Målrettet Mærkning af neuroner i en specifik funktionel Micro-domæne af neocortex Ved at kombinere Intrinsic-signalet og to-foton Imaging

Summary

Der beskrives en fremgangsmåde til mærkning af neuroner med fluorescerende farvestoffer i forudbestemte funktionelle mikro-domæner i neocortex. For det første er iboende signal optisk billeddannelse anvendes til at opnå et funktionelt kort. Derefter to-foton mikroskopi anvendes til at mærke og billed neuroner i en mikro-domæne af kortet.

Abstract

I den primære visuelle cortex af ikke-gnavere pattedyr, er neuroner klynger efter deres præference for stimulus funktioner såsom orientering ^1-4, retning ^5-7, okulær dominans ^8,9 og kikkert ulighed ^9. Orientering selektivitet er den mest undersøgte funktion og en kontinuerlig kort med en kvasi-periodisk layout for foretrukken orientering er til stede over hele den primære visuelle cortex ^10,11. Integration de synaptiske, cellulære og netværk bidrag, der fører til stimulus selektive svar i disse funktionelle maps kræver hybridisering af billeddannende teknikker, der spænder over sub-mikron til millimeter rumlige skalaer. Med konventionel iboende signal optisk billeddannelse, kan det generelle layout af de funktionelle kort over hele overfladen af den visuelle cortex bestemmes ^12. Udviklingen af in vivo to-foton mikroskopi under anvendelse af calcium-følsomme farver gør det muligt at bestemme synaptic-indgang ankommer til de enkelte dendritiske Torner ¹³ eller optage aktivitet samtidig fra hundredvis af individuelle neuronale cellelegemer ^6,14. Derfor kombinerer iboende signal billeddannelse med sub-micron rumlig opløsning af to-foton mikroskopi giver mulighed for bestemmelse af præcis hvilke dendritiske segmenter og celler bidrager til mikro-domænet af et funktionelt kort i neocortex. Her viser vi et højt udbytte fremgangsmåde til hurtig opnåelse af en cortical orientering kort og med et bestemt mikro-domænet i denne funktionelle kort til mærkning af neuroner med fluorescerende farvestoffer i en ikke-gnaver pattedyr. Med samme mikroskop bruges til to-foton billedbehandling, vi først generere en orientering kortet ved hjælp af iboende signal optisk billeddannelse. Så vi vise, hvordan man målrette en mikro-domæne af interesse ved hjælp af en mikropipette lastet med farvestof til enten etiket en population af neuronale cellelegemer eller etiket en enkelt neuron, således at dendritter, pigge og axoner er synlige ivivo. Vores finjusteringer i forhold til tidligere metoder letter en undersøgelse af neuronale struktur-funktion relationer med sub-cellulær beslutning inden for rammerne af neocortical funktionelle arkitekturer.

