Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

استهدفت وصفها من الخلايا العصبية في المجال الوظيفي محددة من القشرة المخية الحديثة مايكرو من خلال الجمع بين الإشارات الجوهرية والتصوير ثنائي الفوتون

Published: December 12, 2012 doi: 10.3791/50025
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience, Medical University of South Carolina

Summary

يوصف أسلوب لوصفها الخلايا العصبية مع الأصباغ الفلورية في المجالات المحددة سلفا الصغيرة وظيفية من القشرة المخية الحديثة. أولا، يتم استخدام التصوير الجوهرية الإشارات الضوئية للحصول على خريطة وظيفية. ثم يتم استخدام اثنين من الفوتون المجهري لتسمية الخلايا العصبية والصورة ضمن مجال الصغيرة من على الخريطة.

Abstract

في القشرة البصرية الأولية غير القوارض الثدييات، وتتجمع الخلايا العصبية وفقا لتفضيلهم لميزات مثل التحفيز التوجه 1-4، الاتجاه 5-7 و هيمنة العين والتفاوت مجهر 8،9 9. الانتقائية التوجه هو السمة الأكثر دراسة على نطاق واسع وخريطة المستمر مع تخطيط شبه دورية لتوجيه المفضل موجود في القشرة البصرية الأولية 10،11 كامل. دمج مساهمات متشابك، وشبكة الخلوية التي تؤدي إلى تحفيز استجابات انتقائية في هذه الخرائط وظيفية يتطلب التهجين من تقنيات التصوير التي تمتد الفرعية ميكرون إلى المقاييس المكانية ملليمتر. مع الإشارة التقليدية التصوير الضوئي الجوهرية، يمكن تحديد تخطيط الشامل للخرائط وظيفية عبر كامل سطح القشرة البصرية 12. تطوير مجهر ثنائي الفوتون في الجسم الحي باستخدام الأصباغ الكالسيوم الحساسة تمكن واحد لتحديد synaptجيم إدخال تصل إلى العمود الفقري شجيري الفردية 13 أو سجل نشاط في وقت واحد من مئات الأفراد أجسام الخلايا العصبية 6،14. وبناء على ذلك، والجمع بين التصوير الجوهرية إشارة للقرار الفرعية ميكرون المكاني للثنائي الفوتون المجهري يوفر إمكانية تحديد بالضبط التي شرائح والخلايا الجذعية تسهم إلى المجال الجزئي من أي خريطة وظيفية في القشرة المخية الحديثة. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة ذات الإنتاجية العالية للحصول على الخارطة بسرعة التوجه القشرية واستهداف محدد الصغيرة النطاق في هذه الخريطة الوظيفية لوصفها الخلايا العصبية مع الأصباغ الفلورية في الثدييات غير القوارض. مع المجهر نفسها التي استخدمت لمدة الفوتون التصوير، ونحن أولا توليد خريطة التوجه باستخدام التصوير الجوهرية الإشارات الضوئية. ثم نعرض كيفية استهداف الدقيقة مجال الاهتمام باستخدام micropipette محملة صبغة إما تسمية عدد سكانها أجسام الخلايا العصبية أو العصبونات تسمية واحدة بحيث التشعبات، والعمود الفقري محاور عصبية واضحة فيالجسم الحي. لدينا أكثر من التحسينات الطرق السابقة تسهيل دراسة العلاقات هيكل الوظائف العصبية مع شبه الخلوية القرار في إطار البنى الوظيفية القشرة المخية الحديثة.

