Neurala Explantation kulturer från<em> Xenopus laevis</em
Summary
Odling neurala explantat från dissekeras<em> Xenopus laevis</em> Embryon som uttrycker fluorescerande fusionsproteiner medger avbildning av cytoskelettala tillväxt kon dynamik.
Abstract
Den komplexa processen att axonet vägledning till stor del driven av tillväxt konen, vilket är den dynamiska rörliga strukturen på spetsen av den växande axonet. Under axonet utväxt, måste tillväxten konen integrera flera källor för vägledning kö information modulera sin cytoskelettet för att driva tillväxten konen framåt och exakt navigera för att hitta de särskilda målen 1. Hur denna integration sker på cytoskelett nivån fortfarande fram, och granskning av cytoskelett protein och effektor dynamiken inom tillväxt konen kan tillåta att klarlägga dessa mekanismer. Xenopus laevis tillväxt koner är tillräckligt stora (10-30 mikrometer i diameter) för att utföra hög upplösning levande avbildning av cytoskelettala dynamik (t.ex. 2-4) och är lätta att isolera och manipulera i ett labb miljö jämfört med andra ryggradsdjur. Grodan är en klassisk modell för utvecklings neurobiologi studier och viktiga tidiga insikter tillväxt konen mikrofonrotubule dynamik ursprungligen hittas med hjälp av detta system 5-7. I denna metod 8, ägg uppsamlas och befruktas in vitro, injicerades med RNA som kodar fluorescerande märkta cytoskelettala fusionsproteiner eller andra konstruktioner för att manipulera genuttryck, och fick sedan utvecklas till neuralröret stadiet. Neurala rör isoleras genom dissektion och sedan odlas och tillväxt kottar på var större än neuriter avbildas. I den här artikeln beskriver vi hur du utför denna metod vars mål är att kultur Xenopus laevis tillväxt koner för efterföljande högupplöst bildanalys. Medan vi ger exempel + TIPS fusionsprotein EB1-GFP, kan denna metod tillämpas på ett antal proteiner för att belysa deras beteenden inom tillväxt konen.
Protocol
Discussion
Xenopus laevis neurala explantat skicka ut neuriter i ett mycket robust sätt genom 24 timmar efter plätering på laminin / poly-lysin substrat om förhållandena är lämpliga. Med detta substrat, tillväxt koner är mycket rörliga och kan uppnå axon längder upp till 1 mm, som sträcker sig i alla riktningar utåt från explantatet, fastän typiska längder är 100 um eller mer. Om neuriter inte växer ut, det finns ett begränsat antal skäl till detta vara fallet. En möjlighet är att de neurala explant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Bob Freeman för utbildning och Kirschner labbet för användning av grodan anläggningen och medlemmar av Van Vactor labbet för support. Vi tackar Nikon Imaging Center vid Harvard Medical School för att få hjälp med ljusmikroskop för bilderna i figur 1. Detta arbete har finansierats av följande: NRSA NIH gemenskap och NIH K99 gemenskap till LAL, Basic Science Partnership finansiering ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) till AEF, och NIH RO1 NS035909 till DVV
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | C-HCG-ON-10 |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 |
| mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 |
| Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 |
| Ficoll | Sigma | F2637 |
| Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 |
| Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C |
| L-15 | Invitrogen | 21083-027 |
| Poly-l-lysine | Sigma | P-1399 |
| Laminin | Sigma | L2020 |
| NT3 | Sigma | N1905 |
| BDNF | Sigma | B3795 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Buck, K. B., Zheng, J. Q. Growth cone turning induced by direct local modification of microtubule dynamics. J. Neurosci. 22, 9358-9367 (2002).
- Lee, H. The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance. Neuron. 42, 913-926 (2004).
- Santiago-Medina, M., Myers, J. P., Gomez, T. M. Imaging adhesion and signaling dynamics in Xenopus laevis growth cones. Dev. Neurobiol. , (2011).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. J. Cell Biol. 115, 345-363 (1991).
- Tanaka, E., Kirschner, M. W. The role of microtubules in growth cone turning at substrate boundaries. J. Cell Biol. 128, 127-137 (1995).
- Tanaka, E., Ho, T., Kirschner, M. W. The role of microtubule dynamics in growth cone motility and axonal growth. J. Cell Biol. 128, 139-155 (1995).
- Gomez, T. M. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual 2010. , (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females. J. Vis. Exp. (18), e890 (2008).
- Mimoto, M. S., Christian, J. L. Manipulation of gene function in Xenopus laevis. Methods Mol. Biol. 770, 55-75 (2011).
- Lavery, D. L., Hoppler, S. Gain-of-function and loss-of-function strategies in Xenopus. Methods Mol. Biol. 469, 401-415 (2008).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus Laevis (Daudin). , (1994).
- Guirland, C. Direct cAMP signaling through G-protein-coupled receptors mediates growth cone attraction induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide. J. Neurosci. 23, 2274-2283 (2003).
- Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641-1645 (1976).
- Turney, S. G., Bridgman, P. C. Laminin stimulates and guides axonal outgrowth via growth cone myosin II activity. Nat. Neurosci. 8, 717-719 (2005).
- Weinl, C. On the turning of Xenopus retinal axons induced by ephrin-A5. Development. 130, 1635-1643 (2003).
- Knoll, B. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat. Protoc. 2, 1216-1224 (2007).
- Wheeler, G. N., Hamilton, F. S., Hoppler, S. Inducible gene expression in transgenic Xenopus embryos. Curr. Biol. 10, 849-852 (2000).
