया जा सकता है, वे तेजी से विकसित है, और वे काफी बड़े के लिए न्यूनतम प्रशिक्षण के साथ काटना हैं. इस प्रकार, इस प्रणाली शिक्षण प्रयोगशालाओं के लिए विशेष रूप से अनुकूल है.
मेंढक भ्रूण का उपयोग करने का एक अन्य लाभ यह है कि वे जीन, mRNA, या प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर की जोड़तोड़, एक विशेष प्रयोग की जरूरतों पर निर्भर करता है के लिए उत्तरदायी हैं. उदाहरण के लिए, mRNA का उपयोग करने का एक लाभ यह है कि एकाग्रता और इंजेक्शन की मात्रा ध्यान से परिणामी अभिव्यक्ति के स्तर को नियंत्रित करने के, जबकि डीएनए दूसरे हाथ पर, इंजेक्शन titrated जा सकता, ट्रांसजेनिक भ्रूण के निर्माण में जो जीन अभिव्यक्ति द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है के लिए अनुमति देता है स्थानिक या अस्थायी विशिष्ट प्रमोटर (19 उदाहरण के लिए). इस प्रकार, इस तंत्रिका explant विधि व्यवहार और प्रोटीन के हित के समारोह को समझने के लिए कई स्थितियों के लिए किया जा सकता है अक्षतंतु परिणाम के दौरान लागूऔर विकास शंकु गतिशीलता.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के लिए प्रशिक्षण और मेंढक की सुविधा के उपयोग के लिए Kirschner प्रयोगशाला के लिए बॉब Freeman का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और समर्थन के लिए वान Vactor प्रयोगशाला के सदस्य हैं. हम चित्रा 1 में छवियों के लिए माइक्रोस्कोपी के साथ प्रकाश Nikon इमेजिंग सेंटर हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में सहायता के लिए धन्यवाद. इस काम निम्न द्वारा वित्त पोषित किया गया था: एनआरएसए NIH फैलोशिप और NIH K99 लाल करने के लिए फैलोशिप, बुनियादी विज्ञान भागीदारी धन ( https://bsp.med.harvard.edu/ DVV AEF के लिए), और RO1 NIH NS035909
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Labs | C-HCG-ON-10 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 | |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC, Inc. | 30-31-0 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P-1399 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| NT3 | Sigma-Aldrich | N1905 | |
| BDNF | Sigma-Aldrich | B3795 |
References
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