Protocol

1. إعداد الجراحية

  1. حمل التخدير ورصد معدل ضربات القلب بشكل مستمر، وإنهاء المد والجزر CO 2، EEG، ودرجة الحرارة. تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتبعة في رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام من جامعة ساوث كارولاينا الطبية واستندت على تلك التي سبق نشرها 9،15.
  2. كشف السطح الظهري من الجمجمة عن طريق قطع الجلد بشفرة المشرط. تشريح الأنسجة الضامة التي تغمر العظام باستخدام مجرفة Brudon. تنظيف العظام باستخدام أدوات تطبيقها القطن والشاش والقطن ذات الرؤوس. تطبيق الشمع العظام (حسب الحاجة) في الجمجمة ووقف النزيف في بعض الأحيان من خلال الأوردة مبعوث الصغيرة.
  3. إرفاق التيتانيوم المقاوم للصدأ أو الفولاذ لوحة لرئيس الجمجمة (فوق منطقة ذات أهمية حيث سيتم تنفيذ حج القحف) باستخدام الاسمنت الأسنان مختلطة مع الطلاء الأسود (انظر المواد). A افتتاح مستطيل في وسط لوحة الرأس وصولا لحج القحف والتصوير الضوئي. إرفاق غرفة معدنية على الجزء العلوي من لوحة الرأس. وهذه القاعة بمثابة خزان السائل للتصوير بهدف عدسة المياه الغمر.
  4. تأمين لوحة الرأس إلى مرحلة XY باستخدام المشاركات المعادن.
  5. رقيقة مساحة كبيرة من العظام داخل فتح مستطيلة من headplate باستخدام الحفر الأسنان. يجب على المنطقة المراد ضعيفة تمتد إلى ما وراء حدود حج القحف المخطط لها. يجب أن ضعفت الجمجمة سميكة من غير الثدييات إذا القوارض إلى صور عالية الدقة يمكن الحصول عليها من القشرة المخية الحديثة لأنه في موقع حج القحف، والعظام وسمك تملي سمك الاغاروز بين ساترة وسطح القشرة المخية الحديثة (انظر أدناه) .
  6. حفر 2 × 2 مم مربع مخطط في العظام لحج القحف. شطف الغرفة دوريا مع السائل المخي الشوكي الطازجة الاصطناعي (ACSF) لإزالة شظايا العظام وتقليل تبديد الحرارة إلى القشرة الأساسية. تطبيق الشمع العظام حسب الحاجة، لوقف النزيف في بعض الأحيان.
  7. ليفر رفرف العظام مع ملقط # 3.
  8. إزالة كافة ولكن الطبقة السفلية من الجافية باستخدام ملقط غرامة (# 5CO) ومقص الربيع Vannas. والدرة في غير الثدييات القوارض سميكا وغير شفاف ولكن يمكن إزالتها في طبقات متميزة. النزيف أمر نادر الحدوث ولكن يمكن وقفها مع جلفوم وينبغي إزالة أي بقايا الدم برفق من الطبقة المتبقية من استخدام ملقط الجافية والشطف مع ACSF. الطبقة الأخيرة من دورا يتسم بالشفافية والأوعية حنوني ينبغي أن تكون واضحة للعيان من خلال ذلك. وترك هذه الطبقة النهائية من خلال التصوير الجافية سليمة إشارة جوهرية تزيد من نسبة نجاح التحميل الجزء الأكبر من مؤشرات الكالسيوم الفلورية للمرحلة اللاحقة التصوير ثنائي الفوتون من التجربة (انظر المناقشة).
  9. تطبيق قطرة دافئة الاغاروز 2٪ (الذائبة في ACSF) وعلى الفور وضع ساترة خلال حج القحف. تحقق من حج القحف لضمان أن نبضات القلب والأوعية الدموية في الجهاز التنفسي وتكاد تكون معدومة باستخدام الميكروسكوب الجراحي أو تشريح oculars حل الدولتين،الفوتون المجهر في مجال وضع مشرق.

2. الجوهرية الإشارات الضوئية التصوير

  1. إضافة هلام الرغوة غارقة مع ACSF حول السطح الخارجي للساترة لمنع الاغاروز من الجفاف خلال التصوير إشارة الذاتية.
  2. إرفاق الذاتية كاميرا CCD التصوير إشارة إلى ميناء جبل معيار C-على رأس المجهر ثنائي الفوتون (الشكل 1). وضع مصدر إضاءة الضوء على الجدول جوية قرب مرحلة س ص (الشكل 1A). موقف وتأمين أدلة الضوء على حج القحف وheadplate / غرفة (1B الشكل). التراجع عن مزدوج اللون الأساسي والمرآة دون ميناء جبل C-بحيث الضوء المنعكس الأحمر اللازمة لإشارات جوهرية سوف تمر مباشرة من حج القحف إلى الكاميرا CCD (الشكل 1C-D). الهدف باستخدام الهواء 4X (0.13 NA، 17 مم WD)، وحقل 2 × 2 مم للعرض متاح للتصوير إشارة الذاتية.
  3. إدراج مرشح الحرارة في لآيت الطريق لمنع القشرة من التدفئة. استخدام التصفية التي يمر الضوء الأخضر (546 نانومتر مركز λ) وتسجيل صورة مرجعية رقمية في الأوعية الدموية السطحية القشرية.
  4. نقل التركيز إلى 500 ميكرومتر Z تحت السطح القشري. استخدام عامل تصفية الحمراء (630 نانومتر مركز λ) لإلقاء الضوء على قشرة لقياس الإشارات الجوهرية. وضع أدلة ضوء بحيث يتم مضيئة بشكل موحد على السطح القشري. درع حج القحف من ضوء الشاشة التي تنتجها التحفيز البصري. تقديم سلسلة من المحفزات البصرية والصور سجل بيانات الانعكاس. لإنشاء خريطة التوجه في غضون 10 دقيقة، وجمع البيانات الموافق 4 التكرار من سلسلة من 8 منبهات (4 التوجهات والاتجاهات اثنين لكل اتجاه).
  5. تحليل البيانات الجوهرية لتوليد إشارة التوجه اللون كاذبة الخريطة. حدد المناطق المستهدفة المحتملة للثنائي الفوتون توسيم الخلايا العصبية، على سبيل المثال، والتوجه شخصياته الدولاب على الهواء - نقطة في الخريطة مكانجميع التوجهات تلتقي المفضل (الشكل 2A). تراكب الخريطة التوجيه وصورة الأوعية الدموية السطحية القشرية (الشكل 2B-C). استخدام تخطيط من المجالات الوظيفية وموقع سفن السطح الكبيرة لتحديد الهدف، وتجنب المواقع مع الأوعية الدموية الكبيرة والشرايين 15.