Protocol

1. Kirurgisk forberedelse

1. Inducere anæstesi og løbende overvåge puls, ende tidevandsenergi _CO2, EEG og temperatur. Alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg det medicinske universitet i South Carolina og var baseret på dem, vi tidligere har udgivet ^9,15.
2. Blotlægge den dorsale overflade af kraniet ved at skære i huden med et skalpelblad. Dissekere bindevævet ligger over knoglen ved hjælp af en Brudon curette. Rengør knoglen ved hjælp af bomuld tippes applikatorer og bomuldsgaze. Anvende knoglevoks (efter behov) til kraniet, at standse lejlighedsvis blødning gennem små udsending vener.
3. Vedhæfte et titan eller rustfrit stål topplade til kraniet (over området af interesse, hvor kraniotomi vil blive udført) ved hjælp af dentalcement blandet med sort maling (se materialer). En rektangulær åbning i midten af ​​hovedet plade giver adgang for kraniotomi og optisk billeddannelse. Vedhæfte et metalkammer oven på toppladen. Dette kammer vil tjene som et fluidreservoir til billeddannelse med nedsænkning i vand objektivlinse.
4. Fastgør toppladen til et xy scene brug af metal stillinger.
5. Fortynde et stort område af knoglen inden for den rektangulære åbning af hovedpladen ved anvendelse af et tandlægebor. Det område, der skal fortyndes, skal strække sig langt ud over grænserne for den planlagte kraniotomi. Den tykke kranium af ikke-gnavere pattedyr skal fortyndes, hvis billeder med høj opløsning, er at blive erhvervet fra neocortex, fordi i craniotomy site, vil tykkelsen af ​​knoglen diktere tykkelsen af ​​agarose mellem dækglas og neocortical overflade (se nedenfor) .
6. Bor et 2 x 2 mm kvadratisk omrids i knoglen for kraniotomi. Skyl kammeret periodisk med frisk kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) for at fjerne knogle-stykker og minimere varmetab til den underliggende cortex. Anvende knoglevoks efter behov, for at stoppe lejlighedsvis blødning.
7. Lift knoglen klap med et # 3 pincet.
8. Fjerne alle, undtagen det nederste lag af dura med en fin pincet (# 5co) og Vannas fjeder saks. Dura i ikke-gnavere pattedyr er tyk og uklar, men kan fjernes i særskilte lag. Blødning er sjælden, men kan stoppes med Gelfoam og alt blod rest skal fjernes forsigtigt fra det resterende lag af dura med pincet og skylning med ACSF. Den endelige lag af dura er transparent og pial fartøjer bør være klart synlig igennem den. Forlader denne endelige lag af dura intakt under iboende signal billeddannelse vil øge succesraten af ​​bulk lastning af fluorescerende calcium indikatorer for den efterfølgende to-foton imaging fase af forsøget (se Diskussion).
9. Påfør en dråbe varm 2% agarose (opløst i ACSF) og straks placere en dækglas over kraniotomi. Kontroller kraniotomi at sikre, at respiratoriske og kardiovaskulære pulsationer er minimale med en kirurgisk dissektionsmikroskop eller okularerne af den to-foton mikroskop i lyse-field-tilstand.

2. Intrinsic Signal Optical Imaging

1. Tilføj gel-skum gennemvædet med ACSF omkring ydersiden af ​​dækglas for at forhindre agarose tørrer under iboende signal billeddannelse.
2. Fastgør den iboende signal imaging CCD-kamera til standard C-mount-porten oven på to-foton mikroskop (fig. 1). Anbring den belysende lyskilde på luftbordet nær XY-scene (figur 1A). Position og fastgør de lysledere over kraniotomi og hovedpladen / kammer (figur 1B). Tilbagetrække den primære dichroiske og spejlet under den C-mount-port, således at det reflekterede røde lys er nødvendig for iboende signaler vil passere direkte fra kraniotomi til CCD-kamera (figur 1C-D). Ved hjælp af 4x luft målet (0,13 NA, 17 mm WD), et 2 x 2 mm synsfelt er tilgængelig for iboende signal billeddannelse.
3. Sæt et varme filter i light sti for at forhindre cortex fra opvarmning. Brug et filter, som lader grønt lys (546 nm center λ) og optage et digitalt henvisning billede af den kortikale overflade blodkar.
4. Flyt z fokus til 500 um under den kortikale overflade. Brug et rødt filter (630 nm center λ) for at belyse cortex til måling iboende signaler. Placere de lysledere, således at den kortikale overflade er ensartet belyst. Afskærme kraniotomi fra lyset produceret af den visuelle stimulus display. Præsentere en sekvens af visuelle stimuli og optage reflektans data billeder. For at generere en orientering kort inden for 10 min, indsamle data, der svarer til 4 gentagelser af en sekvens på 8 stimuli (4 orienteringer og to retninger for hver orientering).
5. Analyser de iboende signal data til at generere en falsk farve orientering kort. Vælg potentielle målområder for to-foton mærkning af neuroner, f.eks orientering mølle singulariteter - punkter i kortet, hvoralle foretrukne orienteringer konvergerer (figur 2A). Overlejre orienteringen kort og billedet af den kortikale overflade vaskulatur (figur 2B-C). Brug layoutet af funktionelle domæner og placeringen af store overfladefartøjer at vælge et mål, undgå steder med store blodkar og arterioler ^15.

