Etiquetage des neurones ciblés dans une fonction spécifique à micro-domaine du néocortex par combinaison du signal intrinsèque et à deux photons d'imagerie

Summary

On décrit une méthode pour l'étiquetage des neurones avec des colorants fluorescents dans prédéterminées fonctionnels micro-domaines du néocortex. Tout d'abord, l'imagerie optique intrinsèque de signal est utilisé pour obtenir une carte fonctionnelle. Puis microscopie à deux photons est utilisée pour l'étiquette et les neurones d'image dans un domaine micro-de la carte.

Abstract

Dans le cortex visuel primaire de non-rongeurs mammifères, les neurones sont regroupés en fonction de leur préférence pour les fonctions de relance comme l'orientation ^1-4, direction ^5-7, dominance oculaire ^8,9 et la disparité binoculaire ^9. Sélectivité orientation est la caractéristique la plus largement étudiée et une application continue avec une mise en quasi-périodique pour l'orientation préférée est présent sur ​​l'ensemble du cortex visuel primaire ^10,11. Intégrant les apports synaptiques, cellulaires et le réseau qui conduisent à des réponses de stimulation sélective de ces cartes fonctionnelles nécessite l'hybridation des techniques d'imagerie qui couvrent sub-micron au millimètre échelles spatiales. À l'imagerie optique intrinsèque signal conventionnel, la disposition générale de cartes fonctionnelles sur toute la surface du cortex visuel peut être déterminé ^12. Le développement in vivo de microscopie à deux photons à l'aide de calcium colorants sensibles permet de déterminer la SYNAPTentrée ic arriver à épines dendritiques individuelles ¹³ ou enregistrement d'activité simultanément à partir des centaines de différents corps cellulaires neuronaux ^6,14. Par conséquent, en combinant l'imagerie signal intrinsèque à la résolution spatiale submicronique de microscopie à deux photons offre la possibilité de déterminer exactement quels segments dendritiques et des cellules de contribuer au domaine des micro-carte fonctionnelle de tout dans le néocortex. Ici, nous démontrons une méthode à haut rendement permettant d'obtenir rapidement une carte d'orientation corticale et en ciblant un micro-domaine de cette carte fonctionnelle pour l'étiquetage des neurones avec des colorants fluorescents chez un mammifère non-rongeur. Avec le même microscope utilisé pour l'imagerie à deux photons, nous avons d'abord générer une carte d'orientation à l'aide d'imagerie optique intrinsèque du signal. Ensuite, nous montrons comment cibler un micro-domaine d'intérêt en utilisant une micropipette chargée avec de la teinture d'étiquette soit une population de corps cellulaires neuronaux ou l'étiquette d'un seul neurone tels que des dendrites et des axones, les épines sont visibles dansvivo. Nos améliorations par rapport aux méthodes antérieures de faciliter l'examen des neurones relations structure-fonction avec sub-cellulaire résolution dans le cadre du néocortex architectures fonctionnelles.

Protocol

1. Préparation chirurgicale

1. Induire une anesthésie et surveiller en permanence le rythme cardiaque, la fin de la marée CO _2, EEG, et de la température. Toutes les procédures ont été approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation de la Medical University of South Carolina et étaient basées sur celles que nous avons déjà publié ^9,15.
2. Exposer la surface dorsale du crâne en coupant la peau avec une lame de scalpel. Disséquer les tissus conjonctifs qui recouvrent l'os à l'aide d'une curette Brudon. Nettoyez l'os en utilisant des applicateurs à embout de coton et gaze de coton. Appliquez la cire à os (au besoin) pour le crâne, pour arrêter les saignements occasionnels à travers de petites veines émissaires.
3. Attacher une plaque en titane ou en acier inoxydable tête en acier au crâne (sur la région d'intérêt où la craniotomie sera effectué) à l'aide de ciment dentaire mélangé avec de la peinture noire (voir Matériels). Une ouverture rectangulaire dans le centre de la plaque de tête permet d'accéder à la craniotomie et d'imagerie optique. Attacher une chambre de métal sur le dessus de la plaque de tête. Cette chambre se servir de réservoir de fluide pour l'imagerie avec la lentille d'objectif à immersion d'eau.
4. Fixez la plaque de tête à un stade xy en utilisant des poteaux métalliques.
5. Amincir une grande surface de l'os à l'intérieur de l'ouverture rectangulaire de la plaque de tête à l'aide d'une fraise de dentiste. La zone à être dilué doit s'étendre bien au-delà des limites de la craniotomie prévu. Le crâne épais de non-rongeurs mammifères doivent être éclaircis si des images haute résolution sont à acquérir auprès du néocortex, car sur le site de craniotomie, l'épaisseur de l'os va dicter l'épaisseur de la gélose entre la lamelle et la surface du néocortex (voir ci-dessous) .
6. Percer un trou de 2 x 2 mm contour carré dans l'os de la craniotomie. Rincer la chambre périodiquement avec des produits frais liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) pour enlever des éclats d'os et de minimiser la dissipation de la chaleur vers le cortex sous-jacent. Appliquez la cire à os selon les besoins, pour arrêter les saignements occasionnels.
7. Lift le volet osseux avec une pince n ° 3.
8. Retirez tous, mais la couche inférieure de durée à l'aide d'une amende pince (# 5CO) et des ciseaux à ressort Vannas. La dure-mère en non-mammifères rongeurs est épaisse et opaque, mais peut être enlevé en couches distinctes. Le saignement est rare mais peut être arrêté avec Gelfoam et tout résidu de sang doit être doucement retiré de la couche restante de durée en utilisant une pince et un rinçage à l'ACSF. La dernière couche de dure-mère est transparente et les vaisseaux pie-mère doit être clairement visible à travers elle. En sortant de cette dernière couche de durée intacte lors de l'imagerie signal intrinsèque augmente le taux de réussite de chargement en vrac des indicateurs de calcium fluorescentes pour la phase d'imagerie à deux photons ultérieure de l'expérience (voir discussion).
9. Appliquez une goutte d'eau tiède agarose à 2% (dissous dans ACSF) et placer immédiatement une lamelle sur la craniotomie. Vérifiez la craniotomie pour s'assurer que les pulsations respiratoires et cardiovasculaires sont minimes à l'aide d'un microscope chirurgical de dissection ou les oculaires des deux-microscope photonique à champ lumineux mode.

2. Intrinsèque du signal d'imagerie optique

1. Ajouter gel-mousse imbibée d'ACSF autour de l'extérieur du couvre-objet pour empêcher l'agarose de séchage au cours de l'imagerie de signal intrinsèque.
2. Fixer le signal de formation d'image CCD intrinsèque à la norme monture C orifice sur le dessus du microscope à deux photons (figure 1). Placez la source de lumière d'éclairage sur la table de l'air près de la scène xy (figure 1A). Positionner et fixer les guides de lumière sur la craniotomie et plaque de tête / chambre (figure 1B). Rétracter la dichroïque primaire et le miroir au-dessous de l'orifice de montage C de sorte que la lumière réfléchie rouge nécessaire pour des signaux intrinsèques passera directement de la craniotomie de la caméra CCD (figure 1C-D). Utilisation de l'objectif 4x air (0,13 NA, 17 mm WD), un champ de 2 x 2 mm de vue est disponible pour l'imagerie signal intrinsèque.
3. Insérer un filtre de chaleur dans la light chemin pour éviter le cortex de chauffage. Utilisez un filtre qui laisse passer la lumière verte (546 nm centre λ) et enregistrer une image numérique de référence des vaisseaux sanguins de surface corticale.
4. Déplacer le focus z à 500 um en dessous de la surface corticale. Utiliser un filtre rouge (630 nm centre λ) pour illuminer le cortex pour mesurer des signaux intrinsèques. Positionner les guides de lumière de telle sorte que la surface corticale est éclairé de façon uniforme. Protéger la craniotomie de la lumière produite par le stimulus visuel d'affichage. Présenter une séquence de stimuli visuels et d'enregistrer des images de réflectance de données. Pour générer une carte d'orientation à l'intérieur de 10 min, collecter des données correspondant à 4 répétitions d'une séquence de stimuli 8 (4 orientations et deux directions pour chaque orientation).
5. Analyser les données de signal intrinsèque pour générer une carte en fausses couleurs orientation. Sélectionnez régions cibles potentielles pour les deux photons étiquetage des neurones, par exemple, l'orientation des singularités moulinet - points dans la carte oùtoutes les orientations préférentielles convergent (Figure 2A). Superposer la carte et l'orientation de l'image de la vascularisation de la surface corticale (figure 2B-C). Utiliser la mise en page de domaines fonctionnels et l'emplacement des bateaux de grandes surfaces pour sélectionner une cible en évitant les endroits les gros vaisseaux sanguins et des artérioles ^15.