3. تحميل الجزء الأكبر من مؤشرات الكالسيوم نيون

  1. إعداد حل بلورونيك 20٪ / DMSO بإضافة 1 غرام في 5 بلورونيك DMSO ميكرولتر. تسخين الخليط في 60 ° C لمدة 10 دقيقة على حل تماما بلورونيك. يسمح هذا الخليط ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة. إضافة 4 ميكرولتر من خليط بلورونيك / DMSO إلى قارورة ميكروغرام 50 من الكالسيوم مؤشر الفلورية الخضراء ولاية أوريغون 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). ثم يضاف 1 ميكرولتر من صبغة حمراء (اليكسا فلور 594، 2 محلول المخزون ملي) و 35 ميكرولتر من حل ماصة (انظر المواد) لتركيز النهائي من 1 ملم OGB-1 AM. يصوتن الحل ل½ ساعة فيحمام المياه المبردة وأجهزة الطرد المركزي ثم 0،45 ميكرون مع فلتر لإزالة الشوائب.
  2. سحب ماصة تفتق طويل مع قطر تلميح الخارجي من 2،0-2،5 ميكرومتر. تحميل 5 ميكرولتر من خليط الصبغة في ماصة.
  3. إزالة الطبقة النهائية من دورا لتسهيل ماصة الإدراج والحصول على أعلى جودة لمدة الفوتون الصور.
  4. تحديد المكان المحدد على سطح القشرية التي يجب أن توضع في ماصة من أجل الوصول إلى هدفه في طبقة قشرية 2/3. هدفنا هو محدد سلفا القشرية التفرد الدولاب على الهواء في خريطة التوجه (الشكل 2). يجب أن تكون مدفوعة ماصة في القشرة بزاوية ° 30 لتمرير بين الجدار وغرفة الهدف. وهكذا، لتسمية المنطقة المستهدفة 200 ميكرومتر تحت السطح القشري، فإن موقف دخول ماصة على سطح القشرية يكون حوالي 350 ميكرون الجانبي إلى موقف الهدف (الشكل 3 AB).
  5. نقل المرحلة XY (التي الحيوان وعتوضع ipette مياداة مجهرية) إلى مركز إدخال السطح القشري موقف إطار الهدف (الشكل 3C). استخدام الهدف 20X 40X أو مع مسافة العمل (WD) ما لا يقل عن 3 مم (انظر المواد) للتأكد من أن ماصة ستدخل بسهولة القشرة دون لمس الهدف أو العظام على طول جدار حج القحف. مرة واحدة ويتركز موقف دخول في إطار الهدف، ورفع الموقف Z الهدف بنسبة 2 مم (الشكل 3D). مع برنامج التحصين الموسع، مضان أخضر فاتح تشغيل لتصور الأحمر اليكسا الصبغة في ماصة، استخدم محور مائل للمياداة مجهرية لنقل ماصة حتى يتركز طرفها (وركز) في إطار الهدف مباشرة فوق موقف سطح دخول القشرية ( الرقم 3E).
  6. خفض عموديا ماصة (على طول محور ض) حتى تصل إلى السطح ماصة القشرية (الشكل 3F)، في حين عرض مستمر من خلال طرف ماصة مكتب تعزيز الوحدةلارس من المجهر. باستخدام مشرق مجال الإضاءة، والدم سطح السفن والأغشية القشرية السحائي المتبقية (PIA والعنكبوتي) مرئية بسهولة كما ماصة تقترب من سطح القشرية. إذا كان ماصة لا يصل إلى موقف الإدخال المطلوب، ورفع ماصة وإعادة تقويم يعتمد على استهداف المعالم الأوعية الدموية على سطح القشرية.
  7. إزالة الهدف، الفتيل السائل النخاعي الزائد من حج القحف وتجفيف العظام المجاورة باستخدام الرماح امتصاص الخالي من الوبر. تطبيق قطرة دافئة الاغاروز 3٪ (الذائبة في ACSF) لتحقيق الاستقرار في القشرة التي مرئيا من خلال حج القحف (الشكل 3G). في القوارض غير، الاغاروز 3٪ من الضروري تخفيف نبضات لامتصاص نجاح الأصباغ الفلورية من الخلايا العصبية. للتصوير الضوئي إشارة الجوهرية 2٪ فقط وهناك حاجة لأن الاغاروز مزيج من الاغاروز 2٪ وساترة ويوفر الاستقرار اللازم. هنا، يتم استخدام أي ساترة للخطوة صبغة التحميل حتى 3٪ والاغاروزاللازمة. بعد الاغاروز وقد عززت، اضافة الى وجود الهدف 40X (0.8 NA، 3.3 مم WD) وإعادة ملء الغرفة مع ACSF.
  8. التحول من الميدان مشرق لاثنين من الفوتون عرض وتحديد موقع الطرف ماصة. باستخدام محور مائل للمياداة مجهرية، نقل ماصة حتى طرفها تصل إلى العمق المطلوب في القشرة (الشكل 3H). وأحيانا نفث طرد ضغط خليط الصبغة (أ PSI قليلة، كل 0،1 ثانية نبض) تساعد على منع الطرف ماصة من انسداد. لأن OGB-01:00 يصبح فقط مرئية عند دخول الخلايا، وصبغ أحمر اليكسا أمر بالغ الأهمية لرؤية غيض ماصة داخل القشرة.
  9. قبل محاولة تحميل الخلايا العصبية في طبقة قشرية 2/3 مع الجرعة الكاملة من الأصباغ، وإعادة تركيز الهدف على سطح القشرية لتأكيد عمق غيض ماصة والتأكد من أن الطرف هو في موقع الهدف على أساس تخطيط سفن السطح الدم. إذا كان في طبقة ماصة 2/3، وينبغي أن نفث صغيرة من الخليط صبغة تضيءخارج الخلية الفضاء وتكشف عن وجود الجمعية كثيفة من أجسام الخلايا الدائرية والظلال الداكنة.
  10. لتحميل أجسام الخلايا العصبية في القشرة مجال قطرها ميكرون 300-600، وضخ صبغة الخليط في الفضاء خارج الخلية باستخدام نبضات 30-90، كل 1،0 ثانية نبض، 2-10 رطل. ينبغي أن نبضات من الضغط لا تكون قوية لدرجة أن الأنسجة يتحرك. بعد اكتمال حقن، انتظر لدقيقة قليلة، ثم إزالة ماصة وموضوعية. الانتظار لمدة 1 ساعة للسماح للOGB-1 صباحا إلى اتخاذ يكون كاملا، من قبل الخلايا العصبية.
  11. إزالة الاغاروز المستخدمة في صبغ التحميل وشطف غرفة تسجيل. وضع قطرة صغيرة من 2-3٪ الاغاروز على السطح وسرعان ما وضع ساترة خلال حج القحف. لأن الأصباغ الفلورية هي حساسة للضوء، وتجنب الإفراط في تعريض القشرة إلى الميدان أو مشرق ضوء برنامج التحصين الموسع-الفلورسنت. اضافة الى وجود ارتفاع NA (1.0) 20X الهدف في ماسك الهدف وإعادة مركز المنطقة المسماة القشرية في إطار الهدف باستخدام المرحلة XY. درع من حج القحف السابقينمصادر الضوء traneous، على سبيل المثال، عرض الحوافز البصرية، وذلك باستخدام طبقات متعددة من مواد تعتيم.