3. Bulk Loading af fluorescerende Calcium Indicators

1. Der fremstilles en opløsning af 20% Pluronic / DMSO ved tilsætning af 1 g Pluronic i 5 pi DMSO. Blandingen opvarmes ved 60 ° C i 10 minutter til fuldstændig opløsning af Pluronic. Lad blandingen afkøle til stuetemperatur. Tilsættes 4 pi af Pluronic / DMSO blandingen til en 50 ug hætteglas af det fluorescerende calciumindikator Oregon Green 488 BAPTA-1 AM (OGB-1:00). Tilsæt derefter 1 ml af en rød farve (Alexa Fluor ® 594, 2 mM stamopløsning) og 35 pi pipette opløsning (se materialer) til en slutkoncentration på 1 mM OGB-1:00. Sonikeres opløsningen i ½ time ien afkølet vandbad og centrifugeres med et 0,45 um filter til fjernelse af urenheder.
2. Trække en lang konus pipette med en ydre spids diameter på 2,0-2,5 um. Indlæse 5 pi af farvestoffet blandingen i pipetten.
3. Fjern den afsluttende lag af dura at lette pipette indføring og opnå den højeste kvalitet to-foton billeder.
4. Bestemme den nøjagtige placering på den kortikale overflade, som pipetten skal placeres med henblik på at nå sit mål i cortical layer 2/3. Vores forudbestemte cortical mål er en mølle singularitet i orienteringen kort (figur 2). Pipetten skal drives ind i cortex ved en 30 ° vinkel for at passere mellem kammervæggen og målet. Således, at mærke målområdet 200 um under den kortikale overflade, vil pipetten ind position på den kortikale overflade være omkring 350 um laterale til målpositionen (fig. 3 AB).
5. Flyt XY-scene (, hvor dyret og pipette mikromanipulator placeres) at centrere den kortikale overflade post position under målet (figur 3C). Brug en 20x eller 40x mål med en arbejdsafstand (WD) på mindst 3 mm (se Materialer) for at sikre, at pipetten let vil komme ind på cortex uden at røre målet eller knoglen langs væggen af kraniotomi. Når posten position er centreret under målet, hæve Z position af målet med 2 mm (figur 3D). Med den grønne epi-fluorescens lys tændt for at visualisere den røde Alexa farvestof i pipetten, skal du bruge diagonal akse mikromanipulator at flytte pipetten indtil spidsen er centreret (og fokuseret) under målet direkte over kortikale overflade indgang position ( figur 3E).
6. Sænke pipetten lodret (langs Z-aksen), indtil pipetten når kortikale overflade (figur 3F), under kontinuerlig visning pipettespidsen gennem OCUlars af mikroskopet. Brug lyse-feltbelysning, den kortikale overflade blodkar og resterende meningeal membraner (pia og arachnoid) er let synlige som pipetten nærmer sig kortikale overflade. Hvis pipetten ikke når den ønskede post position, hæve pipetten og rekalibrere målretning baseret på de vaskulære landmærker på kortikale overflade.
7. Fjern det mål, væge overskydende cerebrospinalvæske fra kraniotomi og tør den tilstødende knogle ved hjælp af fnug-fri absorption spyd. En dråbe varm 3% agarose (opløst i ACSF) at stabilisere cortex, der er synlig gennem kraniotomi (figur 3G). I ikke-gnavere, er 3% agarose nødvendigt at dæmpe svingningerne for en vellykket optagelse af fluorescerende farvestoffer af neuroner. For iboende signal optisk billeddannelse kun 2% agarose er nødvendig, fordi kombinationen af ​​2% agarose og dækglas giver den nødvendige stabilitet. Her er der ikke dækglas anvendes til farvestof-loading trin, så 3% agarosenødvendigt. Efter at agarosen er størknet, indsætte et 40x objektiv (0,8 NA, 3,3 mm WD) og genfylde kammeret med ACSF.
8. Skift fra lys-felt til to-foton visning og find pipettespidsen. Ved hjælp af diagonale akse mikromanipulator, flytter pipetten indtil spidsen når den ønskede dybde i cortex (figur 3H). Lejlighedsvis tryk udkastningsorganer puffs af farvestoffet blanding (et par psi, hver puls 0,1 sek) vil hjælpe med at forhindre pipettespidsen fra tilstopning. Fordi OGB-1:00 kun bliver synlig ved ankomsten celler, det røde Alexa dye er kritisk for visualisering af pipettespidsen inde i cortex.
9. Før indlæsning af neuroner i cortex layer 2/3 med den fulde dosis af farvestof, re-koncentreres målet på den kortikale overflade for at bekræfte dybden af ​​pipettespidsen og sikre, at spidsen er i målplaceringen baseret på opstillingen af overflade blodkar. Hvis pipetten er i layer 2/3, bør små puffs af farvestofblanding belyseekstracellulære rum og afslører en tæt samling af cirkulære cellelegemer som mørke skygger.
10. Til læsning neuronale cellelegemer i en sfære af cortex 300-600 um diameter, injicere farvestofblanding i det ekstracellulære rum med 30-90 impulser, hver impuls 1,0 sek, 2-10 psi. Impulserne af trykket bør ikke være så stærke, at vævet bevæger sig. Efter injektionen er færdig, skal du vente et par minutter, derefter fjerne pipetten og mål. Vent i 1 time for at tillade OGB-1:00 at være fuldt optages af neuroner.
11. Fjern agarose anvendes til farvestoffet lastning og skyl registreringskammer. Put en lille dråbe 2-3% agarose på overfladen og hurtigt placere en dækglas over kraniotomi. Fordi de fluorescerende farvestoffer er lysfølsomme, ikke udsætte cortex til lys-felt eller epi-fluorescerende lys. Indsæt en høj NA (1,0) 20x målsætning i målet holder og re-centrere mærkede kortikale region under målet ved hjælp af xy scenen. Afskærm kraniotomi fra extraneous lyskilder, f.eks visuel stimulus display, ved hjælp af flere lag af blackout materiale.

4. Encellede Elektroporering af fluorescerende farvestoffer

1. For at studere dendritisk morfologi, forberede en opløsning af 100 pM Alexa Fluor 594 (1:20 fortynding i ACSF af 2 mM Alexa Fluor 594 stock). Til funktionel billeddannelse af dendritter et OGB salt kan anvendes ^16,17.
2. Træk en lang tilspidsning pipette med en spids størrelse på 1 um og indlæse 5 pi af farvestof ind i pipetten. Alle andre trin til at målrette et funktionelt domæne er identiske med hovedparten loading metoden (figur 1-3). For at placere pipettespidsen støder op til en neuronal celle kropsmembranen, overvåge stigningen i elektrodeimpedans og pres pust af farvestof at belyse det ekstracellulære rum og se cellelegemer som skygger i løbet af to-foton billedbehandling.
3. Når pipettespidsen støder op til en neuronal celle kropsmembranen, bruge Axoporator 800A at anvende1-3 impulser (-8 til -10 V, 10 msek puls). Den umiddelbare fyldning af neuron med farvestof er let visualiseres med to-foton mikroskopi. Pipetten og indsamle høj opløsning af dendritter og axoner in vivo.

Representative Results

For at illustrere præcisionen af ​​vores farvestof mærkningsmetoder, vi målrettet den mindste mikro-domæne for enhver kendt funktionelt kort i den ikke-gnaver neocortex. Tyndt præget igennem orienteringen kortet i den primære visuelle cortex er singulariteter. Disse forekommer ved punkter, hvor alle foretrukne orienteringer konvergerer således, at i falske farve kort af foretrukken orientering, regionerne omkring singularitet ligne "vejrhaner" (fig. 2A-B). Én mølle pr kraniotomi er valgt for farvestof mærkning (grøn cirkel i figur 2C), og sørg for at undgå store skibe og arterioler i særdeleshed ^15. Med bulk-lastning af OGB-1:00, viser registrering af ændringer i neuronal calciumindikator fluorescens til en sekvens af orienterede rist visuelle stimuli encellede opløsning funktionelle kort omkring mølle singulariteter (figur 4). Med single-celle elektroporering fra den rumlige organisering af dendritter og axoner somIngle neuron placeret på en mølle singularitet bestemmes in vivo (fig. 5).

