Neural Eksplantasjon kulturer fra<em> Xenopus laevis</em

Summary

Dyrking nevrale explants fra dissekert<em> Xenopus laevis</em> Embryo som uttrykker fluorescerende fusjonsproteiner tillater avbildning av vekst cone cytoskeletal dynamikk.

Abstract

Den komplekse prosessen med axon veiledning er stor grad drevet av veksten membran, som er den dynamiske motile strukturen på spissen av den voksende axon. Under axon utvekst, må veksten kjegle integrere flere kilder til veiledning cue informasjon å modulere sin cytoskjelettet for å drive veksten kjegle fremover og nøyaktig navigere for å finne sine spesifikke mål ^en. Hvordan denne integrasjonen skjer på cytoskeletal nivået fortsatt voksende, og undersøkelse av cytoskeletal protein og effektor dynamikk innenfor veksten kjegle kan tillate klarlegging av disse mekanismene. Xenopus laevis vekst membranene er stor nok (10-30 mikron i diameter) for å utføre høy -oppløsning levende avbildning av cytoskeletal dynamikk (f.eks ^2-4) og er lett å isolere og manipulere i en lab miljø i forhold til andre virveldyr. Frosken er en klassisk modell system for utvikling nevrobiologi studier og viktige tidlige innsikt i vekst kjegle microtubule dynamikk ble opprinnelig funnet ved hjelp av dette systemet ^5-7. I denne metoden ^8, er egg samlet og befruktet in vitro, injisert med RNA som koder for fluorescensmerket tagged cytoskeletal fusjonsproteiner eller andre konstruksjoner for å manipulere genekspresjon, og deretter tillatt å utvikle seg til nevralrøret scenen. Neural rør er isolert ved disseksjon og deretter dyrkes, og vekst kjegler på outgrowing neurites er avbildes. I denne artikkelen beskriver vi hvordan du utfører denne metoden, der målet er å kultur Xenopus laevis vekst kjegler for påfølgende høy oppløsning bildeanalyse. Mens vi gi eksempel på + TIP fusion protein EB1-GFP kan denne metoden brukes til en rekke proteiner for å belyse deres atferd innenfor veksten kjegle.

Protocol

Merk: Vi beskriver trinnene i de to første avsnittene bare i korthet, som utmerket protokoller med detaljert informasjon er publisert andre steder som fokuserer mer spesifikt på disse trinnene (f.eks 8-12). I tillegg har den generelle protokoll med å jobbe med Xenopus spinal nevroner i levende cellekultur er tidligere publisert i en detaljert metoder artikkel 8. Vi anbefaler å gjennomgå at artikkelen som et supplement til denne videoen, men her vi gir god nok informasjon til …

Discussion

Xenopus laevis nevrale explants sende ut neurites i en svært robust måte med 24 timer etter plating på laminin / poly-lysin substrat hvis forholdene ligger til rette. Med dette substrat, vekst kjegler er svært motile og kan oppnå axon lengder opp til 1 mm, som strekker seg i alle retninger utover fra eksplantasjon, selv om typiske lengder er 100 mikrometer eller mer. Hvis neurites ikke vokse ut, det er et begrenset antall grunner for at dette skal være tilfelle. En mulighet er at de nevrale explants ikke …

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue Number
Chorionic Gonadotropin	Argent Chemical Laboratories	C-HCG-ON-10
Cysteine	Sigma-Aldrich	52-90-4
mMessage mMachine kit	Ambion	AM1340
Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID)	FHC	30-31-0
Ficoll	Sigma	F2637
Dumont #5 Biologie Inox Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Collagenase	Sigma-Aldrich	9001-12-1
Mattek dishes	Mat Tek Corporation	P35G-1.5-14-C
L-15	Invitrogen	21083-027
Poly-l-lysine	Sigma	P-1399
Laminin	Sigma	L2020
NT3	Sigma	N1905
BDNF	Sigma	B3795