4. وحيدة الخلية الصعق الكهربائي من الأصباغ نيون

  1. لدراسة التشكل شجيري، يعد الحل من 100 ميكرومتر اليكسا فلور 594 (1:20 التخفيف في ACSF من 2 ملي الأسهم اليكسا فلور 594). قد لتصوير الفنية للالتشعبات يمكن استخدام الملح OGB 16،17.
  2. سحب ماصة تفتق طويل مع حجم غيض من 1 ميكرومتر وتحميل 5 ميكرولتر من صبغة في ماصة. جميع الخطوات الأخرى استهدفت عمل المجال مماثلة لطريقة التحميل بالجملة (أرقام 1-3). لوضع تلميح ماصة مجاورة لغشاء الخلية العصبية الجسم، ورصد زيادة في مقاومة القطب وتطبيق نفث ضغط صبغ لإلقاء الضوء على الفضاء خارج الخلية ونرى أجسام الخلايا والظلال أثناء التصوير ثنائي الفوتون.
  3. عندما غيض ماصة المجاورة لغشاء الخلية العصبية الجسم، استخدم 800A Axoporator لتطبيق1-3 البقول (-8 إلى -10 V، 10 ميللي ثانية النبض). شغل الفوري للعصبون مع صبغ هو تصور بسهولة مع اثنين من الفوتون المجهري. إزالة ماصة وجمع صور عالية الدقة من التشعبات والمحاوير في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتوضيح دقة طرقنا وضع العلامات صباغة، استهدفت نحن أصغر الجزئي أي مجال وظيفي الخريطة المعروفة في القشرة المخية الحديثة غير القوارض. تتخللها قليلة في جميع أنحاء الخريطة التوجه في القشرة البصرية الأولية هي شخصياته. هذه النقاط التي تحدث في جميع الاتجاهات بحيث تتلاقى المفضلة في خرائط ملونة كاذبة من التوجه المفضل، والمناطق في جميع أنحاء نظرة التفرد مثل "دواليب الهواء" (الشكل 2A-B). تم تحديد واحدة الدولاب على الهواء في حج القحف لوضع العلامات صبغ (دائرة خضراء في الشكل 2C)، ويجري التأكد من تجنب السفن الكبيرة والشرايين في 15 خاصة. مع تحميل والجزء الأكبر من OGB 1-AM، تعقب التغييرات في الخلايا العصبية الكالسيوم مؤشر لمضان سلسلة من المحفزات البصرية الموجهة صريف يكشف خرائط القرار وحيدة الخلية وظيفية حول المزايا الفردية الدولاب على الهواء (الشكل 4). مع الصعق الكهربائي وحيدة الخلية، والتنظيم المكاني للمحورا وتشعبات عصبية من حيثيتم تحديد الخلايا العصبية التي تقع في إنجل وهي الوحدانية الدولاب على الهواء في الجسم الحي (الشكل 5).