Figur 1. Intrinsic signal optisk billeddannelse setup. (A) Dyret er placeret på XY-scene og iboende signal billeddannelse udføres via et CCD-kamera monteret på to-foton mikroskop. Lyskilden og computeren anvendes til at styre det billeddannende samling bringes over til opsætningen for iboende billeddannelse og bevæges væk, før den to-foton-billeddannelse fase af forsøget begynder. (B) Luk op visning af 4x mål og 630 nm belysning gennem flydende lysledere. Enten to lysledere fastgjort til metalstolper (venstre) eller en enkelt lysende ring bundet til direkte målet (til højre) kan anvendes. Blackout materiale, der anvendes til skærmer mål fra eksterne kilder til belysning, er bl.a., visuel stimulus display under optiske billeddannende sessioner, ikke vist. (C) Skematisk af mikroskopet og lysbanen i den konventionelle to-foton imaging konfiguration. Se Supplerende Fig. 20 i Shen et al. 2012 ¹⁵ for en beskrivelse af det komplette to-foton lys sti. Den tilbagetrækkelige spejl er anbragt til at afbøje lyset fra laseren gennem den dikroiske og på cortex. Den primære dichroiske, der passerer laserstrålen og reflekterer det udsendte lys fra cortex til PMT s, bevæges ind i lysbanen ved at dreje filteret turret. (D) For intrinsic imaging spejlet trækkes tilbage og filteret revolverhovedet drejes for at bevæge den primære dikroiske af vejen, så en direkte lysbane fra cortex til CCD-kameraet. se større tal .

nt "fo: keep-together.within-page =" altid ">

Figur 2. Brug af funktionelle maps opnået med iboende signal scanning for at vælge et mikro-domæne til mærkning af neuroner med fluorescerende farvestoffer. (A) Orientering kort fra kat primære visuelle cortex erhverves via iboende signal optisk billeddannelse. Farven af ​​hver pixel repræsenterer den foretrukne orientering på det sted. Potentielle orientering mølle singulariteter er egnet til mærkning af neuroner med fluorescerende farvestoffer er vist i sorte cirkler. (B) kort af kortikale overflade blodkar overlejret med orienteringen kortet. (C) Pinwheels inden røde cirkler er nær store blodkar eller arterioler og så den mølle sted inden for det grønne cirkel er valgt som mål for farvestof mærkning. Den stiplede rektangel svarer til den region, vist i figur 3B. Scale bar in (A) 500 μ m.

Figur 3. Optimering af pipetten placering for lastning neuroner med fluorescerende farvestoffer. (A) Skematisk afbildning af optagelsen kammer viser, at farvestoffet lastestedet at målrette indsatsen på visuelle cortex (rød-hvide plet) er ~ 200 um under den kortikale overflade. Xy koordinat for målet svarer til placeringen af et orienterende mølle singularitet bestemt ud fra iboende signal billeddannelse. Pipetten vil komme ind i cortex ved en 30 ° vinkel. Hvis den kortikale overflade er parallel med XY-scene overflade, vil pipettespidsen bevæge sig lateralt omkring 350 um før de når mølle singularitet. (B) set fra oven optagelse kammer viser den kortikale overflade kar og pipetten indgang position (rød stjerne) thpå er 350 um fra den mølle singularitet. (C) The XY-scene position indstilles således, at pipetten indgangspositionen er centreret under 20x eller 40x objektiv (3,3-3,5 mm WD). (D) Formålet hæves ~ 2 mm. (E) Pipetten føres over kraniotomi og dens spids er placeret direkte over indgangspositionen på den kortikale overflade ved anvendelse af grønt epi-fluorescerende lys. (F) Pipetten og mål sænkes samtidig med lyse-feltbelysning indtil den kortikale overflade blodkar kommer i fokus. (G) Målet og ACSF fjernes, og et fald på 3% agarose påføres over kraniotomi. (H) To-foton visualisering med et 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) mål anvendes til at følge pipetten ned til den valgte cortical dybde og injicere farvestoffet. Efter bekræftelse af, at neuroner med succes mærket med fluorescerende farvestof, typisk en højere NA 20x objektiv (1,0 NA, 2,0 mm WD) anvendes til at indsamle to-foton t - og z-seriedata. Skematisk s er vist i A, CH ikke målestokstro.

Figur 4. Korrespondance af orientering præference i to-foton og iboende signal billeddannelse funktionelle maps. (A) To-foton afbildede område viser cellelegemer mærket med OGB-1 AM i visuelle cortex layer 2/3. (B) Orientering præference af individuelle neuronale cellelegemer fra samme sted som angivet i (A). Omkring mølle singularitet, der var centreret i det afbildede område er en organiseret kort over foretrukne stimulus orientering. (C) Orienteringen kort opnået med iboende signal billeddannelse. Den sorte firkant svarer til den region der er vist i (B). Disse data blev opnået fra det samme forsøg er vist i figur 2A-C og 3B. Scale bar in (AB) 100 um og (C) 500 um.

d/50025/50025fig5.jpg "/>
Figur 5. In vivo morfologi af en enkelt neuron i en orientering mølle singularitet. (A) dendritter og cellelegeme af en enkelt neuron overlejret med orienteringen kort fra det samme visuelle cortex sted. Neuron blev elektroporeret med Alexa Fluor 594 under to-foton vejledning blev en z-stak opsamlet in vivo og dendritiske processer blev sporet offline med Neurolucida software. Orienteringen kort blev opnået ved anvendelse iboende signal billeddannelse før encellede elektroporering. (B) Gennemsnitlig intensitet 10-um-z-fremskrivning fra kortikale lag 1 viser apikale dendritter. (CD) Gennemsnitlig intensitet 10-um-z-fremskrivninger fra kortikale lag 2/3 viser basale dendritter og axoner. Røde pile viser pigge langs dendritter og hvide pile peger på de enkelte axoner. Scale barer i (AD) 100 um.

Discussion

Vi præsenterer en fremgangsmåde til at målrette mærkning af neuronale cellelegemer (eller dendritter og axoner) i forudbestemte funktionelle mikro-domæner i neocortex. Sammenfletning iboende signal optisk billeddannelse med to-foton mikroskopi giver mulighed for bestemmelse af, hvilke synapser og celler bidrager til mikro-domænet af et funktionelt kort, hvad enten neuronale selektivitet korrelerer med placeringen af ​​neuron i et funktionelt kort, og det neuronale kredsløbskomponenter denne ændring med visuel oplevelse ⁷ eller anvendelsen af klinisk terapeutiske lægemidler ^18.

Ingen kort til stimulus retning, retning, okulær dominans eller binokulært forskel er blevet rapporteret i den visuelle cortex hos voksne vildtype-gnavere ^6,19-21. Imidlertid er lettere at lægge de neuroner med fluorescerende farvestoffer og opnå imaging stabilitet, sammen med de stærke genetiske værktøjer til rådighed for mus resulterede i langt de fleste undersøgelseranvendelse af to-foton-billeddannelse af hjernebarken udføres i gnavere stedet for fritte, katte og aber.

Høj opløsning to-foton billeddannelse af neuroner i ikke-gnavere pattedyr kan være meget udfordrende på grund af lange kirurgi gange, tykkere ben og dura, og ekstra skridt, der er nødvendige for at holde respiratoriske og kardiovaskulære medierede pulsationer af hjernen til et minimum ^15. Overgange fra kirurgi til iboende signal billedbehandling og uløseligt forbundet med to-foton billedbehandling skal være effektiv, kræver rettidig forberedelse af reagenser, farvestoffer og udførelse af mikro-kirurgiske procedurer. Ved hjælp af to-foton mikroskop for iboende signal imaging undgår behovet for en stor del af udstyr, der anvendes i konventionelle iboende signal optisk billeddannelse rigge ²² og reducerer den tid, der kræves for at indstille iboende billeddannelse og overgang til efterfølgende to-foton-billeddannelse.

