Summary
שיטה מתוארת לתיוג נוירונים עם צבעי ניאון בתחומי מייקר מראש תפקודיים של הניאוקורטקס. ראשית, דימות אופטי אות פנימית משמש להשגת מפה תפקודית. אז מיקרוסקופ שני פוטונים משמש לתווית ונוירונים תמונה בתוך תחום מייקרו של המפה.
Abstract
בקליפת המוח החזותית הראשונית של יונקים שאינם מכרסמים, נוירונים מקובצים בהתאם להעדפותיהם לתכונות גירוי כגון כיוון 1-4, כיוון דומיננטי 5-7, 8,9 עיני ופער משקף 9. הסלקטיביות יווניות היא התכונה למדה הנרחב ביותר והמפה רציפה עם פריסת עין תקופתית לכיוון מועדף היא הווה על פני כל קליפת המוח החזותי הראשונית 10,11. שילוב התרומות סינפטיים, סלולריות ורשת המובילות לתגובות סלקטיבית גירוי במפות תפקודיות אלה מחייב את ההכלאה של שיטות הדמיה שמשתרעות על פני תת מיקרון לקשקשים מרחביים מילימטר. עם הדמית אות אופטית פנימית קונבנציונלית, הפריסה הכללית של מפות פונקציונליות על פני כל השטח של קליפת המוח החזותית ניתן לקבוע 12. הפיתוח של מיקרוסקופיה in vivo שני פוטונים באמצעות סיד צבעים רגישים מאפשר לאדם לקבוע synaptקלט ic מגיע קוצים הדנדריטים בודדים פעילות 13 או להקליט בו זמנית ממאה גופי תא עצביים בודדים 6,14. כתוצאה מכך, שילוב הדמית אות פנימית עם הרזולוציה מרחבית תת מיקרון של מיקרוסקופיה שני פוטונים מציע את האפשרות של קביעה בדיוק אילו מגזרים ותאים דנדריטיים לתרום לתחום המייקר של כל מפה תפקודית בהניאוקורטקס. כאן אנו מדגימים שיטת תשואה גבוהה להשגת מהירות מפת התמצאות קליפת מוח ומיקוד תחומים ספציפיים במייקר המפה פונקציונלית זו לתיוג נוירונים עם צבעי ניאון ביונקים שאינם מכרסמים. עם אותו מיקרוסקופ המשמש להדמית שני פוטונים, אנחנו מייצרים 1 מפת התמצאות באמצעות דימות אופטי אות פנימית. ואז אנו מראים כיצד למקד-תחום המיקרו של ריבית באמצעות micropipette עמוס צבע או לתווית אוכלוסייה של גופי תא עצביים או תווית נוירון כזה שדנדריטים, קוצים ואקסונים נראים באחתvivo. החידודים שלנו על פני שיטות הקודמות להקל בחינת מבנה יחסי תפקוד עצביים עם רזולוציה תת הסלולר במסגרת של ארכיטקטורות פונקציונליות neocortical.
Protocol
1. הכנת כירורגים
- לגרום להרדמה ורציפות לפקח על קצב לב, בסופו של גאות ושפל CO 2, EEG, וטמפרטורה. כל הנהלים אושרו על ידי טיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדה השתמשה ומן האוניברסיטה לרפואה של דרום קרוליינה והתבססו על אלה שפורסמנו 9,15 בעבר.
- לחשוף את פני השטח הגבי של הגולגולת על ידי חיתוך העור בסכין אזמל. לנתח את רקמות חיבור המונחים על עצם שימוש במגרדת Brudon. נקה את עצם השימוש applicators חוד כותנה וכותנת גזה. החל שעוות עצם (לפי צורך) לגולגולת, כדי לעצור את הדימום מזדמן דרך ורידי שליח קטנים.
- צרף טיטניום או צלחת ראש נירוסטה לגולגולת (מעל האזור של עניין שבו יבוצע craniotomy) באמצעות מלט שיניים מעורבות בצבע שחור (ראה חומרים). פתח מלבני במרכז צלחת הראש מספק גישה לcraniotomy והדמיה אופטית. צרף קאמרי מתכת על גבי הצלחת בראש. חדר זה ישמש כמאגר לנוזל הדמיה עם העדשה האובייקטיבית הטבילה במים.
- להבטיח את הצלחת עד ראש xy שלב באמצעות עמודי מתכת.
- דק שטח גדול של העצם בתוך הפתח המלבני של headplate באמצעות מקדחת רופא שיניים. האזור לדילול חייב להרחיב גם מעבר לגבולות craniotomy המתוכנן. הגולגולת העבה של יונקים שאינם מכרסמים חייבת להיות דלילה אם תמונות ברזולוציה גבוהה שאפשר לרכוש מהניאוקורטקס כי באתר craniotomy, העובי של עצם יכתיב את העובי של agarose בין coverglass ומשטח neocortical (ראה בהמשך) .
- מקדחת x מתווית 2 2 מ"מ מרובעת בעצמות לcraniotomy. שטוף את התא מעת לעת עם נוזל השדרתי מלאכותי טרי (ACSF) להסיר ברי עצם ולהקטין את פיזור חום לקליפת המוח הבסיסית. החל שעוות עצם לפי צורך, כדי לעצור את הדימום מדי פעם.
- Lift דש העצם עם # 3 מלקחיים.
- הסר את כל אבל את השכבה התחתונה של דורה באמצעות מלקחי קנס (# 5CO) ומספרי אביב Vannas. הדורה ביונקים שאינם מכרסמים היא עבה ואטומה, אבל ניתן להסיר בשכבות נפרדות. דימום הוא נדיר, אך ניתן לעצור עם Gelfoam ושאריות דם צריכות להיות בעדינות להסיר את השכבה הנותרת של דורה באמצעות מלקחיים ושטיפה בACSF. השכבה הסופית של דורה היא שקופה וכלי pial צריכים להיות נראים בבירור דרכו. השארת השכבה האחרונה של דורה שלמה במהלך הדמית אות הפנימית תגדיל את שיעור ההצלחה של העמסת כמות גדולה של סידן אינדיקטורים ניאון לשלב הדמית שני הפוטונים הבאים של הניסוי (ראה דיון).
- תחול ירידה של 2% agarose החם (מומס בACSF) ולמקם coverglass מייד על פתיחת הגולגולת. בדקו craniotomy כדי להבטיח שפעימות לב וכלי דם ונשימה הן מינימאליות באמצעות מיקרוסקופ ניתוחי לנתח או oculars של שנימיקרוסקופ פוטון במצב בהיר תחום.
2. אותות אופטיים פנימית הדמיה
- הוסף ג'ל קצף ספוג ACSF סביב חלק החיצוני של coverglass למנוע agarose מההתייבשות במהלך הדמית אות הפנימית.
- צרף המצלמה הפנימית אות הדמית CCD ליציאת C-Mount הסטנדרטי על גבי מיקרוסקופ שני הפוטונים (איור 1). הנח את מקור האור מאיר על שולחן האוויר סמוך לבמת xy (איור 1 א). עמדה ולאבטח את מדריכי האור מעל craniotomy וheadplate / קאמרי (1B איור). לחזור בי Dichroic הראשוני ומראה, שמתחת C-Mount היציאה כך שהאור האדום משתקף נזקק לאותות פנימיים יעבור ישירות מcraniotomy למצלמת CCD (תרשים 1C-D). שימוש האובייקטיבי 4x אוויר (0.13 NA, 17 המ"מ WD), שדה 2 x 2 מ"מ של תצוגה הוא זמין להדמית אות פנימית.
- הכנס מסנן חום בlנתיב ight למנוע קליפה מהחימום. השתמש במסנן שמעביר אור הירוק (546 ננומטר מרכז λ) ולהקליט את תמונת התייחסות דיגיטלית של כלי הדם על פני השטח של קליפת המוח.
- העברת מוקד z ל500 מיקרומטר מתחת לפני שטח קליפת המוח. השתמש במסנן אדום (630 ננומטר מרכז λ) כדי להאיר את הקליפה למדידת אותות פנימיים. מקם את מדריכי אור כזה, שעל פני השטח של קליפת המוח הוא מוארים באופן אחיד. מגן craniotomy מהאור מיוצר על ידי תצוגת הגירוי החזותית. מציג רצף של גירויים חזותיים ותמונות נתוני reflectance שיא. כדי ליצור מפת התמצאות בתוך 10 דקות, לאסוף נתונים המתאימים 4 חזרות של רצף של 8 גירויים (4 כיוונים ושני כיוונים לכל כיוון).
- לנתח את נתוני אותות הפנימיים כדי ליצור מפת התמצאות צבע שווא. בחר אזורי היעד פוטנציאליים לתיוג שני פוטונים של תאי עצב, למשל, הייחודויות אורינטצית שבשבת - נקודות במפה שביכל האוריינטציות המועדפות מכונסות (איור 2 א). שכבת מפת ההתמצאות והדימוי של מערכת כלי הדם לפני שטח קליפת המוח (איור 2B-C). השתמש בפריסה של תחומים פונקציונליים ואת המיקום של ספינות שטח גדולות כדי לבחור יעד, הימנעות ממקומות עם כלי דם גדולים וarterioles 15.
3. טוען גורף של אינדיקטורים סיד פלורסנט
- הכן את הפתרון של Pluronic 20% / DMSO ידי הוספת Pluronic 1 גרם בDMSO 5 μl. מחמם את התערובת על 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, לפזר את Pluronic לחלוטין. לאפשר לתערובת להתקרר לטמפרטורת חדר. הוסף 4 μl של תערובת Pluronic / DMSO לבקבוקון 50 מיקרוגרם של מחוון סיד ניאון אורגון גרין 488 Bapta-1 בבוקר (OGB-1 בבוקר). ואז להוסיף μl 1 מתוך צבע אדום (אלקסה פלואוריד 594, 2 פתרון מניית מ"מ) ו35 μl של פתרון פיפטה (ראה חומרים) לריכוז סופי של 1 מ"מ OGB-1 AM. Sonicate הפתרון לשעה וחצי באמבטיה מקוררת מים ולאחר מכן סרכזת עם 0.45 מיקרומטר מסנן כדי להסיר זיהומים.
- משוך פיפטה להתחדד ארוכה עם קוטר קצה חיצוני של 2.0-2.5 מיקרומטר. טען 5 μl של תערובת הצבע לתוך פיפטה.
- הסר את השכבה האחרונה של דורה כדי להקל על החדרת פיפטה ולקבל את התמונות באיכות הגבוהה ביותר של שני הפוטונים.
- לקבוע את המיקום המדויק על פני קליפת המוח שפיפטה יש להציב על מנת להגיע ליעד שלו בקליפת מוח השכבה 2/3. היעד שנקבע מראש בקליפת המוח שלנו הוא ייחודיות שבשבת במפת ההתמצאות (איור 2). פיפטה חייבת להיות מונע אל קליפת המוח בזווית 30 מעלות כדי לעבור בין קיר החדר והאובייקטיבי. לכן, כדי לתייג את אזור היעד של 200 מיקרומטר מתחת לפני השטח של קליפת המוח, בעמדת כניסת פיפטה על פני קליפת המוח תהיה כ 350 מיקרומטר הרוחבי למיקום היעד (איור 3 א.ב.).
- להזיז את במת xy (שבחיה וpmicromanipulator ipette ממוקם) למרכז עמדת כניסת משטח קליפת המוח תחת אובייקטיבי (האיור 3C). השתמש אובייקטיבי 20x או 40X עם מרחק עבודה (WD) של לפחות 3 מ"מ (ראה חומרים) כדי להבטיח שפיפטה קלות תיכנס לקליפה בלי לגעת אובייקטיבי או העצם לאורך קיר craniotomy. ברגע שעמדת הכניסה מרוכזת תחת אובייקטיבי, להגביה את מיקום Z של המטרה על ידי 2 מ"מ (האיור 3D). עם האור הירוק עלית פלואורסצנטי מופעל לדמיין אלקסה צבע אדום בפיפטה, השתמש בציר האלכסוני של micromanipulator לעבור פיפטה עד שקצו הוא מרוכז (וממוקד) במטרה ישירות מעל עמדת כניסת משטח קליפת המוח ( איור 3E).
- מנמיך את פיפטה האנכית (לאורך ציר z) עד פיפטה מגיעה לפני השטח של קליפת המוח (איור 3F), ואילו ברציפות צפיית קצה פיפטה דרך OCUלארס של המיקרוסקופ. שימוש בתאורה בהירה שדה, כלי קליפת מוח משטח הדם וקרומי meningeal נותר (פיא והארכניאיד) הם נראים בקלות כפיפטה מתקרבת משטח קליפת המוח. אם פיפטה אינה מגיעה עמדת הרשומה הרצויה, להעלות את פיפטה ולכייל מחדש מיקוד המבוסס על ציוני דרך כלי הדם על פני השטח של קליפת המוח.
- הסר את המטרה, פתיל נוזל שדרה עודף מcraniotomy ולייבש את העצם הסמוך באמצעות חניתות קליטה נטולת מוך. תחול ירידה של 3% agarose החם (מומס בACSF) כדי לייצב את הקליפה שנראית מבעד לcraniotomy (האיור 3G). ב- מכרסמי עישון, 3% agarose יש צורך לצנן את הפעימות לספיגה מוצלחת של צבעי ניאון על ידי נוירונים. עבור דימות אופטי אות פנימית רק 2% agarose נדרש משום ששילוב של 2% agarose וcoverglass מספק את היציבות הדרושה. הנה, לא coverglass משמש לצעד לצבוע טעינה כך 3% agarose הואצורך. לאחר agarose בסס, הכנס אובייקטיבי 40X (0.8 NA, 3.3 המ"מ WD) ולמלא מחדש את בית הנבחרים בACSF.
- לעבור משדה בהיר לצפיית שני פוטונים ולאתר את קצה פיפטה. שימוש בציר האלכסוני של micromanipulator, הזז את פיפטה עד שקצו מגיע לעומק הרצוי בקליפת המוח (האיור 3H). פחזניים פליטת לחץ מזדמן של תערובת הצבע (כמה psi, דופק בכל 0.1 שניות) יסייעו למנוע קצה פיפטה מסתימה. בגלל OGB-1:00 הופך גלוי רק על להיכנס לתאים, האדום אלקסה הצבע הוא קריטי להדמיה של קצה פיפטה בתוך הקליפה.
- לפני שתנסה לטעון נוירונים בקליפת מוח השכבה 2/3 במינון המלא של צבע, מחדש להתמקד במטרה על פני קליפת המוח כדי לאשר את העומק של קצה פיפטה ולהבטיח שהקצה הוא במיקום היעד מבוסס על הפריסה של כלי דם על פני שטח. אם פיפטה היא בשכבה 2/3, שאיפות קטנות של תערובת הצבע צריכות להאירחלל חוץ תאי ולחשוף הרכבה צפופה של גופי תא מעגליים כצללים כהים.
- לטעינת גופי תא עצביים בתחום קוטר מיקרומטר קליפה 300-600, מזריק את תערובת הצבע לתוך חלל החוץ התאי באמצעות 30-90 פעימות, דופק בכל 1.0 שנייה, 2-10 psi. פולסים של לחץ לא צריכים להיות כל כך חזקים שהרקמה עוברת. לאחר ההזרקה היא מוחלטת, לחכות כמה דקות, ואז להסיר את הצינורית והאובייקטיבית. חכה לשעה 1 כדי לאפשר OGB-1 בבוקר ועד שנלקח במלוא על ידי נוירונים.
- הסר את agarose משמש לטעינת הצבע ולשטוף תא ההקלטה. שים טיפה קטנה של 2-3% agarose על פני שטח ואת מקום coverglass מעל craniotomy במהירות. בגלל צבעי הניאון הם רגישים לאור, להימנע מחשיפת יתר בקליפת המוח לשדה בהיר או אור הניאון עלית. הכנס NA (1.0) 20x אובייקטיבי גבוהה לבעל האובייקטיבי ומחדש מרכז אזור קליפת המוח מתויג תחת אובייקטיבי באמצעות שלב xy. מגן craniotomy מאקסמקורות traneous אור, למשל, תצוגת גירוי חזותית, תוך שימוש במספר שכבות של חומר אפל.
4. Electroporation תא בודד של צבעי ניאון
- ללימוד מורפולוגיה הדנדריטים, להכין תמיסה של מיקרומטר Alexa פלואוריד 100 594 (01:20 דילול בACSF מתוך 594 מניות 2 מ"מ Alexa פלואוריד). להדמיה תפקודית של הדנדריטים מלח OGB ניתן להשתמש 16,17.
- משוך פיפטה להתחדד ארוכה עם גודל קצה 1 מיקרומטר ולטעון 5 μl של צבע לתוך פיפטה. כל הצעדים האחרים של מיקוד תחום תפקודי זהים לשיטת הטעינה בתפזורת (תרשימי 1-3). כדי למקם את קצה פיפטה סמוך לממברנת גוף תא עצבית, לפקח על העלייה בעכבת אלקטרודה ולהחיל פחזניים לחץ של צבע כדי להאיר את חלל החוץ התאי ולראות גופי תא כצללים במהלך הדמית שני פוטונים.
- כאשר קצה פיפטה צמוד לממברנת גוף תא עצבית, השתמש 800A Axoporator ליישםקטניות (1-3 -8 ל -10 וולט, 10 אלפיות דופק). המילוי המיידי של נוירון עם צבע הוא בקלות דמיין עם מיקרוסקופ שני פוטונים. הסר את פיפטה ולאסוף תמונות ברזולוציה גבוהה של דנדריטים ואקסונים in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להמחיש את הדיוק של שיטות תיוג הצבע שלנו, אנחנו ממוקדים בתחום מייקרו הקטן ביותר של כל מפה פונקציונלית ידועה בניאוקורטקס אינם המכרסם. מנוקד בדלילות לאורך מפת ההתמצאות בקליפת הראייה העיקרית הם נדירים. אלה מתרחשים בנקודות בי כל הכיוונים המועדפים להתכנס כך שבשנת צבע מפות שווא של נטייה מועדפת, האזורים מסביב למראה הייחודי כמו "גלגלי רוח" (איור 2A-B). אחד סבב לcraniotomy נבחר לצבע תיוג (העיגול ירוק באיור 2C), להיות בטוח, כדי למנוע וכלי arterioles גדולים ב15 בפרט. עם תפזורת העמסת OGB-1 בבוקר, מעקב אחר שינויים בפלואורסצנטי מחוון הסיד העצבי לרצף של גירויים חזותיים צורם אורינטציה מגלים מפות תא בודד ברזולוציה פונקציונליות ברחבי ייחודויות שבשבת (איור 4). עם electroporation תא בודד, הארגון המרחבי של דנדריטים ואקסונים כמingle נוירון ממוקם בייחודיות שבשבת נקבע in vivo (איור 5).
איור 1. התקנה פנימית אות אופטית הדמיה. () החיה ממוקמת על במת xy והדמית אות פנימית מתבצעת באמצעות מצלמת CCD רכוב על המיקרוסקופ שני הפוטונים. מקור האור והמחשב משמש לשליטה על הפעלת ההדמיה הם הביאו להתקנה להדמיה פנימית והתרחקו לפני שלב ההדמיה שני הפוטונים של הניסוי מתחיל. (ב) סגור את האור האובייקטיבי 4x ותאורת ננומטר 630 דרך מדריכי אור נוזליים. גם שני מדריכי אור מחובר לעמודי מתכת (משמאל), או טבעת אחת מאירה מצורפת ישירות אובייקטיבי (מימין) יכולה להיות בשימוש. חומרים המשמשים להאפלה לגונן אובייקטיבי ממקורות חיצוניים של תאורה, למשל, תצוגת גירוי חזותית, במהלך פגישות הדמיה אופטיות, לא מוצגת. (ג) סכמטי של מיקרוסקופ ונתיב אור בתצורת הדמית שני פוטונים הקונבנציונליות. ראה איור משלים. 20 בשן ואח'. 2012 15 לתיאור של אור דרך שני פוטונים המלאות. המראה הנשלפת היא ממוצבת כדי להסיט את האור מהליזר דרך Dichroic ואל קליפת המוח. Dichroic העיקרי, העובר קרן הליזר ומשקף את האור הנפלט מהקליפה לPMT של, הוא נכנס למסלולו האור על ידי סיבוב צריח המסנן. (ד) להדמיה פנימית המראה הוא חזר בו וצריח המסנן מופעל לעבור Dichroic העיקרי מהדרך, ומאפשר נתיב אור ישיר מהקליפה למצלמת CCD. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. שימוש במפות תפקודיות שהושגו עם הדמית אות פנימית כדי לבחור תחום מייקרו לתיוג נוירונים עם צבעי ניאון. () מפת התמצאות מחתול קליפה חזותית עיקרית רכשה באמצעות דימות אופטי אות פנימית. הצבע של כל פיקסל מייצג את הכיוון המועדף במיקום זה. ייחודויות שבשבת אורינטציה פוטנציאלית המתאימים לתיוג נוירונים עם צבעי ניאון מוצגת בתוך עיגולים שחורים. (ב) המפה של כלי דם על פני שטח של קליפת מוח מהול במפת ההתמצאות. (ג) גלגלי רוח בתוך עיגול אדום נמצאים בקרבת כלי דם גדולים או arterioles וכך אתר שבשבת בתוך העיגול הירוק נבחר כמטרה לתיוג צבע. המלבן המקווקו מתאים לאזור שמוצג באיור 3 ב. סרגל קנה מידה ב() 500 μ מ '.
איור 3. ביצוע אופטימיזציה של מיקום פיפטה לטעינת נוירונים עם צבעי ניאון. () צד נוף סכמטי של תא ההקלטה מראה שאתר טעינת צבע כדי להיות ממוקד בקליפה חזותית (עין שור ולבן האדומים) היא ~ 200 מיקרומטר מתחת לקליפת המוח פני שטח. Xy הקואורדינטות של היעד מתאים למיקום של ייחודיות שבשבת אורינטציה נקבעה מהדמית אות פנימית. פיפטה תיכנס הקליפה בזווית ° 30. אם פני השטח של קליפת המוח במקביל למשטח במת xy, קצה פיפטה יעבור כ 350 מיקרומטר רוחבי לפני שהגיע לייחודיות שבשבת. (B) נוף לראש תא הקלטה מציג את כלי דם לפני שטח קליפת המוח ואת מיקום כניסת פיפטה ה (כוכב אדום)בהוא 350 מיקרומטר מייחודיות שבשבת. (ג) עמדת שלב xy מותאם כך שעמדת כניסת פיפטה מרוכזת תחת 20x או אובייקטיבי 40X (3.3-3.5 המ"מ WD). (ד) המטרה היא הרים ~ 2 מ"מ. (ה) פיפטה הוא הביא craniotomy וקצו ממוקם ישירות מעל עמדת הכניסה על פני קליפת המוח באמצעות אור עלית פלואורסצנטי ירוק. (F) פיפטה ומטרתם הורידו במקביל באמצעות תאורה בהירה שדה עד כלי הדם על פני השטח של קליפת המוח מגיעים אל מוקד. (ז) והאובייקטיביים ACSF יוסרו וירידה של 3% agarose מוחלת על פני craniotomy. (ח) להדמיה שני פוטונים עם 40X אובייקטיבי (0.8 NA, 3.3 המ"מ WD) משמשת למעקב פיפטה עד עומק קליפת המוח שנבחר ולהזריק את הצבע. לאחר אישור הנוירונים מסומנים בהצלחה עם צבע פלואורסצנטי, בדרך כלל, גבוה יותר NA 20x אובייקטיבי (1.0 NA, 2.0 המ"מ WD) משמש לאיסוף שני פוטונים לא - ונתוני Z-סדרה. סכימתי גם מוקרן ב, CH לא נמשך לקנה מידה.
איור 4. התכתבות של העדפת התמצאות במפות אות הדמית 2 פוטון והפנימיות פונקציונליות. () אזור ההדמיה שני פוטונים מראים גופי תאים שכותרתו עם OGB-1 בבוקר בשכבת הקורטקס חזותי 2/3. (ב) העדפת אורינטציה של גופי תא עצביים בודדים מאותו האתר שמוצגת ב(). מסביב לייחודיות השבשבת שהיה מרוכזת באזור ההדמיה היא מפה מסודרת של אורינטצית גירוי מועדפת. (ג) מפת ההתמצאות הושגה עם הדמית אות פנימית. הריבוע השחור מתאים לאזור שמוצג ב( B). נתונים אלה התקבלו מאותו הניסוי מוצג באיורי 2A-C ו3B. סרגל קנה מידה ב( א.ב.) 100 מיקרומטר ו (ג) 500 מיקרומטר.
d/50025/50025fig5.jpg "/>
איור 5. במורפולוגיה vivo של נוירון בודד בייחודיות שבשבת אורינטציה. (א) דנדריטים וגוף תא של נוירון בודד כוסו במפת ההתמצאות מאותו אתר קליפת המוח החזותי. נוירון היה electroporated עם אלקסה פלואוריד 594 תחת הדרכתו שני פוטונים, Z-מחסנית נאספה in vivo, והתהליכים דנדריטיים אותרו מקוונים באמצעות תוכנת Neurolucida. מפת ההתמצאות הושגה באמצעות הדמית אות פנימית לפני electroporation תא בודד. (ב) בעצמה הממוצעת של 10-Z-הקרנת מיקרומטר משכבת קליפת מוח 1 מציגה הדנדריטים apical. (תקליטור) עצמה הממוצעת 10-מיקרומטר-Z-תחזיות משכבת קליפת המוח 2/3 דנדריטים ואקסונים basal מופע. חיצים אדומים מראים קוצים לאורך הדנדריטים וחצים לבנים צבע על אקסונים בודדים. ברי היקף ב( AD) 100 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מציגים שיטה למקד את התיוג של גופי תאים עצביים (או דנדריטים ואקסונים) בתחומי מייקרו תפקודיים שנקבעו מראש של הניאוקורטקס. מיזוג הדמיה אופטית אות פנימית עם מיקרוסקופ שני פוטונים מציע אפשרות לקביעת שהסינפסות ותאים לתרום לתחום המייקר של כל מפה, בין אם פונקציונלית קושרי סלקטיביות עצבית עם מיקומו של תא העצב במפה פונקציונלית, ומעגל העצבי רכיבים שהשינוי בחוויה חזותית 7 או יישום קליני תרופות טיפוליות 18.
אין מפות לכיוון גירוי, כיוון, דומיננטיות עיניות, או פער משקף כבר דיווח בקליפת המוח החזותית של מכרסמי בוגרי סוג פראי 6,19-21. עם זאת, את הקלות של טעינת נוירונים עם צבעי ניאון והשגת יציבות הדמיה, יחד עם כלים הגנטיים הרבים העצמה הזמינה לעכברים הביאה את הרוב המכריע של מחקריםבאמצעות הדמית שני פוטונים של קליפת המוח מתבצעת במכרסמים במקום חמוסים, חתולים וקופים.
רזולוציה גבוהה הדמיה 2 פוטונים של תאי עצב ביונקים שאינם מכרסמים יכולה להיות מאתגרת מאוד בגלל זמנים ארוכים ניתוח, עצם עבה יותר ודורה, וצעדים נוספים הדרושים כדי לשמור על פעימות לב וכלי דם ונשימת תיווך של המוח ל15 מינימום. מעברים מניתוח להדמית אות הפנימית ומהותית להדמית שני פוטונים צריכים להיות יעיל, ודורשים זמן הכנה של חומרים כימיים, צבעים וביצוע פרוצדורות כירורגיות מייקרו. באמצעות מיקרוסקופ שני פוטוני הדמית אות פנימית מייתר את הצורך בחלק גדול מהציוד המשמש באסדות קונבנציונליות פנימיות אותות אופטיות והדמית 22 מפחית את הזמן הנדרש להקמת הדמיה ומעבר מהותית להדמיה לאחר שני פוטונים.
הגישה שלנו תוכננה במיוחד כדי לספק רזולוציה גבוהה של שני פוהדמית טון בתחומים פונקציונליים שנקבעו מראש. זה מספק לעבור לדבר מינימאלי של אותות עצביים פונקציונליים בין גופים סלולריים וקוצים הדנדריטים בודדים ואקסונים יכולים להיפתר בגוף חי. שימוש בצמצם מספרי גבוה (NA = 1.0) אובייקטיבי ומילוי הפתח האחורי של אובייקטיבי עם אופטיקה הרחבת הקורה (ראה איור משלים. 20 בשן ואח'., 2012 15) הם קריטיים עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה. תלוי במהירות של ההדמיה בXY ו / או Z, פעימות לב וכלי דם ונשימה עשויות להפחית את רזולוציית ההדמיה האפקטיבית לא משנות כמה טוב NA ונתיב אור אופטי הם. על ידי הגבלת גודל craniotomy ב- מכרסמים שאינם ל2 x 2 מ"מ, באמצעות הריכוז הגבוה יחסית של agarose עם coverglass, וביצוע pneumothorax והמותני השעיה כאשר 15, פעימות מוח הדרושות מוגבלות ל 1-2 מיקרומטר. צמצום פעימות לב וכלי דם ונשימה מושרות של הניאוקורטקס עד 1-2 מיקרומטר במהלך התפזורתהטעינה של אינדיקטורים הסידן גם מבטיחה שהקליפה יוצרת חותם חזק סביב פיפטה המוכנסת ושלא לצבוע עוקב לאורך השוק של פיפטה אל פני השטח של קליפת המוח. בחירת הזרקת צבע ואתרי הדמיה מarterioles הגדול היא גם קריטית להדמיה תפקודית באיכות גבוהה, כי לא תיכללנה בחפצים חושיים עוררו-hyperemia יחסית מהירים (המודינאמית) 15.
באתר craniotomy, ומשאיר את השכבה הסופית של דורה השלמה לאורך הדמית האות הפנימית ושלבי הכנת צבע ניאון - כך להסיר אותו ממש לפני כניסת פיפטה בקליפת המוח לטעינת צבע - מגדיל את שיעור ההצלחה ואיכות של תיוג עצבי בפעולות הבאות דרכים: (1) שומרת על משטח קליפת המוח נקי ו / או מונעת צמיחה מחודשת רקמת dural כך שקצה פיפטה הוא פחות מתאבן והשקיפות של הרקמה נשמרה, (2) נמנע לאחר agarose המשמש להדמית המגע פנימי CORTכלי פורמאליות משטח דם שעלול לקבל פגום כשagarose מוסר, (3) מונעים agarose השתמש במהלך הדמיה מהותית מלהיכנס בין הדורה ומתחת קליפת הגולגולת מסביב לקצוות של craniotomy. Agarose באזורים אלה יגדיל את המרחק בין coverglass ופני השטח של קליפת המוח שהופך את הכניסה של פיפטה הקשה יותר, מוביל לדחיסה של רקמת קליפת המוח ומפחית את השקיפות להדמיה.
כאשר מתכונן AM צבעי ניאון לטעינה בתפזורת, תערובת Pluronic 20% / DMSO לא צריכה לשמש מעבר 1 שבוע מההכנה הראשונית שלה - Pluronic הישן / DMSO מרווה פלואורסצנטי. לטעינה בתפזורת אופטימלית של גופי תא סמוכים רבים עם חיווי פונקציונלי, למשל, OGB-1 בבוקר, תערובת הצבע מאוחסנת על קרח, נטענת לתוך פיפטה לפי צורך, אך תמיד שהוזרקה למוח בתוך 2 שעות של הכנתו.
במהלך שלב העמסת הכמות הגדולה שלהניסוי, חזר 1 פולסים שניות של לחץ ולא בהזרקה רציפה של 1 דקות מאפשר לאיטרטיבי כיול פרמטרי פליטה, אשר מבטיח כי צבע או לחץ מוגזם אינו חל. בגלל פוטנציאל הניזק לרקמות מהוספות פיפטה מרובות דרושות כדי לתייג אזורים מאוד גדולים של רקמה ורעילות פוטנציאלית מכמויות גדולות של Pluronic / DMSO מסדרה כזו של זריקות רבות, אנו מעדיפים אתר אחד 300-600 מיקרומטר צבע הזרקה ל2 x 2 craniotomy מ"מ. בהשוואה לזריקות עיוורות 14, שני פוטוני ניווט מונחה חזותי סביב כלי דם, שימוש בניגוד שלילי של גופי תא עצביים כדי לקבוע עמדת lamina, ומודד ההתפשטות של הצבע על פליטת לחץ כמדד לעוצמת הקול של תאים שיהיו תווית עם OGB-1 בבוקר, משפרת את איכות טעינת צבע בהכנות שאינן מכרסמות.
הפרוטוקול מתואר כאן מוביל לתיוג מוצלח של נוירונים עם צבעי ניאון בזפתתחומי המייקר geted בכל בעל חיים ניסו. לטעינה בתפזורת עם OGB-1 בבוקר, באופן עקבי לקבל תגובות עוררו-חזותי ב75-100% מתאי העצב צפו בו זמנית 9,15 והטכניקה היא רגישה לזיהוי של פוטנציאל פעולה בודד in vivo 23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי עין R01EY017925 וR21EY020985 ומימון מהיסודות דנה וייטהול לPK אנו מודים גם מתיו Petrella לסיוע בפעולות כירורגיות; גרייס הדיון לאיתור הדנדריטים המוצגים באיור 5A; וPratik Chhatbar עבור הערות על כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||
| 1. Life support/experiment prep | |||||||||
| Isoflurane | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | |||||||
| Isoflurane vaporizer | Midmark | VIP 3000 | |||||||
| Feedback regulated heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7079F | |||||||
| ECG monitor | Digicare Biomedical | LifeWindow Lite | |||||||
| EEG amplifier | A-M Systems | 1800 | |||||||
| EEG display monitor | Hewlett Packard | 78304A | |||||||
| End tidal CO2 monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Optimize ventilation | ||||||
| Carbide drill burrs for drilling bone | Henry Schein | fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip) | |||||||
| Cement for headplate/chamber | Dentsply | 675571, 675572 | |||||||
| Black Powder Tempera Paint | Sargent Art Inc. | 22-7185 | Add to cement to improve light shielding and reduce reflections | ||||||
| Agarose - Type III-A | Sigma | A9793 | For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging | ||||||
| Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness | World Precision Instruments | 502040, 502041 | For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed | ||||||
| Brudon curettes | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Cleaning skull surface | ||||||
| Bone wax | Ethicon | W31G | Quickly stop bleeding | ||||||
| Cotton Tipped Applicator | Electron Microscopy Sciences | 72308-05 | Clean and dry bone surface | ||||||
| Dumont #5CO Forceps | Fine Science Tools | 11295-20 | Grab individual layers of dura or pia | ||||||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | Cut dura | ||||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | To stop bleeding on the dura | ||||||
| Absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Ultra-fast and lint-free wicking of CSF | ||||||
| Blackout material | Thorlabs | BK5 | Shield craniotomy | ||||||
| 2. Dye preparation / injection | |||||||||
| Dimethyl Sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | |||||||
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | Calcium indicator | ||||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | |||||||
| Centrifugal filter (0.45 μm pore size) | Millipore | UFC30HV00 | To remove impurities before injection | ||||||
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P97 | |||||||
| Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Dye ejection pipette | ||||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | For loading dye into pipette | ||||||
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | To position pipette | ||||||
| Pressure pulse controller | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | For pressure injection of the dye | ||||||
| Single-cell electroporator | Molecular Devices | Axoporator 800A | For electroporation of the dye | ||||||
| 3. Intrinsic imaging | |||||||||
| 4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) | Olympus | UPLFLN4X | |||||||
| Intrinsic hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software is used for episodic imaging | ||||||
| CCD Camera | Adimec | Adimec-1000 | |||||||
| Light source power supply | KEPCO | ATE 15-15M | |||||||
| Light source | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW | ||||||
| Green filter (for vascular image) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (bandpass 30 nm) | For reference image of surface vasculature | ||||||
| Red filter (for intrinsic signal) | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm (bandpass 30 nm) | To collect intrinsic signals | ||||||
| Heat filter | Optical Imaging Inc. | KG-1 | |||||||
| 4. Two-photon rig/imaging | |||||||||
| Two-photon microscope and software | Prairie Technologies | See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power | |||||||
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | |||||||
| 20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) | Olympus | UMPLFLN20X | 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging) | ||||||
| 20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) | Olympus | XLUMPLFLN20X | |||||||
| 40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | |||||||
| Air table | Newport | ST-200 | Isolates preparation from external vibrations | ||||||
| xy stage | Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA) | Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage | |||||||
|
|||||||||
References
- Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
- Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
- Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns. Nature. 353, 429-431 (1991).
- Ohki, K., et al. Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels. Nature. 442, 925-928 (2006).
- Shmuel, A., Grinvald, A. Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18. J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).
- Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
- Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity. Nature. 456, 952-956 (2008).
- Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex. Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).
- Kara, P., Boyd, J. D. A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex. Nature. 458, 627-631 (2009).
- da Costa, N. M., Martin, K. A. Whose Cortical Column Would that Be. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16 (2010).
- Kaschube, M., et al. Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex. Science. 330, 1113-1116 (2010).
- Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex. Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).
- Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, 501-505 (2011).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).
- Nevian, T., Helmchen, F. Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation. Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).
- Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex. Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471, 177-182 (2011).
- Rochefort, N. L., et al. Development of direction selectivity in mouse cortical neurons. Neuron. 71, 425-432 (2011).
- Mrsic-Flogel, T. D., et al. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-972 (2007).
- Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. Brain mapping: The Methods. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).
- Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
- Hofer, S. B., et al. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).