الشكل 1
الشكل 1. يتم تنفيذ الجوهرية الإعداد إشارة التصوير الضوئي. (A) يتم وضع الحيوان على المسرح س ص والجوهرية التصوير إشارة عبر كاميرا CCD التي شنت على المجهر ثنائي الفوتون. يتم جلب مصدر الضوء والكمبيوتر المستخدمة للسيطرة على دورة التصوير لأكثر من الإعداد للتصوير الذاتية وابتعدت قبل مرحلة التصوير ثنائي الفوتون من التجربة يبدأ. (B) عن قرب نظرا للهدف 4x وإضاءة نانومتر من خلال 630 أدلة الضوء السائل. إما أدلة الخفيف الثنائي تعلق على المشاركات المعادن (يسار)، أو يمكن أن تستخدم حلقة واحدة تعلق على إلقاء الضوء على الهدف مباشرة (على اليمين). استخدام المواد التعتيم على حماية والهدف من مصادر خارجية للإضاءة، لا يظهر على سبيل المثال، عرض مرئي التحفيز، خلال جلسات التصوير الضوئي. (C) تخطيطي للمجهر ومسار الضوء في تكوين التقليدية التصوير ثنائي الفوتون. انظر الشكل رقم التكميلية. 20 في شن آخرون 2012 15 للحصول على وصف المسار الكامل ضوء ثنائي الفوتون. يتم وضع قابل للسحب مرآة لعكس ضوء الليزر من خلال مزدوج اللون وعلى القشرة. يتم نقل مزدوج اللون الأساسي، الذي يمر شعاع الليزر ويعكس الضوء المنبعث من القشرة إلى لPMT، في مسار الضوء من خلال تحويل برج التصفية. (D) للتصوير الذاتية وتراجع المرآة وتشغيل برج مرشح لنقل مزدوج اللون الأساسي للخروج من الطريق، مما يسمح للضوء مسار مباشر من القشرة إلى الكاميرا CCD. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

NT "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما ">

الشكل 2
الشكل 2. استخدام الخرائط الفنية التي تم الحصول عليها مع التصوير إشارة الجوهرية لتحديد مجال الصغيرة لوصفها الخلايا العصبية مع الأصباغ الفلورية. المكتسب (A) خريطة الاتجاه من Visual القط القشرة الأولية عن طريق التصوير الضوئي إشارة الجوهرية. لون كل بكسل يمثل التوجه المفضل في ذلك الموقع. وتظهر إمكانات شخصياته الدولاب على الهواء التوجه مناسبة لوصفها الخلايا العصبية مع الأصباغ الفلورية داخل الدوائر السوداء. (B) مضافين ان خريطة القشرية الأوعية الدموية السطحية مع خريطة التوجه. (C) دواليب الهواء داخل الدوائر الحمراء بالقرب من الأوعية الدموية الكبيرة أو الشرايين وما إلى ذلك يتم اختيار موقع الدولاب على الهواء داخل الدائرة الخضراء كهدف لوضع العلامات صباغة. المستطيل متقطع يتوافق مع المنطقة هو مبين في الشكل 3B. مقياس بار في (A) 500 ومو، م.

الشكل 3
الشكل 3. تحسين وضع ماصة لتحميل الخلايا العصبية مع الأصباغ الفلورية. (A) تخطيطي الجانبية بالنظر إلى غرفة تسجيل يظهر انه لكي استهدفت موقع التحميل الصبغة في القشرة البصرية (عين الثور الأحمر والأبيض) هو ~ 200 ميكرومتر تحت القشرية السطح. الإحداثي س ص هدف يتوافق مع موقع التوجه التفرد الدولاب على الهواء تحديدها من التصوير إشارة الذاتية. سوف أدخل ماصة القشرة بزاوية ° 30. إذا كان سطح القشرية موازية للسطح مرحلة XY، وغيض ماصة نقل حوالي 350 ميكرون أفقيا قبل أن تصل إلى وحدانية الدولاب على الهواء. (B) عرض أعلى غرفة تسجيل يبين الأوعية الدموية السطحية القشرية وموقف دخول ماصة (النجم الاحمر) الهو 350 ميكرومتر في وحدانية من الدولاب على الهواء. (C) ويتم تعديل الموقف XY المرحلة بحيث يتم توسيط موقف دخول ماصة تحت 20X 40X أو الهدف (3،3-3،5 مم WD). (D) يتم رفع الهدف ~ 2 مم. (E) وتعرض ماصة على حج القحف ويتم وضع طرفها مباشرة فوق موقف الدخول على السطح القشري باستخدام برنامج التحصين الموسع الخضراء، ضوء الفلورسنت. (F) وخفضت ماصة وموضوعية في نفس الوقت باستخدام الإضاءة الساطعة الميدان حتى الدم سطح السفن القشرية حيز التركيز. (G) تتم إزالة موضوعية وACSF ويتم تطبيق قطرة من الاغاروز 3٪ خلال حج القحف. يستخدم (H) ثنائي الفوتون التصور مع هدف (0.8 NA، 3.3 مم WD) 40X لمتابعة ماصة أسفل إلى عمق القشرية اختيار وحقن الصبغة. بعد التأكد من أن وصفت بنجاح الخلايا العصبية مع صبغة الفلورسنت، وعادة، أعلى NA الهدف 20X (1.0 NA، 2.0 مم WD) يستخدم لجمع اثنين من الفوتون ر - والبيانات Z-سلسلة. تخطيطي ق هو موضح في A، لم يتم رسمها CH على نطاق كبير.

