Dyrking nevrale explants fra dissekert<em> Xenopus laevis</em> Embryo som uttrykker fluorescerende fusjonsproteiner tillater avbildning av vekst cone cytoskeletal dynamikk.
Den komplekse prosessen med axon veiledning er stor grad drevet av veksten membran, som er den dynamiske motile strukturen på spissen av den voksende axon. Under axon utvekst, må veksten kjegle integrere flere kilder til veiledning cue informasjon å modulere sin cytoskjelettet for å drive veksten kjegle fremover og nøyaktig navigere for å finne sine spesifikke mål en. Hvordan denne integrasjonen skjer på cytoskeletal nivået fortsatt voksende, og undersøkelse av cytoskeletal protein og effektor dynamikk innenfor veksten kjegle kan tillate klarlegging av disse mekanismene. Xenopus laevis vekst membranene er stor nok (10-30 mikron i diameter) for å utføre høy -oppløsning levende avbildning av cytoskeletal dynamikk (f.eks 2-4) og er lett å isolere og manipulere i en lab miljø i forhold til andre virveldyr. Frosken er en klassisk modell system for utvikling nevrobiologi studier og viktige tidlige innsikt i vekst kjegle microtubule dynamikk ble opprinnelig funnet ved hjelp av dette systemet 5-7. I denne metoden 8, er egg samlet og befruktet in vitro, injisert med RNA som koder for fluorescensmerket tagged cytoskeletal fusjonsproteiner eller andre konstruksjoner for å manipulere genekspresjon, og deretter tillatt å utvikle seg til nevralrøret scenen. Neural rør er isolert ved disseksjon og deretter dyrkes, og vekst kjegler på outgrowing neurites er avbildes. I denne artikkelen beskriver vi hvordan du utfører denne metoden, der målet er å kultur Xenopus laevis vekst kjegler for påfølgende høy oppløsning bildeanalyse. Mens vi gi eksempel på + TIP fusion protein EB1-GFP kan denne metoden brukes til en rekke proteiner for å belyse deres atferd innenfor veksten kjegle.
Xenopus laevis nevrale explants sende ut neurites i en svært robust måte med 24 timer etter plating på laminin / poly-lysin substrat hvis forholdene ligger til rette. Med dette substrat, vekst kjegler er svært motile og kan oppnå axon lengder opp til 1 mm, som strekker seg i alle retninger utover fra eksplantasjon, selv om typiske lengder er 100 mikrometer eller mer. Hvis neurites ikke vokse ut, det er et begrenset antall grunner for at dette skal være tilfelle. En mulighet er at de nevrale explants ikke …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Bob Freeman for trening og Kirschner lab for bruk av frosken anlegget, og medlemmer av Van Vactor lab for støtte. Vi takker Nikon Imaging Center ved Harvard Medical School for å få hjelp med lysmikroskopi for bildene i Figur 1. Dette arbeidet ble finansiert av følgende: NRSA NIH fellesskap og NIH K99 fellesskap å LAL, Basic Science Partnership finansiering ( https://bsp.med.harvard.edu/ ) til AEF, og NIH RO1 NS035909 til DVV
Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | C-HCG-ON-10 |
Cysteine | Sigma-Aldrich | 52-90-4 |
mMessage mMachine kit | Ambion | AM1340 |
Capillary Borosil Needles 1.2 mm (OD) x 0.9 mm (ID) | FHC | 30-31-0 |
Ficoll | Sigma | F2637 |
Dumont #5 Biologie Inox Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 |
Collagenase | Sigma-Aldrich | 9001-12-1 |
Mattek dishes | Mat Tek Corporation | P35G-1.5-14-C |
L-15 | Invitrogen | 21083-027 |
Poly-l-lysine | Sigma | P-1399 |
Laminin | Sigma | L2020 |
NT3 | Sigma | N1905 |
BDNF | Sigma | B3795 |