3. Chargement en vrac des indicateurs de calcium fluorescentes

1. Préparer une solution de Pluronic 20% / DMSO en ajoutant 1 Pluronic g dans 5 ul de DMSO. Chauffer le mélange à 60 ° C pendant 10 min pour dissoudre complètement le Pluronic. Laissez le mélange refroidir à température ambiante. Ajouter 4 pl du mélange Pluronic / DMSO dans un flacon de 50 mg de calcium de l'indicateur fluorescent Oregon Green 488 BAPTA-1 AM (OGB-1 AM). Puis ajoutez 1 ul d'un colorant rouge (Alexa Fluor 594, solution mère 2 mM) et 35 ul de solution de la pipette (voir Matériel) pour une concentration finale de 1 mM OGB-1 AM. Soniquer la solution pendant une demi-heure dansun bain d'eau glacée, puis centrifuger avec un filtre de 0,45 um pour éliminer les impuretés.
2. Tirez une pipette cône long avec un diamètre extérieur de 2,0 à 2.5 pointe um. Chargez 5 ul du mélange de colorants dans la pipette.
3. Enlever la couche finale de durée pour faciliter l'insertion de pipette et obtenir la meilleure qualité d'images à deux photons.
4. Déterminer l'emplacement exact sur la surface corticale que la pipette doit être placé de manière à atteindre son objectif dans la couche corticale 2/3. Notre cible prédéterminée corticale est une singularité moulinet dans le plan d'orientation (figure 2). La pipette doit être enfoncé dans le cortex à un angle de 30 ° pour passer entre la paroi de la chambre et l'objectif. Ainsi, pour marquer la zone cible 200 um en dessous de la surface corticale, la position d'entrée de pipette sur la surface corticale sera d'environ 350 um latérales de la position de consigne (figure 3 AB).
5. Déplacer la table XY (sur lequel l'animal et le pmicromanipulateur ipette sont placés) au centre de la position de l'entrée de la surface corticale titre de l'objectif (figure 3C). Utilisez un objectif 20x ou 40x avec une distance de travail (WD) d'au moins 3 mm (voir Matériel) pour s'assurer que la pipette sera facilement entrer dans le cortex sans toucher l'objectif ou de l'os le long de la paroi de la craniotomie. Une fois la position d'entrée est centrée titre de l'objectif, relever la position Z de l'objectif de 2 mm (figure 3D). Avec l'épi-fluorescence verte de lumière activé pour visualiser le colorant rouge Alexa dans la pipette, l'utilisation de l'axe diagonal de la micromanipulateur pour déplacer la pipette jusqu'à ce que sa pointe est centrée (et concentrée) de l'objectif au dessus de la position d'entrée de la surface corticale ( Figure 3E).
6. Abaissez la verticale pipette (le long de l'axe z) jusqu'à ce que la pipette atteint la surface corticale (figure 3F), tout en continuant à visualiser la pointe de pipette à travers le oculars du microscope. Utilisation éclairage sur fond clair, les vaisseaux sanguins de surface corticales et autres membranes méningées (pie-mère et arachnoïde) sont facilement visibles dans la pipette se rapproche de la surface corticale. Si la pipette ne pas atteindre la position souhaitée d'entrée, augmenter la pipette et recalibrer le ciblage sur la base des repères vasculaires sur la surface corticale.
7. Retirez l'objectif, mèche excès de liquide céphalorachidien de la craniotomie et sécher l'os adjacent en utilisant des lances d'absorption non pelucheux. Appliquez une goutte d'eau tiède 3% d'agarose (dissous dans ACSF) pour stabiliser le cortex qui est visible à travers la craniotomie (figure 3G). Chez les non-rongeurs, agarose à 3% est nécessaire pour amortir les pulsations de l'absorption réussie de colorants fluorescents par des neurones. Pour l'imagerie optique intrinsèque signal de seulement 2% d'agarose est nécessaire parce que la combinaison de 2% d'agarose et la lamelle assure la stabilité nécessaire. Ici, pas de couvre-objet est utilisé pour l'étape de chargement afin de colorant 3% d'agarose estnécessaire. Après l'agarose est solidifié, insérer un objectif 40x (0,8 NA, 3,3 mm DEO) et re-remplir la chambre avec ACSF.
8. Passez du champ lumineux à deux photons de visualisation et de localiser la pointe de la pipette. À l'aide de l'axe diagonal de la micromanipulateur, déplacer la pipette jusqu'à ce que son extrémité atteint la profondeur désirée dans le cortex (figure 3H). Occasionnelles bouffées d'éjection de pression du mélange de colorants (un peu psi, chaque impulsion 0,1 sec) aidera à prévenir la pointe de la pipette de colmatage. Car OGB-1 heures ne devient visible lors de l'entrée des cellules, le rouge Alexa colorant est critique pour la visualisation de la pointe de la pipette à l'intérieur du cortex.
9. Avant d'essayer de charger des neurones dans la couche corticale 2/3 avec la pleine dose de colorant, re-concentrer sur l'objectif de la surface corticale pour confirmer la profondeur de la pointe de pipette et faire en sorte que la pointe se trouve à l'emplacement cible en fonction de la disposition des les vaisseaux sanguins de surface. Si la pipette est dans la couche 2/3, de petites bouffées du mélange de colorants devraient éclairer laespace extracellulaire et de révéler un ensemble dense de corps cellulaires circulaires que les ombres sombres.
10. Pour le chargement de corps cellulaires neuronaux dans une sphère de diamètre 300-600 um cortex, injecter le mélange de colorants dans l'espace extracellulaire en utilisant 30-90 impulsions, chaque impulsion 1,0 s, 2-10 psi. Les impulsions de pression ne doit pas être si forte que le tissu se déplace. Après l'injection est terminée, attendez quelques minutes, puis retirer la pipette et objective. Attendez pendant 1 heure pour permettre à l'OGB-1 AM à être pleinement prises en livraison par les neurones.
11. Retirer l'agarose utilisé pour la charge de colorant et rincer la chambre d'enregistrement. Mettez une petite goutte de 2-3% d'agarose sur la surface et placer rapidement une lamelle sur la craniotomie. Parce que les colorants fluorescents sont sensibles à la lumière, évitez de surexposer le cortex de champ lumineux ou épi-lumière fluorescente. Insérer une grande ouverture numérique (1,0) 20x objectif dans la monture d'objectif et recentrer la région corticale marquée titre de l'objectif en utilisant la scène xy. Protégez la craniotomie de l'exdes sources de lumière, par exemple des traneous affichage stimulus visuel, en utilisant des couches multiples de matériau panne.