الشكل 4
الشكل 4. المراسلات من تفضيل التوجه في اثنين من الفوتون والجوهرية خرائط التصوير إشارة وظيفية. (A) ثنائي الفوتون المنطقة المصورة تظهر أجسام الخلايا المسمى مع OGB-1 صباحا في طبقة القشرة البصرية 2/3. (B) تفضيل توجه الفرد أجسام الخلايا العصبية من نفس الموقع هو مبين في (A). حول وحدانية الدولاب على الهواء الذي كان مركزه في منطقة المصورة هي الخريطة المنظمة من التوجه التحفيز المفضل. (C) والتي تم الحصول عليها مع خريطة التوجه التصوير إشارة الذاتية. مربع أسود يتوافق مع المنطقة هو مبين في (B). وتم الحصول على هذه البيانات من نفس التجربة أظهرت في أرقام 2A-C و3B. شريط النطاق في ميكرومتر 100 (AB) و (C) ميكرومتر 500.

d/50025/50025fig5.jpg "/>
الشكل 5. في علم الصرف المجراة من الخلايا العصبيه واحدة في التوجه التفرد الدولاب على الهواء. (A) والتشعبات وجسم الخلية العصبية واحدة من مضافين مع التوجه الخريطة من نفس الموقع القشرية البصرية. وقد تم electroporated الخلايا العصبية مع فلور اليكسا 594 تحت ثنائي الفوتون التوجيه، جمعت Z-المكدس في الجسم الحي، وكانت تتبع عمليات شجيري حاليا باستخدام Neurolucida البرمجيات. تم الحصول على الخريطة التوجه باستخدام التصوير الجوهرية إشارة وحيدة الخلية قبل الصعق الكهربائي. (B) متوسط ​​الكثافة 10-ميكرومتر-Z-الإسقاط من طبقة قشرية 1 يبين التشعبات قمي. (CD) متوسط ​​الكثافة 10-ميكرومتر-Z-التوقعات من طبقة قشرية تظهر التشعبات 2/3 القاعدية ومحاور عصبية. السهام الحمراء تظهر على طول العمود الفقري التشعبات والسهام البيضاء أشر إلى محاور عصبية فردية. مقياس القضبان في ميكرومتر 100 (م).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نقدم طريقة لاستهداف بوضع العلامات على أجسام الخلايا العصبية (أو محورا وتشعبات عصبية) في المجالات المحددة مسبقا الصغيرة وظيفية من القشرة المخية الحديثة. دمج الجوهرية التصوير الإشارات الضوئية مع اثنين من الفوتون المجهري يوفر إمكانية تحديد أي نقاط الاشتباك العصبي والخلايا المساهمة في المجال الجزئي من أي خريطة وظيفية، سواء يرتبط الانتقائية العصبية مع موقع الخلايا العصبية في خريطة وظيفية، والدائرة العصبية مكونات هذا التغيير مع تجربة بصرية 7 أو تطبيق الأدوية العلاجية سريريا 18.

لم يبلغ عن أي خرائط لتوجيه التحفيز والتوجيه والهيمنة العين، أو التفاوت مجهر في القشرة البصرية من القوارض البرية من نوع الكبار 6،19-21. ومع ذلك، فقد أدى سهولة التحميل الخلايا العصبية مع الأصباغ الفلورية وتحقيق الاستقرار والتصوير، وجنبا إلى جنب مع الأدوات الوراثية قوية متاحة للفئران في الغالبية العظمى من الدراساتباستخدام اثنين من الفوتون التصوير من القشرة المخية التي يتم تنفيذها في القوارض بدلا من قوارض والقطط والقرود و.

يمكن عالية الدقة التصوير ثنائي الفوتون من الخلايا العصبية في الثدييات غير القوارض تكون صعبة للغاية بسبب عملية جراحية طويلة مرات، سمكا العظام ودورا، والخطوات الإضافية اللازمة للحفاظ على نبضات القلب والأوعية الدموية بوساطة الجهاز التنفسي والمخ لمدة 15 الحد الأدنى. الانتقال من عملية جراحية لتصوير إشارة الذاتية والجوهرية لاثنين من الفوتون التصوير تحتاج إلى أن تكون فعالة، مما يتطلب إعداد الأصباغ في الوقت المناسب والكواشف وتنفيذ العمليات الجراحية الدقيقة. باستخدام المجهر ثنائي الفوتون للتصوير إشارة الجوهرية يغني عن الحاجة إلى الكثير من المعدات المستخدمة في إشارة التقليدية منصات التصوير الضوئي الجوهرية 22 و يقلل من الوقت اللازم لإعداد التصوير الذاتية والتحول إلى التصوير ثنائي الفوتون اللاحقة.

وهو مصمم خصيصا لتوفير نهجنا عالية الدقة ثنائية بوالتصوير طن في المجالات المحددة مسبقا وظيفية. هذا يوفر الحد الأدنى من الحديث عبر إشارات وظيفية بين أجسام الخلايا العصبية، والعمود الفقري شجيري الفردية ومحاور عصبية يمكن أن تحل في الجسم الحي. باستخدام الفتحة العددية عالية (NA = 1.0) هدف وملء الفتحة الخلفي من الهدف مع عدسات توسع شعاع (انظر الشكل رقم التكميلية. 20 في شن آخرون، 2012 15) بالغة الأهمية بالنسبة لعالية الدقة التصوير. اعتمادا على سرعة التصوير في / وXY أو Z، قد نبضات القلب والأوعية الدموية في الجهاز التنفسي وتقليل دقة التصوير فعالة مهما كانت جيدة وNA البصرية ومسار الضوء هي. عن طريق الحد من حجم حج القحف في القوارض لعدم 2 مم 2 ×، وذلك باستخدام تركيز أعلى نسبيا من الاغاروز مع ساترة، وأداء تعليق استرواح الصدر وأسفل الظهر عندما تقتصر اللازمة نبضات الدماغ 15، الى 1-2 ميكرومتر. تقليل نبضات القلب والأوعية الدموية في الجهاز التنفسي ويتسبب في القشرة المخية الحديثة إلى 1-2 ميكرون خلال الجزء الأكبرالتحميل من المؤشرات الكالسيوم يضمن أيضا أن تشكل القشرة ختم مشددة حول إدراج ماصة، وأنه لا يتابع الصبغة على طول الساق من ماصة إلى السطح القشري. اختيار حقن صبغة ومواقع التصوير بعيدا عن الشرايين الكبيرة هي أيضا حاسمة للتصوير عالية الجودة وظيفية لأنه سيتم استبعاد سريع نسبيا الحسية أثار تبيغ (الدورة الدموية) التحف 15.

