Summary
Dyrking nevrale explants fra dissekert
Abstract
Den komplekse prosessen med axon veiledning er stor grad drevet av veksten membran, som er den dynamiske motile strukturen på spissen av den voksende axon. Under axon utvekst, må veksten kjegle integrere flere kilder til veiledning cue informasjon å modulere sin cytoskjelettet for å drive veksten kjegle fremover og nøyaktig navigere for å finne sine spesifikke mål en. Hvordan denne integrasjonen skjer på cytoskeletal nivået fortsatt voksende, og undersøkelse av cytoskeletal protein og effektor dynamikk innenfor veksten kjegle kan tillate klarlegging av disse mekanismene. Xenopus laevis vekst membranene er stor nok (10-30 mikron i diameter) for å utføre høy -oppløsning levende avbildning av cytoskeletal dynamikk (f.eks 2-4) og er lett å isolere og manipulere i en lab miljø i forhold til andre virveldyr. Frosken er en klassisk modell system for utvikling nevrobiologi studier og viktige tidlige innsikt i vekst kjegle microtubule dynamikk ble opprinnelig funnet ved hjelp av dette systemet 5-7. I denne metoden 8, er egg samlet og befruktet in vitro, injisert med RNA som koder for fluorescensmerket tagged cytoskeletal fusjonsproteiner eller andre konstruksjoner for å manipulere genekspresjon, og deretter tillatt å utvikle seg til nevralrøret scenen. Neural rør er isolert ved disseksjon og deretter dyrkes, og vekst kjegler på outgrowing neurites er avbildes. I denne artikkelen beskriver vi hvordan du utfører denne metoden, der målet er å kultur Xenopus laevis vekst kjegler for påfølgende høy oppløsning bildeanalyse. Mens vi gi eksempel på + TIP fusion protein EB1-GFP kan denne metoden brukes til en rekke proteiner for å belyse deres atferd innenfor veksten kjegle.
Protocol
Merk: Vi beskriver trinnene i de to første avsnittene bare i korthet, som utmerket protokoller med detaljert informasjon er publisert andre steder som fokuserer mer spesifikt på disse trinnene (f.eks 8-12). I tillegg har den generelle protokoll med å jobbe med Xenopus spinal nevroner i levende cellekultur er tidligere publisert i en detaljert metoder artikkel 8. Vi anbefaler å gjennomgå at artikkelen som et supplement til denne videoen, men her vi gir god nok informasjon til å kunne utføre og feilsøke nevralrøret disseksjon og plating protokoll i trinn 3.
1. In vitro-fertilisering av Xenopus egg
- Hente ut egg fra kvinnelige frosker som ble injisert med choriongonadotropin (400 enheter / frog) 12-18 time før egget samlingen. Samle egg i 1X Marcs Modifisert Ringer løsning (MMR) (0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1,0 mM MgSO 4, 2,0 mM CaCl 2, 5,0 mM HEPES, pH 7,4 9).
- Befrukte egg in vitro med hakket testikler, som beskrevet tidligere 9.
- Etter minst 20 minutter, fjern embryo gelé belegge ved inkubering embryoer i 2% cystein i 1X MMR (brakt til pH 7,8 med NaOH) i 3-5 min. Vask med 0.1X MMR (eller 0.1X MBS (modifisert Barth Saline, 1X oppskrift: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 2,5 mM NaHCO 3, 5 mM HEPES, pH 7,8)) 3 -5 ganger, og holde embryoer ved romtemperatur inntil injeksjoner, eller om ønsket, place embryoer ved 14-18 ° C for å bremse utviklingen.
2. Mikroinjeksjon av RNA
Merknad: mens vi utnytter RNA injeksjon her, disse teknikkene er ikke begrenset til RNA, og DNA, proteiner, eller modifiserte nukleinsyrer for genmanipulering kan også brukes og er beskrevet tidligere 12.
- Før eksperimentere, RNAS for merking cytoskeletal eller andre strukturer are transkribert fra lineariserte DNA maler ved hjelp av mMessage mMachine kit (Ambion). mRNAs krever en 5 'cap og en 3' polyadenylerings halen å markedsføre oversettelse og forhindre nedbrytning i embryoer. pCS2 + er et mest brukte vektor for dette formål, og transkripsjons kit inkluderer en cap analog under syntesen reaksjonen. Vi resuspendere transkriberes mRNA i nukleasefritt DDH 2 0, ved en lager konsentrasjon mellom 500 og 2000 ng / pl, etterfulgt av rask lagring ved -80 ° C. Før injeksjon fortynne RNA i DDH 2 0 til den riktige konsentrasjon for injeksjon. Som bare en liten volum vil bli injisert i embryoer, oppslemme i buffer er ikke nødvendig. Vår siste injeksjonen konsentrasjonen er vanligvis 50-200 pg / nl, avhengig konstruktet, og vi vanligvis vil injisere opptil 4 nl per embryo, selv om mange laboratorier tradisjonelt injisere opptil 10 nl, som er omtrent 1% av det totale volumet av et embryo. RNA kan være giftige ved høye doser, og den dose per embryo slekterlly spenner fra 10 pg til 1 ng, selv om opp til 5 ng kan tolereres avhengig av bestemt genet og renhet. Imidlertid, for avbilding protein lokalisering, bør det lavest mulige nivå injiseres for å unngå over-uttrykk artefakter. RNA for EB1-GFP i denne protokollen brukes på endelige beløpet på 250 pg per embryo.
- Forbered injeksjonsnåler ved å trekke kapillære med en nål avtrekker 9, til en spiss diameter på ~ 0,2 um. Med en Sutter P-87 avtrekker, bruker vi følgende innstillinger: 644 varme, trekk 125, hastighet 70, tid 250, men disse parametrene varierer avhengig av maskinen og må justeres på nytt etter endring av filament (vi bruker for øyeblikket en 2,5 mm firkantet boks glødetråd som er 2,5 mm bred). Under et mikroskop, bryte nålespissen med pinsett i vinkel for å generere en fjærpenn-lignende form. Det finnes andre metoder for å bryte og fylling injeksjonsnåler (for eksempel 11,12), men fyller vi nålen med RNA ved å plassere en liten dråpe (0,5 til 1 pl) til den bakre enden avnål. For microinjecting inn embryoer, er det en rekke kommersielt tilgjengelige innsprøytningssystemer, to av de mest vanlige er den Pico-injektoren (Medical Systems), og Nanoject (Drummond Scientific) (se 11 for mer informasjon). Vi bruker Medical Systems PLI-100 Pico-Injector, som bruker komprimert gass for et digitalt angitt tidsperiode for å levere konsistent nanoliter volumer. Injeksjonsvolum må kalibreres for hver ny mikropipette med en scene mikrometer, og injeksjon tid bør justeres for å oppnå ønsket mengde injisert RNA.
- Plass befruktede embryoer ved 1 - til 4-celle og inn i en plast parabolen inneholdende 5% Ficoll i 0.1X MMR. Holding embryoet på plass med en pinsett eller plassere på et oppbevaringssted plattform (en plast mesh, med en ~ 1 mm rutenett, overholdt bunnen av tallerken med plasticine eller dental voks), injisere ønsket volum til dyr blastomeres (se trinn 2,1 for detaljer vedrørende injeksjonsvolumer). Distribuere i flere locasjon hele fosteret, til minst en injeksjon i hver av de animalske blastomeres skaffe jevnere fordeling (for eksempel, for en 4-celle embryo, vi vanligvis injisere 1-2 ganger i hver blastomere, mens i en 2-celle stadiet embryo, injiserer vi 2-4 ganger i hver blastomere). En fordel med å vente til 2-4 celle stadiet er at du sikrer fosteret har begynt å holde seg normalt. Men hvis tid er kjernen, kan du starte på en celle scenen, med liten forskjell i sluttresultatet enn flere embryoer som trenger å bli injisert. Eldre stadium embryo kan brukes i tillegg, og dette er spesielt nyttig hvis bestemte celletyper er målrettet for injeksjon, men som vi vanligvis foretrekker mer fleksible uttrykk, injiserer vi i yngre embryo for å redusere behovet for mer tallrike injeksjoner.
- Overføre injisert embryo til en plastisk tallerken med 0.1X MMR og tillate dem å utvikle seg til scenen 20-23 13. Inkuber embryoer på 14 til 22 ° C avhengig ønsket SPEed av utviklingen. (For dissekere nevrale rør neste dag, bruker ~ 22 ° C. For dagen etter, bruk ~ 14 ° C.)