4. Une seule cellule électroporation de colorants fluorescents

1. Pour étudier la morphologie dendritique, préparer une solution de 100 uM Alexa Fluor 594 (dilution 1:20 dans ACSF de 2 mM Alexa Fluor 594 actions). Pour l'imagerie fonctionnelle des dendrites d'un sel d'OGB peuvent être utilisées ^16,17.
2. Tirez une pipette cône de long avec un diamètre de buse de 1 um et charger 5 ul de colorant dans la pipette. Toutes les autres étapes de cibler un domaine fonctionnel sont identiques à la méthode de chargement en vrac (figures 1-3). Pour positionner la pointe de pipette adjacente à une membrane le corps des cellules neuronales, de surveiller l'augmentation de l'impédance d'électrode et d'appliquer des bouffées de pression de colorant pour éclairer l'espace extracellulaire et de voir les corps cellulaires comme des ombres au cours de deux photons d'imagerie.
3. Lorsque la pointe de la pipette est adjacente à une membrane de cellule neuronale corps, utiliser le 800A Axoporator à appliquerImpulsions 1-3 (-8 à -10 V, 10 ms d'impulsion). Le remplissage immédiat du neurone avec le colorant est facilement visualisées avec microscopie à deux photons. Retirer la pipette et de recueillir des images haute résolution des dendrites et des axones in vivo.

Representative Results

Pour illustrer la précision de nos méthodes de marquage colorant, nous avons ciblé le plus petit micro-domaine d'une carte fonctionnelle connue dans le néocortex non-rongeur. Peu ponctué toute la carte d'orientation dans le cortex visuel primaire sont des singularités. Ils se produisent en des points où convergent toutes les orientations privilégiées telles que les cartes en fausses couleurs de l'orientation préférée, les régions autour de la singularité regard comme "moulinets" (Figure 2A-B). Un moulinet par craniotomie est sélectionné pour la teinture d'étiquetage (cercle vert sur ​​la figure 2C), en veillant à éviter les gros vaisseaux et des artérioles en particulier ^15. Avec chargement en vrac de l'OGB-1 AM, le suivi des changements dans la fluorescence de calcium indicateur neuronale à une séquence de stimuli visuels orientés grille révèle cartes résolution unicellulaires fonctionnelles autour des singularités moulinet (figure 4). Avec une seule cellule électroporation, l'organisation spatiale des dendrites et des axones d'aussiingle neurone situé à une singularité moulinet est déterminée in vivo (figure 5).

Figure 1. Intrinsèque installation d'imagerie de signal optique. (A) l'animal est placé sur la platine XY et d'imagerie de signal intrinsèque est effectuée par l'intermédiaire d'une caméra CCD montée sur le microscope à deux photons. La source de lumière et l'ordinateur utilisé pour contrôler la session de formation d'image est présentée sur la configuration de l'imagerie intrinsèque et éloigné avant la phase de formation d'image à deux photons de début de l'expérience. (B) Gros plan sur l'objectif 4x et l'illumination 630 nm par guides de lumière liquides. Soit deux guides de lumière attaché à des poteaux métalliques (à gauche), ou un seul anneau attaché à éclairer directement l'objectif (à droite) peut être utilisé. Blackout matériau utilisé pour protéger l'objectif de sources extérieures d'éclairage, par exemple, l'affichage stimulus visuel, au cours des sessions d'imagerie optique, non représenté. (C) Schéma du microscope et chemin de lumière dans la configuration de l'imagerie à deux photons classique. Voir Fig supplémentaire. 20 en Shen et al. 2012 ¹⁵ pour une description de la trajectoire de la lumière à deux photons complète. Le miroir escamotable est positionnée pour dévier la lumière provenant du laser à travers le miroir dichroïque et sur la corticale. La dichroïque primaire, qui passe le faisceau laser et réfléchit la lumière émise à partir de l'écorce de la PMT, est déplacé dans le trajet de la lumière en faisant tourner la tourelle de filtre. (D) Pour l'imagerie intrinsèque du miroir est rentré et la tourelle filtre est activé pour déplacer le dichroïque primaire de la route, ce qui permet un chemin de lumière directe du cortex vers la caméra CCD. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 2. Utilisation des cartes fonctionnelles obtenues par imagerie signal intrinsèque de sélectionner un domaine micro-étiquetage pour les neurones avec des colorants fluorescents. Carte d'orientation (A) de chat cortex visuel primaire acquise par imagerie optique intrinsèque du signal. La couleur de chaque pixel représente l'orientation préférée à cet endroit. Potentiels singularités moulinet d'orientation appropriés pour l'étiquetage des neurones avec des colorants fluorescents sont représentées au sein des cercles noirs. (B) La carte de corticaux vaisseaux sanguins de surface recouverte par la carte d'orientation. (C) Roulades au sein des cercles rouges se trouvent à proximité des gros vaisseaux sanguins ou des artérioles et si le site pinwheel dans le cercle vert est choisi comme cible pour l'étiquetage colorant. Le rectangle en pointillés correspond à la zone représentée sur la figure 3B. La barre d'échelle en (A) 500 &mu, m.

Figure 3. Optimiser le placement de pipette pour le chargement des neurones avec des colorants fluorescents. (A) Schéma vue de côté de la chambre d'enregistrement montre que le site charge de colorant à cibler dans le cortex visuel (oeil de boeuf rouge et blanc) est ~ 200 um en dessous de la corticale surface. La coordonnée xy de la cible correspond à l'emplacement d'une singularité moulinet orientation déterminée à partir du signal d'imagerie intrinsèque. La pipette entrera dans le cortex selon un angle de 30 °. Si la surface corticale est parallèle à la surface de la platine XY, l'embout de pipette se déplace latéralement d'environ 350 um avant d'atteindre la singularité moulinet. (B) Vue de dessus de chambre d'enregistrement montre la vascularisation de la surface corticale et la position d'entrée de pipette (étoile rouge) eest de 350 um à partir de la singularité moulinet. (C) La position de la table XY est ajustée de telle sorte que la position d'entrée de pipette est centrée sous l'objectif 20x ou 40x (3.3 à 3.5 mm WD). (D) L'objectif est déclenché ~ 2 mm. (E) La pipette est amené au-dessus de la craniotomie et son extrémité est placée directement au-dessus de la position d'entrée de la surface corticale en utilisant vert épi-lumière fluorescente. (F) La pipette et l'objectif sont abaissés simultanément à l'aide éclairage sur fond clair jusqu'à ce que les vaisseaux sanguins de surface corticales entrer en discussion. (G) L'objectif et ACSF sont enlevés et une baisse de 3% d'agarose est appliquée sur la craniotomie. (H) à deux photons visualisation avec un 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) L'objectif est utilisée pour suivre la pipette à la profondeur choisie corticale et injecter le colorant. Après avoir vérifié que les neurones sont correctement marqué avec un colorant fluorescent, en général, un objectif 20x NA supérieur (1,0 NA, 2,0 mm WD) est utilisé pour recueillir deux photons t - z et de la série de données. Schématique s montré en A, CH ne sont pas tracées à l'échelle.

Figure 4. Correspondance de préférence d'orientation en deux photons et intrinsèque des cartes d'imagerie de signaux fonctionnels. (A) à deux photons zone imagée montrant les corps cellulaires marqués avec OGB-1 AM dans le cortex visuel couche 2/3. (B) de préférence d'orientation des corps cellulaires neuronaux individuels sur le même site indiqué en (A). Autour de la singularité moulinet qui a été centré dans la région imagée est une carte d'orientation organisée stimulus préféré. (C) La carte d'orientation obtenue avec l'imagerie signal intrinsèque. Le carré noir correspond à la région indiquée en (B). Ces données ont été obtenues à partir de la même expérience le montrent les figures 2A-C et 3B. La barre d'échelle en (AB) 100 um et (C) 500 um.

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Figure 5. En morphologie in vivo d'un seul neurone à une singularité moulinet orientation. (A) Les dendrites et le corps cellulaire d'un neurone unique superposée à la carte d'orientation sur le même site corticale visuelle. Le neurone est une électroporation avec Alexa Fluor 594 sous deux photons d'orientation, un z-pile ont été collectées in vivo, et des processus dendritiques ont été retracés hors ligne en utilisant le logiciel Neurolucida. La carte d'orientation a été obtenue en utilisant l'imagerie signal intrinsèque avant unicellulaire électroporation. (B) Intensité moyenne de 10 um-z-projection de la couche corticale 1 montre dendrites apicales. (CD) Intensité moyenne de 10 um-z projections de couche corticale dendrites montrent 3.2 basales et des axones. Les flèches rouges indiquent épines le long des dendrites et des flèches blanches pointent vers axones individuels. Barres d'échelle en (AD) 100 um.

Discussion

Nous présentons une méthode pour cibler l'étiquetage des corps cellulaires neuronaux (ou dendrites et axones) dans prédéterminées fonctionnels micro-domaines du néocortex. Fusion d'imagerie optique intrinsèque du signal avec la microscopie à deux photons offre la possibilité de déterminer lequel des synapses et des cellules de contribuer au domaine des micro-carte selon l'une quelconque fonctionnel, que ce soit les corrélats neuronaux de sélectivité avec l'emplacement du neurone dans un plan fonctionnel, et le circuit neuronal composants que le changement de l'expérience visuelle ⁷ ou la demande de médicaments thérapeutiques cliniquement ^18.

Pas de cartes d'orientation de relance, la direction, la dominance oculaire, ou la disparité binoculaire ont été signalés dans le cortex visuel des adultes de type sauvage rongeurs ^6,19-21. Cependant, la facilité de chargement des neurones avec des colorants fluorescents et d'atteindre la stabilité d'imagerie, de concert avec les puissants outils génétiques disponibles chez la souris a conduit à la grande majorité des étudesutilisant l'imagerie à deux photons du cortex cérébral chez les rongeurs en cours d'exécution au lieu de furets, chats et singes.

Imagerie à haute résolution à deux photons des neurones non-rongeurs mammifères peut être très difficile en raison des délais longs, plus épais chirurgie osseuse et la durée, et des mesures supplémentaires nécessaires pour maintenir respiratoires et cardiovasculaires induites par les pulsations du cerveau à un minimum de ^15. Transitions de la chirurgie à l'imagerie signal intrinsèque et intrinsèque à deux photons d'imagerie doivent être efficaces, nécessitant une préparation en temps opportun des réactifs, des colorants et de l'exécution des micro-chirurgicales. Utilisation du microscope à deux photons pour l'imagerie signal intrinsèque évite la nécessité d'une grande partie de l'équipement utilisé pour plates-formes conventionnelles de signaux intrinsèques d'imagerie optique ²² et réduit le temps nécessaire pour configurer l'imagerie intrinsèque et la transition vers la suite à deux photons d'imagerie.

Notre approche est spécifiquement conçu pour fournir de haute résolution à deux phoimagerie tonne en prédéterminés domaines fonctionnels. Cela donne un minimum la diaphonie des signaux fonctionnels entre les corps cellulaires neuronaux et épines dendritiques et des axones individuels peuvent être résolus in vivo. En utilisant une grande ouverture numérique (NA = 1,0) objective et remplir l'ouverture arrière de l'objectif avec une optique d'expansion du faisceau (voir Fig supplémentaire. 20 en Shen et al., 2012 ¹⁵⁾ sont cruciales pour l'imagerie haute résolution. En fonction de la vitesse de l'imagerie en XY et / ou Z, pulsations respiratoires et cardiovasculaires peuvent réduire la résolution d'imagerie efficace peu importe la qualité de l'AN et le chemin optique de lumière sont. En limitant la taille craniotomie chez les non-rongeurs à 2 x 2 mm, en utilisant la concentration relativement élevée d'agarose avec une lamelle, et en effectuant une suspension pneumothorax et lombaire lorsque nécessaires ¹⁵ pulsations du cerveau, sont limitées à 1-2 um. Minimiser respiratoires et cardiovasculaires induites par pulsations du néocortex à 1-2 um pendant vracchargement des indicateurs de calcium assure également que le cortex forme un joint étanche autour de la pipette insérée et qu'aucun colorant pistes vers le haut le long de la tige de la pipette à la surface corticale. Sélection d'injection de colorant et de l'imagerie de sites loin des grandes artérioles est également essentiel pour l'imagerie de haute qualité fonctionnelle, car relativement rapide sensori-évoqués hyperémie (hémodynamique) objets seront exclus ^15.

Sur le site de craniotomie, laissant la couche finale de durée intact tout au long de la formation d'image et du signal intrinsèque de colorants fluorescents phases de préparation - donc de la retirer juste avant l'insertion de la pipette dans le cortex de charge de colorant - augmente le taux de succès et la qualité de l'étiquetage des neurones dans ce qui suit façons: (1) maintient la surface corticale propre et / ou empêche la repousse des tissus dural afin que la pointe de la pipette est moins susceptible de se boucher et la transparence de la conservation du tissu, (2) évite l'agarose utilisé pour les retouches d'imagerie intrinsèque de l' cortnavires de surface du sang giques qui peuvent être endommagés lors de l'agarose, on élimine (3) empêche la agarose utilisé lors de l'imagerie intrinsèque de pénétrer entre la dure-mère et le cortex sous le crâne sur les bords de la craniotomie. Agarose dans ces régions va augmenter la distance entre la lamelle et la surface corticale qui permet l'insertion de la pipette plus difficile, entraîne une compression du tissu cortical et réduit la transparence pour l'imagerie.

Lors de la préparation de l'AM colorants fluorescents pour le chargement en vrac, le Pluronic 20% / DMSO mélange ne doit jamais être utilisé au-delà de 1 semaine à partir de sa préparation initiale - Pluronic ancien / DMSO éteint la fluorescence. Pour le chargement en vrac optimale de plusieurs corps cellulaires adjacents avec un indicateur fonctionnel, par exemple, OGB-1 AM, le mélange de colorants est stocké sur de la glace, chargé dans la pipette en fonction des besoins, mais toujours injecté dans le cerveau dans les 2 heures de sa préparation.

Pendant la phase de chargement en vrac del'expérience, répétée des impulsions de 1 sec de pression au lieu d'une injection en continu de 1 min itératif permet de calibrage des paramètres d'éjection, ce qui garantit que la teinture en excès ou la pression n'est pas appliquée. En raison de la lésion tissulaire potentielle des insertions de pipettes multiples nécessaires pour qualifier de très grandes régions de tissu et la toxicité potentielle de grands volumes de Pluronic / DMSO d'une telle série d'injections de nombreux, nous préférer un site de 300-600 um injection de colorant par 2 x 2 craniotomie mm. Aveugle par rapport à injection ^14, à deux photons navigation visuellement guidé autour des vaisseaux sanguins, l'utilisation de contraste négatif de corps cellulaires neuronaux pour déterminer la position lamelle, et vérification de la propagation de la pression lors de l'éjection de colorant sous forme d'indice du volume des cellules qui seront étiquetés avec OGB-1 AM, améliore la qualité du chargement du colorant dans les préparations de non-rongeur.

Le protocole que nous décrivons ici conduit à l'étiquetage réussie de neurones avec des colorants fluorescents dans le goudronciblées micro-domaines dans chaque animal tenté. Pour le chargement en vrac avec OGB-1 AM, nous avons toujours obtenir des réponses visuellement évoqués dans 75-100% des neurones simultanément imagés ^9,15 et la technique est sensible à la détection des potentiels d'action unique in vivo ^23,24.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Life support/experiment prep
Isoflurane	Webster Vet	NDC 57319-474-05
Isoflurane vaporizer	Midmark	VIP 3000
Feedback regulated heating blanket	Harvard Apparatus	50-7079F
ECG monitor	Digicare Biomedical	LifeWindow Lite
EEG amplifier	A-M Systems	1800
EEG display monitor	Hewlett Packard	78304A
End tidal CO2 monitor	Respironics	Novametrix Capnoguard 1265	Optimize ventilation
Carbide drill burrs for drilling bone	Henry Schein	fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip)
Cement for headplate/chamber	Dentsply	675571, 675572
Black Powder Tempera Paint	Sargent Art Inc.	22-7185	Add to cement to improve light shielding and reduce reflections
Agarose - Type III-A	Sigma	A9793	For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging
Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness	World Precision Instruments	502040, 502041	For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed
Brudon curettes	George Tiemann	105-715-0, 105-715-3	Cleaning skull surface
Bone wax	Ethicon	W31G	Quickly stop bleeding
Cotton Tipped Applicator	Electron Microscopy Sciences	72308-05	Clean and dry bone surface
Dumont #5CO Forceps	Fine Science Tools	11295-20	Grab individual layers of dura or pia
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03	Cut dura
Gelfoam	Pfizer	09-0396-05	To stop bleeding on the dura
Absorption spears	Fine Science Tools	18105-01	Ultra-fast and lint-free wicking of CSF
Blackout material	Thorlabs	BK5	Shield craniotomy
2. Dye preparation / injection
Dimethyl Sulphoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Pluronic	Sigma	P2443
Oregon Green 488 Bapta-1 AM	Invitrogen	O6807	Calcium indicator
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A10438
Centrifugal filter (0.45 μm pore size)	Millipore	UFC30HV00	To remove impurities before injection
Glass pipette puller	Sutter Instruments	P97
Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter)	World Precision Instruments	1B150F-4	Dye ejection pipette
Microloader	Eppendorf	5242 956 003	For loading dye into pipette
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285	To position pipette
Pressure pulse controller	Parker Hannifin	PicoSpritzer III	For pressure injection of the dye
Single-cell electroporator	Molecular Devices	Axoporator 800A	For electroporation of the dye
3. Intrinsic imaging
4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD)	Olympus	UPLFLN4X
Intrinsic hardware / software	Optical Imaging Inc.	Imager 3001 / VDAQ	VDAQ software is used for episodic imaging
CCD Camera	Adimec	Adimec-1000
Light source power supply	KEPCO	ATE 15-15M
Light source	Optical Imaging Inc.	HAL 100	Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW
Green filter (for vascular image)	Optical Imaging Inc.	λ = 546 nm (bandpass 30 nm)	For reference image of surface vasculature
Red filter (for intrinsic signal)	Optical Imaging Inc.	λ = 630 nm (bandpass 30 nm)	To collect intrinsic signals
Heat filter	Optical Imaging Inc.	KG-1
4. Two-photon rig/imaging
Two-photon microscope and software	Prairie Technologies		See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai XF
20x (0.5 NA; 3.5 mm WD)	Olympus	UMPLFLN20X	0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging)
20x (1.0 NA; 2.0 mm WD)	Olympus	XLUMPLFLN20X
40x (0.8 NA; 3.3 mm WD)	Olympus	LUMPLFLN40X/IR
Air table	Newport	ST-200	Isolates preparation from external vibrations
xy stage	Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA)		Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage
Recipes Artificial Cerebro-Spinal Fluid NaCl (135 mM), KCl (5.4 mM), MgCl2 (1.0 mM), CaCl2 (1.8 mM), HEPES (5 mM), pH 7.4 Pipette Solution14 NaCl (150 mM), KCl (2.5 mM), HEPES (10 mM), pH 7.4