في موقع حج القحف، وترك الطبقة الأخيرة من الجافية سليمة في جميع أنحاء التصوير إشارة الذاتية ومراحل إعداد صبغة الفلورسنت - وبالتالي إزالة ذلك قبل إدخال ماصة في القشرة صبغة للتحميل - يزيد من نسبة النجاح والجودة لوضع العلامات العصبية في ما يلي طرق: (1) يحافظ على السطح القشري النظيفة و / أو إعادة نمو أنسجة يمنع الجافية بحيث غيض ماصة أقل احتمالا للحصول على المسدودة والحفاظ على الشفافية في الأنسجة، (2) يتجنب وجود الاغاروز تستخدم لمسة جوهرية في التصوير كورتسفن السطح كال الدم التي قد تحصل على تضررت عند إزالة الاغاروز، (3) يمنع استخدامها أثناء التصوير الاغاروز الجوهرية من دخول بين الجافية والجمجمة تحت القشرة حول حواف من حج القحف. الاغاروز في هذه المناطق سوف تزيد من المسافة بين سطح ساترة والقشرية مما يجعل إدخال ماصة أكثر صعوبة، يؤدي إلى ضغط من الأنسجة القشرية ويقلل من الشفافية للتصوير.

عند إعداد AM الأصباغ الفلورية للتحميل الجزء الأكبر، لا ينبغي أبدا أن بلورونيك 20٪ / DMSO خليط استخدامها إلى ما بعد 1 أسبوع من إعداد تقريرها الأولي - بلورونيك القديمة / DMSO يروي مضان. لتحميل الجزء الأكبر الأمثل للكثير من الهيئات الخلية المجاورة مع مؤشر الوظيفية، على سبيل المثال، OGB-1 AM، يتم تخزين خليط الصبغة على الجليد، تحميلها في ماصة حسب الحاجة ولكن حقن دائما في الدماغ في حدود 2 ساعة من إعداده.

خلال مرحلة تحميل الجزء الأكبر منالتجربة، وكرر البقول 1 ثانية من الضغط بدلا من الحقن المستمر من 1 دقيقة تسمح تكرارية معايرة معلمات طرد، والذي يضمن أن لا يتم تطبيق الصبغة الزائدة أو الضغط. بسبب تلف الأنسجة المحتملة من الإدراج ماصة متعددة اللازمة لتسمية مناطق واسعة جدا من الأنسجة والسمية المحتملة من كميات كبيرة من بلورونيك / DMSO من سلسلة من الحقن من هذا القبيل كثيرة، ونحن 300-600 ميكرون تفضل أحد موضع الحقن الصبغة في 2 × 2 مم حج القحف. مقارنة الحقن الأعمى 14، ثنائي الفوتون الملاحة تسترشد بصريا حول الأوعية الدموية، واستخدام النقيض السلبي للأجسام الخلايا العصبية لتحديد موقف الصفيحة، وقياس انتشار الصبغة على طرد الضغط وذلك في مؤشر على حجم الخلايا التي سوف تكون المسمى مع OGB 1-AM، ويحسن نوعية الصبغة التحميل في غير القوارض الاستعدادات.