3. Neural Tube Dissection og Plating
- Før du utfører de disseksjoner, forberede kultur retter 14. Først, belegge dekkglass med nok oppløsning av 200 pg / ml poly-lysin i PBS til bassenget over overflaten av dekkglasset, av enten Mattek eller lab-Tek kultur retter, og inkuber i én time (alternativt kan man bruke glass dekkglass sitter løs i en petriskål, for senere plassering på glassplater for avbildning og immunocytokjemi). Aspirer og vask med et overskudd av PBS 3 ganger, og la tørke. Overstryk retter med 10 ug / ml laminin i PBS (vi vanligvis benytte 500 pl per dekkglass, nok til bassenget over overflaten) i én time ved 37 °. Aspirer laminin løsning og vask 3 ganger med et overskudd av PBS, være forsiktig med å la laminin flater blir eksponert for luft-grensesnittet. Utskiftinge PBS med kultur media (50% Ringers, 49% L-15 media, 1% føtalt bovint serum, pluss 50 pg / ml penicillin / streptomycin og gentamycin, pH 7,4 og filter sterilisert). (Ringers Media, 115 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl-2, 10 mM Hepes pH 7,4, 0,5 mM EDTA). Mens vår protokoll bruker dette mediet, bør det bemerkes at dette er en beriket media vanlig for eldre Xenopus retinal ganglion kulturer, hvor nervecellene har redusert energi reservert. Unge ryggmargen kulturer vil overleve og vokse i mer enn 24 timer i ren Ringers for medier uten ekstra vekstfaktorer, og dette er faktisk en av fordelene med å bruke dette systemet. Valgfritt: Legg NT3 og BDNF (endelige konsentrasjoner av 25 ng / ul hver) til kultur media for å øke axon utvekst.
- På grunn av variasjonen i uttrykket av injisert mRNA, kan embryoene viser en mosaikk av fluorescens. Før gjennomføring disseksjoner, skjermen embryoer for tilstedeværelse av fluorescens, å identifisere de embryoer som exprykk den fluorescerende fusjonsprotein i nevralrøret. Plasser fluorescerende embryoer på scenen 20-23 i en agarose-belagt plast parabolen fylt med Steinbergs medier (58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca (NO 3) 2, 1,3 mM MgSO 4, 4,6 mM Tris, pH til 7,8 og deretter autoklaverte) 5. For å gjøre agarose-belagt parabolen, frakk bunnen av plast tallerken med smeltet 1% agarose i 0.1X MMR og la stivne. Dette gir en myk overflate slik at skader ikke oppstår til de fine pinsett og tungsten nåler som brukes i løpet av de påfølgende disseksjon trinn. Disseksjon av embryoer utover stadium 23 er mulig, men det er mer utfordrende som vev overholde tettere til hverandre og dermed kreve lengre behandling med kollagenase.
- Under en dissekere omfang, fjerne vitelline membran med fine pinsett, og deretter isolere hele dorsal del av embryoet, ved å gjøre en rekke snitt. Mens en pinsett holder embryo på plass, bruker du andre til å gjøre et snitt påside av embryoet å eksponere det hule indre. Deretter bruker begge tang for å klemme sammen vevet mellom dorsal og ventral halvdelen av embryo, og dermed kutte fosteret i to for å isolere dorsal del inneholder nevralrøret.
- Plasser dorsal eksplantasjon i en Eppendorf-rør med 2 mg / ml kollagenase i Steinbergs medier for 15-20 min på en rotator, for å løsne vev, og deretter pipette dorsal eksplantasjon inn i en plast-belagt agarose tallerken med fersk Steinbergs løsning. Alternativt kan eksplantasjon plasseres i en petriskål som inneholder kollagenase løsningen i 15 minutter, hvor hele disseksjon kan deretter utføres.
- Ved hjelp av en pinsett, forsiktig dissekere nevralrøret fra dorsal epidermis og ventrale notochord. Skyv tuppen av tang mellom epidermis og underliggende vev og sakte trekke tilbake epidermis, avslører nevralrøret under. Deretter bruker en pinsett for å holde vevet og et annet for å skyve spissen mellomnevralrøret og notochord. Slutt bruker tang å fjerne somites på hver side av røret.
- Overfør nevralrøret til en agarose-belagt parabolen fylt med dyrkningsmedier, som beskrevet i trinn 3.1.
- Etter samling av flere nevrale rør, skjær dem i mange biter (ca 20, hvis hele røret er isolert) med skjerpet tungsten nåler eller tang, og deretter plate bitene i kultur retter fylt med medium (utarbeidet i trinn 3.1), utspredning de explants jevnt i rader.
- Etter plating, ikke flytter retter fordi dette ville forstyrre de feste celler. Inkuber belagt nevralrørsdefekter explants rundt 20-22 ° C. Vi vanligvis forlater rett av celler på benken i romtemperatur over natten. En av fordelene med Xenopus laevis nevroner er at en spesiell inkubator for cellekultur som regulerer CO 2 nivåer eller temperatur ikke er nødvendig. Neurites og vekst kjegler kan observeres og avbildes ved romtemperatur 12-24 Hr etter plating, selv utvekst kan akselereres med tillegg av vekstfaktorer. Generelt vil ekspresjon av et RNA-eller plasmid produkten føre variabeluttrykk mellom celler, og dermed kan det være en rekke av fluorescence uttrykket nivåer mellom vekst kjegler. Vi har observert RNA uttrykk for fluorescerende proteiner til å vedvare utover 48 timer etter plating, men dette avhenger av den aktuelle konstruksjonen.
4. Representant Resultater
Etter å ha fulgt protokollen, som er oppsummert i figur 1A, vil sunne, fullstendig-dissekert og dyrket nevrale eksplanter sender ut mange axoner eller neurites i alle retninger på laminin / poly-lysin substrat, vist i figur 1B. Veksten kjegler på tuppen av axoner kan avbildes ved enten DIC optikk, som vist på figur 1C i bildet samlede motilitet dynamikk, eller høy oppløsning fluorescens mikroskopi å undersøke localization av fluorescensmerket-taggede cytoskeletal proteiner, for eksempel, er EB1-GFP vist i figur 1D.
Figur 1. Oppsummering av eksperimentell protokoll og forventede resultatet. A) Protokoll flytskjema. Se filmen for detaljer om disseksjon på dag 3. Hele nevralrøret bør kuttes i ca 20 like store biter og spres ut jevnt i rader på dekkglasset. I denne tegnefilmen er saks avbildet å representere kutte vev med fine tang. CG koriongonadotropin B) DIC bilde av axoner eller neurites vokser ut av eksplantering (eksplantering øverst i venstre hjørne). C) Høyere forstørrelse bilde av veksten kjegle på tuppen av en voksende axon. D) Fluorescensmikroskopi bilde av EB1-GFP i vekst kjegle. Målestokk 10 mikrometer. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Xenopus laevis nevrale explants sende ut neurites i en svært robust måte med 24 timer etter plating på laminin / poly-lysin substrat hvis forholdene ligger til rette. Med dette substrat, vekst kjegler er svært motile og kan oppnå axon lengder opp til 1 mm, som strekker seg i alle retninger utover fra eksplantasjon, selv om typiske lengder er 100 mikrometer eller mer. Hvis neurites ikke vokse ut, det er et begrenset antall grunner for at dette skal være tilfelle. En mulighet er at de nevrale explants ikke riktig holder seg til parabolen. Sørg for å ikke forstyrre vedlegg ved et uhell flytte rett etter plating. Sørg også for at laminin-og poly-lysin-belagt retter ble gjort riktig med alle nylagde reagenser. En annen mulighet for manglende utvekst er at cellekulturmedier forhold kan ikke være optimal. Dobbeltsjekke protokoll og beregninger for å sikre at alle medieløsninger er riktig formulert. Endelig er det mulig atembryo hvorfra explants ble innhentet kan være usunn, men hvis embryo kan utvikle seg til nevralrøret scenen, dette er mindre sannsynlig å være problemet. Men det er best å holde noen hele intakte fostre dyrket i 0.1X MMR sammen med disseksjoner å sikre at fortsatt utvikling oppstår.
Den mest kritiske trinnet i denne protokollen er nevralrøret disseksjon. Sammenlignet med mange modell system embryo mikro-disseksjoner, er dette en relativt enkel teknikk og Xenopus laevis embryoer er en av de største og mest tilgivende av organismer for dissekere. Men hvis eksperimentator er helt nytt for å utføre embryonale disseksjoner, kan dette trinnet ta flere timer å perfeksjonere (best spredt ut over 2-3 økter). Etter collagenase behandling, noen foretrekker å neste fjerne mesoderm notochord og somites, etterfulgt av epidermis, og dermed resulterer i det isolerte nevralrøret, mens andre foretrekker å begynne med epidermis fjerning og deretterseparere de andre vev fra nevralrøret. Det anbefales å prøve begge metoder for å bestemme hva som fungerer best for den enkelte forsker. Vær også forsiktig med å ikke legge for mye press på nevralrøret under isolasjonen. Det er bedre å fjerne de andre vev fra nevralrøret stedet for renere nevralrøret fra andre vev, for å redusere spenningen på røret og hindre den fra fragmentering tidlig. Til slutt, hvis omkringliggende vev er for tilhenger til nevralrøret, deretter plassere eksplantasjon tilbake i kollagenase løsningen i flere minutter. Dette vil gjøre separasjon av nevralrøret fra omkringliggende vev, spesielt epidermis, mye enklere. Lengden på collagenase behandling avhenger av stadium av embryoet, som eldre embryoer krever lengre behandlinger, opptil 45 minutter eller mer for scenen 28 embryoer.
I tillegg til dyrking nevralrørmisdannelse eksplanter, kunne nevrale rør også være dissosiert før plating, in order til bilde enkeltceller. Protokoller for denne metoden er beskrevet i 8, 15. En fordel med denne metoden er at neuronal morfologi og neurite lengde kan bli undersøkt, som cellen kroppen ikke skjules inne i eksplantasjon. Videre kan nevrale eksplanter også dyrkes på ulike mønstrede underlag. For eksempel, har den veiledning stikkordet "stripe assay" blitt brukt for å vurdere endringer i veksten cone dynamikk i respons til støter substrat grenser i 16 kultur, 17. En detaljert protokoll for fremstilling stripete mønster av signaler er blitt beskrevet 18. Dette kan gi rom for analyse av cytoskeletal dynamikk mens veksten kjegle gjennomgår veiledning cue styring beslutninger.
Det er en rekke fordeler ved å bruke Xenopus laevis for nevrale eksplantering dyrking eksperimenter. Sammenlignet med andre systemer, dyrking disse primære nevronene er relativt enkelt å få tak i og krever lave kostnader. Som de kan dyrkes og avbildes ved romtemperatur,dyre inkubatorer er ikke nødvendig. Xenopus embryo er lett tilgjengelig og kan fås i store mengder, utvikler de seg raskt, og de er store nok til å dissekere med minimal opplæring. Således er dette systemet spesielt egnet for undervisnings laboratorier.
En annen fordel med å bruke frosk embryoer er at de er mottagelig for manipulasjoner av genet, mRNA, eller protein expression nivåer, avhengig av behovene til et spesielt eksperiment. For eksempel, er en fordel med å bruke mRNA som konsentrasjonen og injeksjonsvolumet kan titreres forsiktig å kontrollere den resulterende uttrykket nivå, mens injisere DNA, på den annen side, gir mulighet for etablering av transgene embryoer hvor genekspresjon kan kontrolleres av romlig eller temporal promoter (f.eks 19). Dermed kan denne nevrale eksplantasjon metoden brukes for flere situasjoner for å forstå virkemåten og funksjon av proteiner-of-interesse under axon utvekstog vekst kjegle dynamikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Bob Freeman for trening og Kirschner lab for bruk av frosken anlegget, og medlemmer av Van Vactor lab for støtte. Vi takker Nikon Imaging Center ved Harvard Medical School for å få hjelp med lysmikroskopi for bildene i Figur 1. Dette arbeidet ble finansiert av følgende: NRSA NIH fellesskap og NIH K99 fellesskap å LAL, Basic Science Partnership finansiering ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) til AEF, og NIH RO1 NS035909 til DVV
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Labs | C-HCG-ON-10 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 | |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 | |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC, Inc. | 30-31-0 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 | |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P-1399 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| NT3 | Sigma-Aldrich | N1905 | |
| BDNF | Sigma-Aldrich | B3795 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).
- Lee, H. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 42, 913-926 (2004).
- Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones. Dev. Neurobiol. , (2011).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).
- Tanaka, E., Kirschner, M. W. The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries. J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).
- Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).
- Gomez, T. M. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females. J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).
- Lavery, D. L., Hoppler, S. Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus. Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Guirland, C. Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).
- Turney, S. G., Bridgman, P. C. Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity. Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).
- Weinl, C. On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5. Development. 130, 1635-1643 (2003).
- Knoll, B. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).
- Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos. Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).