Vores tilgang er specielt designet til at give høj opløsning to-photon billeddannelse i forudbestemte funktionelle domæner. Dette giver minimal cross-talk af funktionelle signaler mellem neuronale cellelegemer og individuelle dendritiske udløberne og axoner kan løses in vivo. Anvendelse af en høj numerisk apertur (NA = 1,0) mål og fylde den bageste åbning af målet med beam ekspansion optik (se supplerende fig. 20 i Shen et al. 2.012 ¹⁵⁾ er kritiske for høj opløsning billeddannelse. Afhængig af hastigheden af ​​billeddannelse i XY og / eller Z, kan respiratoriske og kardiovaskulære svingningerne reducere den effektive imaging løsning, uanset hvor god NA og optiske lysvej er. Ved at begrænse kraniotomi størrelsen hos ikke-gnavere til 2 x 2 mm, ved hjælp af relativt højere koncentration af agarose med et dækglas, og udfører en pneumothorax og lændehvirvelsøjlen suspension når det er nødvendigt ^15, hjerne pulsationer er begrænset til 1-2 um. Minimering respiratoriske og kardiovaskulære inducerede pulsationer i neocortex til 1-2 um under løslastning af calcium indikatorer sikrer også, at cortex danner en tætning omkring den indsatte pipette og at ingen farvestof sporer op langs skaftet af pipette til den kortikale overflade. Valg af farve injektion og billeddannelse sites væk fra store arterioler er også kritisk for høj kvalitet funktionel billeddannelse, fordi relativt hurtige sanse-fremkaldt hyperæmi (hæmodynamisk) artefakter vil blive udelukket ^15.

På kraniotomi site, der forlader det sidste lag af dura intakt i hele den indre signal billedbehandling og fluorescerende farvestof forberedelse faser - og dermed fjerne det lige før pipetten indsættelse i cortex for farvestof loading - øger succesraten og kvaliteten af ​​neuronal mærkning i det følgende måder: (1) holder den kortikale overflade ren og / eller forhindrer dural væv genvækst, således at pipettespidsen er mindre tilbøjelige til at få fyldt op og gennemsigtigheden af ​​vævene sker, (2) undgår agarosen, der anvendes til egentlig billedbehandling røre cortriske overflade blodkar, som kan blive beskadiget, når agarose er fjernet, (3) forhindrer agarose anvendes under iboende billeddannelse i at komme ind mellem dura og cortex under kraniet omkring kanterne af kraniotomi. Agarose i disse regioner vil forøge afstanden mellem dækglas og den kortikale overflade, der gør indsættelsen af ​​pipetten vanskeligere, fører til sammentrykning af cortexvæv og mindsker gennemsigtigheden til billeddannelse.

Ved udarbejdelsen af ​​AM-fluorescerende farvestoffer for bulk belastning, bør 20% Pluronic / DMSO blanding aldrig anvendes efter 1 uge fra sin oprindelige forberedelse - gammel Pluronic / DMSO slukker fluorescens. For optimal bulk-ladning af mange tilstødende cellelegemer med en funktionel indikator, f.eks OGB-1 AM, er det farvestofblanding opbevares på is, læsset ind i pipetten efter behov, men altid sprøjtes ind i hjernen inden for 2 timer af sin forberedelse.

Under størstedelen loading faseeksperimentet, gentages 1 sek impulser af tryk snarere end en kontinuert injektion af 1 min tillader iterativ kalibrering af ejektion parametre, som sikrer, at overskudsfarve eller tryk ikke anvendes. På grund af den potentielle vævsbeskadigelse fra flere pipettespidser insertioner er nødvendige for at mærke meget store regioner af væv og potentiel toksicitet af store mængder Pluronic / DMSO ved en sådan serie af mange injektioner, foretrækker vi en 300-600 um farvestof injektionsstedet per 2 x 2 mm kraniotomi. Sammenlignet med blinde injektioner ^14, to-foton visuelt styret navigation omkring blodkar, anvendelse af negativ kontrast i neuronale cellelegemer at bestemme lamina position, og måle spredningen af farvestoffet ved tryk udstødning som et indeks for mængden af celler, som vil være mærket med OGB-1 AM, forbedrer kvaliteten af ​​farvestof belastning i ikke-gnavere præparater.

Protokollen er beskrevet her fører til en vellykket mærkning af neuroner med fluorescerende farvestoffer i tjæretet mikro-domæner i hvert dyr forsøges. For bulk belastning med OGB-1:00, konsekvent opnår vi visuelt-fremkaldte reaktioner i 75-100% af samtidigt afbildet neuroner ^9,15 og teknikken er følsom for påvisningen af enkelte aktionspotentialer in vivo ^23,24.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Life support/experiment prep
Isoflurane	Webster Vet	NDC 57319-474-05
Isoflurane vaporizer	Midmark	VIP 3000
Feedback regulated heating blanket	Harvard Apparatus	50-7079F
ECG monitor	Digicare Biomedical	LifeWindow Lite
EEG amplifier	A-M Systems	1800
EEG display monitor	Hewlett Packard	78304A
End tidal CO2 monitor	Respironics	Novametrix Capnoguard 1265	Optimize ventilation
Carbide drill burrs for drilling bone	Henry Schein	fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip)
Cement for headplate/chamber	Dentsply	675571, 675572
Black Powder Tempera Paint	Sargent Art Inc.	22-7185	Add to cement to improve light shielding and reduce reflections
Agarose - Type III-A	Sigma	A9793	For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging
Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness	World Precision Instruments	502040, 502041	For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed
Brudon curettes	George Tiemann	105-715-0, 105-715-3	Cleaning skull surface
Bone wax	Ethicon	W31G	Quickly stop bleeding
Cotton Tipped Applicator	Electron Microscopy Sciences	72308-05	Clean and dry bone surface
Dumont #5CO Forceps	Fine Science Tools	11295-20	Grab individual layers of dura or pia
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03	Cut dura
Gelfoam	Pfizer	09-0396-05	To stop bleeding on the dura
Absorption spears	Fine Science Tools	18105-01	Ultra-fast and lint-free wicking of CSF
Blackout material	Thorlabs	BK5	Shield craniotomy
2. Dye preparation / injection
Dimethyl Sulphoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Pluronic	Sigma	P2443
Oregon Green 488 Bapta-1 AM	Invitrogen	O6807	Calcium indicator
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A10438
Centrifugal filter (0.45 μm pore size)	Millipore	UFC30HV00	To remove impurities before injection
Glass pipette puller	Sutter Instruments	P97
Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter)	World Precision Instruments	1B150F-4	Dye ejection pipette
Microloader	Eppendorf	5242 956 003	For loading dye into pipette
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285	To position pipette
Pressure pulse controller	Parker Hannifin	PicoSpritzer III	For pressure injection of the dye
Single-cell electroporator	Molecular Devices	Axoporator 800A	For electroporation of the dye
3. Intrinsic imaging
4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD)	Olympus	UPLFLN4X
Intrinsic hardware / software	Optical Imaging Inc.	Imager 3001 / VDAQ	VDAQ software is used for episodic imaging
CCD Camera	Adimec	Adimec-1000
Light source power supply	KEPCO	ATE 15-15M
Light source	Optical Imaging Inc.	HAL 100	Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW
Green filter (for vascular image)	Optical Imaging Inc.	λ = 546 nm (bandpass 30 nm)	For reference image of surface vasculature
Red filter (for intrinsic signal)	Optical Imaging Inc.	λ = 630 nm (bandpass 30 nm)	To collect intrinsic signals
Heat filter	Optical Imaging Inc.	KG-1
4. Two-photon rig/imaging
Two-photon microscope and software	Prairie Technologies		See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai XF
20x (0.5 NA; 3.5 mm WD)	Olympus	UMPLFLN20X	0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging)
20x (1.0 NA; 2.0 mm WD)	Olympus	XLUMPLFLN20X
40x (0.8 NA; 3.3 mm WD)	Olympus	LUMPLFLN40X/IR
Air table	Newport	ST-200	Isolates preparation from external vibrations
xy stage	Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA)		Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage
Recipes Artificial Cerebro-Spinal Fluid NaCl (135 mM), KCl (5.4 mM), MgCl2 (1.0 mM), CaCl2 (1.8 mM), HEPES (5 mM), pH 7.4 Pipette Solution14 NaCl (150 mM), KCl (2.5 mM), HEPES (10 mM), pH 7.4