البروتوكول وصفنا هنا يؤدي إلى وضع العلامات الناجحة من الخلايا العصبية مع الأصباغ الفلورية في القطرانحاول geted الصغيرة المجالات في كل حيوان. لتحميل الجزء الأكبر مع OGB-1 AM، نحصل على ردود بصريا باستمرار أثار في 75-100٪ من الخلايا العصبية في وقت واحد 9،15 تصوير وتقنية حساسة للكشف عن إمكانات عمل واحد في الجسم الحي 23،24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للعيون R01EY017925 وR21EY020985 والتمويل من المؤسسات دانا وايت هول لPK كما نشكر متى بتريا للحصول على المساعدة مع العمليات الجراحية؛ غريس ديون لتعقب التشعبات هو مبين في الشكل 5A، وبراتيك Chhatbar لل تعليقات على المخطوط.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Life support/experiment prep
Isoflurane Webster Vet NDC 57319-474-05
Isoflurane vaporizer Midmark VIP 3000
Feedback regulated heating blanket Harvard Apparatus 50-7079F
ECG monitor Digicare Biomedical LifeWindow Lite
EEG amplifier A-M Systems 1800
EEG display monitor Hewlett Packard 78304A
End tidal CO2 monitor Respironics Novametrix Capnoguard 1265 Optimize ventilation
Carbide drill burrs for drilling bone Henry Schein fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip)
Cement for headplate/chamber Dentsply 675571, 675572
Black Powder Tempera Paint Sargent Art Inc. 22-7185 Add to cement to improve light shielding and reduce reflections
Agarose - Type III-A Sigma A9793 For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging
Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness World Precision Instruments 502040, 502041 For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed
Brudon curettes George Tiemann 105-715-0, 105-715-3 Cleaning skull surface
Bone wax Ethicon W31G Quickly stop bleeding
Cotton Tipped Applicator Electron Microscopy Sciences 72308-05 Clean and dry bone surface
Dumont #5CO Forceps Fine Science Tools 11295-20 Grab individual layers of dura or pia
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03 Cut dura
Gelfoam Pfizer 09-0396-05 To stop bleeding on the dura
Absorption spears Fine Science Tools 18105-01 Ultra-fast and lint-free wicking of CSF
Blackout material Thorlabs BK5 Shield craniotomy
2. Dye preparation / injection
Dimethyl Sulphoxide (DMSO) Sigma D2650
Pluronic Sigma P2443
Oregon Green 488 Bapta-1 AM Invitrogen O6807 Calcium indicator
Alexa Fluor 594 Invitrogen A10438
Centrifugal filter (0.45 μm pore size) Millipore UFC30HV00 To remove impurities before injection
Glass pipette puller Sutter Instruments P97
Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) World Precision Instruments 1B150F-4 Dye ejection pipette
Microloader Eppendorf 5242 956 003 For loading dye into pipette
Micromanipulator Sutter Instruments MP-285 To position pipette
Pressure pulse controller Parker Hannifin PicoSpritzer III For pressure injection of the dye
Single-cell electroporator Molecular Devices Axoporator 800A For electroporation of the dye
3. Intrinsic imaging
4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) Olympus UPLFLN4X
Intrinsic hardware / software Optical Imaging Inc. Imager 3001 / VDAQ VDAQ software is used for episodic imaging
CCD Camera Adimec Adimec-1000
Light source power supply KEPCO ATE 15-15M
Light source Optical Imaging Inc. HAL 100 Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW
Green filter (for vascular image) Optical Imaging Inc. λ = 546 nm (bandpass 30 nm) For reference image of surface vasculature
Red filter (for intrinsic signal) Optical Imaging Inc. λ = 630 nm (bandpass 30 nm) To collect intrinsic signals
Heat filter Optical Imaging Inc. KG-1
4. Two-photon rig/imaging
Two-photon microscope and software Prairie Technologies See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power
Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai XF
20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) Olympus UMPLFLN20X 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging)
20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) Olympus XLUMPLFLN20X
40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) Olympus LUMPLFLN40X/IR
Air table Newport ST-200 Isolates preparation from external vibrations
xy stage Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA) Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage
Recipes
Artificial Cerebro-Spinal Fluid NaCl (135 mM), KCl (5.4 mM), MgCl2 (1.0 mM), CaCl2 (1.8 mM), HEPES (5 mM), pH 7.4
Pipette Solution14 NaCl (150 mM), KCl (2.5 mM), HEPES (10 mM), pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
  2. Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
  3. Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns. Nature. 353, 429-431 (1991).
  4. Ohki, K., et al. Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels. Nature. 442, 925-928 (2006).
  5. Shmuel, A., Grinvald, A. Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18. J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).
  6. Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
  7. Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity. Nature. 456, 952-956 (2008).
  8. Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex. Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).
  9. Kara, P., Boyd, J. D. A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex. Nature. 458, 627-631 (2009).
  10. da Costa, N. M., Martin, K. A. Whose Cortical Column Would that Be. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16 (2010).
  11. Kaschube, M., et al. Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex. Science. 330, 1113-1116 (2010).
  12. Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex. Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).
  13. Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, 501-505 (2011).
  14. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
  15. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).
  16. Nevian, T., Helmchen, F. Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation. Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).
  17. Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).
  18. Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex. Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).
  19. Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471, 177-182 (2011).
  20. Rochefort, N. L., et al. Development of direction selectivity in mouse cortical neurons. Neuron. 71, 425-432 (2011).
  21. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-972 (2007).
  22. Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. Brain mapping: The Methods. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).
  23. Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
  24. Hofer, S. B., et al. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).

Tags

علم الأعصاب، العدد 70، البيولوجيا الجزيئية، علم الأحياء الخلوي، علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، والتصوير ثنائي الفوتون، وعدم القوارض والخرائط القشرية، والهندسة المعمارية وظيفية، والتوجه الدولاب على الهواء التفرد، والتصوير الضوئي، والكالسيوم صبغة حساسة، ومعظم التحميل وحيدة الخلية الصعق الكهربائي
استهدفت وصفها من الخلايا العصبية في المجال الوظيفي محددة من القشرة المخية الحديثة مايكرو من خلال الجمع بين الإشارات الجوهرية والتصوير ثنائي الفوتون
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Herron, P., Shen, Z., Lu, Z.,… More

O'Herron, P., Shen, Z., Lu, Z., Schramm, A. E., Levy, M., Kara, P. Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging. J. Vis. Exp. (70), e50025, doi:10.3791/50025 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter