Summary
Es wird ein Verfahren zur Markierung von Neuronen mit Fluoreszenzfarbstoffen in vorbestimmten funktionellen Mikrodomänen des Neokortex beschrieben. Zuerst wird intrinsische Signal Abbildungsoptik verwendet werden, um eine funktionelle Karte zu erhalten. Dann Zweiphotonenmikroskopie wird Etiketts und Bild Neuronen innerhalb eines Mikro-Domäne von der Karte verwendet.
Abstract
In der primären Sehrinde des Nicht-Nagetier Säugetieren, sind Neurone nach ihrer Präferenz für Stimulus-Features wie Ausrichtung 1-4, Richtung 5-7, okuläre Dominanz 8,9 und binokulare Disparität 9 gruppierten. Orientierungsselektivität ist das am besten untersuchte und eine kontinuierliche Funktion der Karte mit einem quasi-periodischen Layout für bevorzugte Orientierung vorhanden ist über den gesamten primären Sehrinde 10,11. Die Integration der synaptischen, Mobilfunk-und Netzwerk-Beiträge, die Stimulus-selektive Reaktionen in diesen funktionellen Karten führen erfordert die Hybridisierung von bildgebenden Verfahren, die sub-micron überspannen bis Millimeter räumlichen Skalen. Bei herkömmlichen intrinsische Signal optische Bildgebung kann die gesamte Anordnung der Funktionskarten über die gesamte Oberfläche des visuellen Kortex 12 bestimmt werden. Die Entwicklung der in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie mit Calcium-sensitiven Farbstoffen ermöglicht es, die SYNAPT bestimmenIC-Eingang ankommen einzelnen dendritischen Dornen 13 oder Rekord-Aktivität gleichzeitig aus Hunderten von einzelnen neuronalen Zellkörper 6,14. Folglich Kombinieren intrinsische Signal Bilderzeugung mit der Sub-Mikrometer Ortsauflösung Zweiphotonenmikroskopie bietet die Möglichkeit, genau festzustellen, welcher dendritischen Zellen Segmente und an das Mikro-Domäne von irgendeinem der funktionellen Karte in der Großhirnrinde beitragen. Hier zeigen wir, eine hohe Ausbeute-Verfahren zum schnellen Gewinnung eines kortikalen Orientierungskarte und die eine spezifische Mikro-Domäne in diesem funktionellen Karte zur Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen Neuronen in einem nicht-Nagetier-Säuger. Mit dem gleichen Mikroskop für Zwei-Photonen-Bildgebung verwendet, wir erzeugen zunächst eine Orientierung Karte mit intrinsische Signal optische Bildgebung. Dann werden wir zeigen, wie man ein Mikro-Domain von Interesse mit einer Mikropipette mit Farbstoff entweder Label geladen gezielt eine Population von neuronalen Zellkörper oder Etikett eines einzelnen Neurons, dass Dendriten, Stacheln und Axone sichtbar sindvivo. Unsere Verbesserungen gegenüber bisherigen Methoden ermöglichen eine Untersuchung der neuronalen Struktur-Funktions-Beziehungen mit sub-zellulärer Auflösung im Rahmen des Neokortex funktionalen Architekturen.
Protocol
Ein. Chirurgische Vorbereitung
- Induzieren Anästhesie und kontinuierlich überwachen Herzfrequenz, endexspiratorischen CO 2, EEG und Temperatur. Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der Medical University of South Carolina genehmigt und wurden auf die wir zuvor veröffentlichten 9,15 basiert.
- Setzen Sie den dorsalen Oberfläche des Schädels, indem die Haut mit einem Skalpell. Sezieren die Bindegewebe über dem Knochen mit einer Brudon Kürette. Reinigen Sie die Knochen mit Wattestäbchen Applikatoren und Baumwollgaze. Bewerben Knochenwachs (bei Bedarf) auf den Schädel, gelegentlich Blutungen durch kleine Emissarien stoppen.
- Bringen Sie einen Titan oder Edelstahl Kopfplatte auf den Schädel (über die Region von Interesse, wo die Kraniotomie durchgeführt werden), indem Zahnzement mit schwarzer Farbe (siehe Materialien) gemischt. Eine rechteckige Öffnung in der Mitte der Kopfplatte bietet Zugang für den Kraniotomie und optische Bildgebung. Bringen Sie ein Metall-Kammer auf der Oberseite des Kopfes Platte. Diese Kammer wird als Fluidreservoir zur Bildgebung dienen mit dem Wasser Immersionsobjektivlinse.
- Sichern Sie die Kopfplatte mit einem xy mit Metall-Beiträge.
- Auszudünnen einen großen Bereich des Knochens innerhalb der rechteckigen Öffnung der Kopfplatte durch Verwendung eines Dentalbohrers. Der zu verdünnen muß gut über die Grenzen des geplanten Kraniotomie erstrecken. Die dicke Schädel des nicht-Nagetier-Säuger muss ausgedünnt, wenn Bilder mit hoher Auflösung aus der Großhirnrinde erworben werden, weil am Ort Kraniotomie, die Dicke des Knochens wird die Dicke der Agarose zwischen dem Deckglas und neokortikalen Oberfläche diktiert werden (siehe unten) .
- Bohren eines 2 x 2 mm quadratischen Umriss im Knochen für die Kraniotomie. Spülen Sie die Kammer regelmäßig mit frischen künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) an Knochen Scherben zu entfernen und zu minimieren Wärmeabgabe an den zugrunde liegenden Kortex. Bewerben Knochenwachs nach Bedarf auf gelegentliche Blutung zu stoppen.
- Lift der Knochen Klappe mit einem # 3 Pinzette.
- Entfernen Sie alle, aber die untere Schicht der Dura mit einer feinen Pinzette (# 5CO) und Vannas Frühjahr Schere. Die Dura in Nicht-Nagetier Säugetieren ist dick und undurchsichtig, kann aber in verschiedenen Schichten entfernt werden. Blutung ist selten, kann aber mit Gelfoam gestoppt werden und kein Blut Rückstände sollten vorsichtig aus dem verbleibenden Schicht der Dura mit einer Pinzette und Spülen mit ACSF entfernt werden. Die letzte Schicht der Dura ist transparent und Pia Schiffe sollten deutlich sichtbar sein durch. Verlassen dieses letzte Schicht der Dura intakt während intrinsische Signal Bildgebung die Erfolgsrate der Bulkbeladung fluoreszierender Kalzium-Indikatoren für die anschließende Zwei-Photonen-Imaging-Phase des Experiments zu erhöhen (siehe Diskussion).
- Geben Sie einen Tropfen warmen 2% Agarose (gelöst in ACSF) und sofort einen Deckglas über die Kraniotomie. Prüfen der Kraniotomie um sicherzustellen, dass respiratorischen und Herz-Kreislauf Pulsationen minimal sind durch Verwendung eines chirurgischen Präpariermikroskop oder die Okulare des zweiteiligenPhotonen-Mikroskop im Hellfeld-Modus.
2. Intrinsic Signal Optical Imaging
- Hinzufügen Gel-Schaum mit ACSF um die Außenseite des Abdeckglases, um die Agarose von Trocknung während intrinsische Signal Bildgebung verhindern eingeweicht.
- Bringen Sie die intrinsische Signal Imaging CCD Kamera mit dem Standard-C-Mount-Anschluss auf der Oberseite des Zwei-Photonen-Mikroskop (Abbildung 1). Legen Sie die Beleuchtungslichtquelle in der Luft Tisch in der Nähe der xy-Ebene (Abbildung 1A). Position und sichern Sie die Lichtleiter über die Kraniotomie und Kopfplatte / Kammer (Abbildung 1B). Einfahren des primären dichroitischen Spiegel und die unterhalb der C-Mount-Port, so dass das reflektierte rote Licht für intrinsische Signale benötigt wird direkt von der Kraniotomie zur CCD-Kamera (1C-D). Mit dem 4x Luftobjektiv (0,13 NA, 17 mm WD), einem 2 x 2 mm Sichtfeld ist für intrinsische Signal Bildgebung zur Verfügung.
- Legen Sie eine Wärme-Filter in der light Pfad, um den Kortex von Erwärmung zu verhindern. Verwenden eines Filters, der grünes Licht (546 nm Mittelpunkt λ) und Aufzeichnen eines digitalen Referenzbildes der kortikalen Oberfläche Blutgefäße hindurchgeht.
- Bewegen Sie den z Fokus auf 500 um unterhalb der kortikalen Oberfläche. Verwenden Sie einen roten Filter (630 nm Zentrum λ), um den Cortex zur Messung intrinsische Signale zu beleuchten. Positionieren Sie die Lichtleiter, so dass die kortikale Oberfläche gleichmäßig ausgeleuchtet wird. Abschirmen Kraniotomie aus dem Licht von dem visuellen Stimulus-Display hergestellt. Präsentieren Sie eine Abfolge von visuellen Reizen und aufzeichnen Reflexionsdaten Bildern. Um eine Ausrichtung der Karte innerhalb von 10 min zu erzeugen, Daten erfassen, welche 4 Wiederholungen einer Sequenz von 8 Stimuli (4 Orientierungen und zwei Richtungen für jede Richtung).
- Analysieren Sie die intrinsische Signal Daten an eine falsche Farbe Orientierungsplan generieren. Wählen potenziellen Zielregionen für Zwei-Photonen-Kennzeichnung von Neuronen, zB Orientierung pinwheel Singularitäten - Punkte in der Karte, woAlle bevorzugten Orientierungen konvergieren (Abbildung 2A). Überlagern die Ausrichtung der Karte und das Bild der kortikalen Oberfläche Gefäßsystem (2B-C). Verwenden das Layout der funktionalen Domänen und die Lage der großen Oberfläche Gefäße, um ein Ziel auszuwählen, die Vermeidung Bereichen mit großen Blutgefäßen und Arteriolen 15.
3. Bulk Loading fluoreszierender Kalzium-Indikatoren
- Vorbereiten einer Lösung aus 20% Pluronic / DMSO nach Zugabe von 1 g Pluronic in 5 ul DMSO. Das Gemisch wird bei 60 ° C für 10 min bis zum vollständigen Lösen des Pluronic. Man läßt das Gemisch auf Raumtemperatur abkühlen. Add 4 ul des Pluronic / DMSO-Gemisch zu einer 50 ug Fläschchen der fluoreszierende Kalzium-Indikator Oregon Green 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). Dann fügen Sie 1 ul einer roten Farbstoff (Alexa Fluor 594, 2 mM Stammlösung) und 35 ul der Pipette Lösung (siehe Materialien) für eine Endkonzentration von 1 mM OGB-01.00. Beschallen die Lösung für ½ Stunde inein gekühltes Wasserbad und dann Zentrifuge mit einer 0,45 um-Filter, um Verunreinigungen zu entfernen.
- Ziehen Sie einen Langkegel Pipette mit einem äußeren Durchmesser der Spitze von 2,0-2,5 um. Beladung 5 ul der Farbstoffmischung in die Pipette.
- Entfernen Sie die letzte Schicht, um Dura Pipette Einführen zu erleichtern und zu erhalten, die höchste Qualität Zwei-Photonen-Bildern.
- Bestimmung der exakten Position auf der kortikalen Oberfläche daß die Pipette platziert werden muss, um sein Ziel in kortikalen Schicht 2/3 zu erreichen. Unsere vorgegebenen kortikalen Ziel ist ein Windrad Singularität in der Ausrichtung Karte (Abbildung 2). Die Pipette ist in die Rinde in einem 30 °-Winkel angetrieben werden, um zwischen der Kammerwand und dem Ziel passieren. Somit, um die Zielregion 200 um unterhalb der kortikalen Oberfläche bezeichnen, wird die Pipette Eingabeposition auf der kortikalen Oberfläche ungefähr 350 um quer zur Soll-Position (3 AB) sein.
- Bewegen des XY-Tischs (an dem das Tier und die pipette Mikromanipulator platziert sind) für die Zentrierung der kortikalen Oberfläche Eintrittsposition unter dem Objektiv (3C). Verwenden Sie ein 20x oder 40x-Objektiv mit einem Arbeitsabstand (WD) von mindestens 3 mm (siehe Materialien), um sicherzustellen, dass die Pipette wird leicht in die Hirnrinde, ohne das Ziel oder den Knochen an der Wand entlang der Kraniotomie. Sobald der Eintrag Position unter dem Ziel zentriert ist, erhöhen die Z-Position des Ziels um 2 mm (Figur 3D). Mit der grüne Auflicht-Fluoreszenz Licht eingeschaltet, um den roten Farbstoff Alexa in der Pipette zu visualisieren, benutzt das diagonale Achse der Mikromanipulator, um die Pipette zu bewegen, bis ihre Spitze zentriert ist (und fokussiert) unter dem Objektiv unmittelbar oberhalb der kortikalen Oberfläche Eingabeposition ( Abbildung 3E).
- Pipette senkrecht abzusenken (entlang der z-Achse), bis die Pipette erreicht den kortikalen Oberfläche (3F), die sich während kontinuierlich die Pipettenspitze durch die okulars des Mikroskops. Verwendung Hellfeldbeleuchtung sind die kortikalen Oberfläche Blutgefäße und verbleibende Meningen (pia und Arachnoidea) leicht sichtbar wie die Pipette den kortikalen Oberfläche nähert. Wenn die Pipette nicht erreicht den gewünschten Eintrag Position, heben Sie die Pipette und kalibrieren Targeting basierend auf den vaskulären Wahrzeichen an der kortikalen Oberfläche.
- Entfernen Sie das Ziel, Wick überschüssige Liquor aus dem Kraniotomie und trocknen Sie die angrenzenden Knochen mit fusselfreien Absorption Speeren. Geben Sie einen Tropfen warm 3% igen (gelöst in ACSF), um den Kortex, sichtbar durch die Kraniotomie (3G) ist zu stabilisieren. In Nicht-Nagern, 3% Agarose notwendig Pulsationen für eine erfolgreiche Aufnahme von fluoreszierenden Farbstoffen durch Neuronen zu dämpfen. Für intrinsische Signal Abbildungsoptik nur 2% Agarose ist erforderlich, da die Kombination von 2% Agarose und dem Deckglas für die nötige Stabilität. Hier wird kein Deckglas des Farbstoff-Ladeschritt so 3% Agarose verwendet wirdnotwendig. Nach Erstarren der Agarose, legen Sie eine 40x-Objektiv (0,8 NA, 3,3 mm WD) und neu füllen den Raum mit ACSF.
- Wechseln Sie von Hellfeld-, zwei-Photonen-Leser und suchen Sie die Pipettenspitze. Verwendung der diagonalen Achse des Mikromanipulators, die Pipette zu bewegen, bis ihre Spitze erreicht die gewünschte Tiefe in der Rinde (Abbildung 3H). Gelegentliche Druck Auswerfen puffs der Farbstoffmischung (ein paar psi, wobei jeder Impuls 0,1 sec) verhindern helfen Pipettenspitze verstopfen. Da Uhr OGB-1 nur sichtbar beim Betreten Zellen, ist der rote Farbstoff Alexa entscheidend für die Visualisierung der Pipettenspitze in der Hirnrinde.
- Vor dem Versuch, Neuronen in kortikalen Schicht 2/3 mit der vollen Dosis von Farbstoff zu laden, erneute Fokussierung des Ziels auf der kortikalen Oberfläche, um die Tiefe der Pipettenspitze zu bestätigen und sicherzustellen, dass die Spitze an der Zielposition ist, basierend auf dem Layout Oberfläche der Blutgefäße. Wenn die Pipette in Layer 2/3, sollten kleine puffs der Farbstoffmischung leuchten dieextrazellulären Raum und zeigen eine dichte Montage von runden Zellkörper als dunkle Schatten.
- Zum Laden neuronale Zellkörper in einer Sphäre des Cortex 300-600 Mikrometer Durchmesser, injizieren die Farbstoffmischung in den extrazellulären Raum mit 30-90 Pulsen, wobei jeder Impuls 1,0 sec, 2-10 psi. Die Impulse der Druck sollte nicht so stark sein, dass das Gewebe bewegt. Nach der Injektion abgeschlossen ist, warten Sie ein paar Minuten, dann entfernen Sie die Pipette und objektiv. Warten Sie 1 Stunde, damit der OGB-01.00 vollständig aufgewickelt werden von Neuronen.
- Entfernen Sie die Agarose für den Farbstoff Be-und spülen Sie die Aufnahme Kammer. Setzen Sie einen kleinen Tropfen von 2-3% Agarose auf der Oberfläche und schnell platzieren ein Deckglas über die Kraniotomie. Da die Fluoreszenzfarbstoffe lichtempfindlich sind, vermeiden Überbelichtung des Kortex Hellfeld-oder epi-fluoreszierendes Licht. Legen Sie eine hohe NA (1,0) 20x-Objektiv in das Objektiv Halter und re-Zentrum der markierten kortikalen Bereich unter dem Objektiv mit der xy. Schirmen die Kraniotomie aus Extraneous Lichtquellen, zB visuellen Stimulus Display, unter Verwendung mehrerer Schichten aus Blackout Material.
4. Single-cell Elektroporation von Fluoreszenzfarbstoffen
- Für die Untersuchung dendritische Morphologie, bereiten eine Lösung von 100 uM Alexa Fluor 594 (1:20 Verdünnung in ACSF von 2 mM Alexa Fluor 594 Aktien). Für die funktionelle Bildgebung von Dendriten eine OGB Salz kann 16,17 verwendet werden.
- Ziehen Sie einen Langkegel Pipette mit einer Spitze Größe von 1 um und laden Sie 5 ul Farbstoff in die Pipette. Alle weiteren Schritte des Targeting eine funktionelle Domäne sind identisch mit dem Bulkbeladung Methode (Figuren 1-3). Um die Pipettenspitze benachbart zu einem neuronalen Zellkörper Membran positionieren, überwachen die Erhöhung Elektrodenimpedanz und Druck Sprühstöße von Farbstoff auf den extrazellulären Raum zu beleuchten und sehen Zellkörper als Schatten während Zwei-Photonen-Bildgebung.
- Wenn die Pipettenspitze neben einem neuronalen Zellkörper Membran ist, verwenden Sie die Axoporator 800A anzuwenden1-3 Impulsen (-8 bis -10 V, 10 ms Puls). Die sofortige Füllung des Neurons mit Farbstoff ist leicht sichtbar mit zwei-Photonen-Mikroskopie. Nehmen Sie die Pipette und sammeln hochauflösende Bilder von Dendriten und Axone in vivo.
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Representative Results
Um die Genauigkeit der Farbstoff Markierungsverfahren veranschaulichen, gezielte wir den kleinsten Mikro-Domäne von irgendeinem bekannten funktionellen Karte im nicht-Nagetier Neocortex. Dünn ganzen Orientierungsplan in der primären Sehrinde unterbrochen sind Singularitäten. Diese treten an Stellen, wo alle bevorzugten Orientierungen konvergieren, so dass in Falschfarben Karten der bevorzugten Orientierung, die Regionen um die Singularität aussehen "Windräder" (2A-B). Ein Windrad pro Kraniotomie ist für Farbstoff Kennzeichnung (grüner Kreis in Abbildung 2C) gewählt, dass auf jeden Fall große Schiffe und Arteriolen insbesondere 15 zu vermeiden. Mit Bulk-Beladung von OGB-1 AM, offenbart Verfolgen von Änderungen in neuronalen Calcium-Indikator Fluoreszenz auf eine Folge von visuellen Stimuli orientierten Gitters einzellige Auflösung Funktionskarten rund pinwheel Singularitäten (Abbildung 4). Mit Single-Cell Elektroporation, die räumliche Organisation von Dendriten und Axone aus, wieingle Neurons in einem Windrad Singularität liegt in vivo (Abbildung 5) bestimmt.
Abbildung 1. Intrinsische Signal Abbildungsoptik Setup. (A) wird das Tier auf der xy-Ebene und intrinsischen Signal Bildgebung positioniert ist über eine CCD-Kamera auf der Zwei-Photonen-Mikroskop montiert durchgeführt. Die Lichtquelle und Computer verwendet, um die Imaging-Session Control werden über das Setup für intrinsische Bildgebung gebracht und entfernte sich vor dem Zwei-Photonen-Imaging-Phase des Experiments beginnt. (B) Nahaufnahme des 4x Objektiv und 630 nm Beleuchtung durch flüssigkeitsgefüllte Lichtleiter. Entweder zwei Lichtleitern zu Metallpfosten (links) angebracht ist, oder eine einzige Beleuchtungseinrichtung Ring gebunden direkt dem Objektiv (rechts) können verwendet werden. Blackout verwendete Material schirmen das Ziel aus anderen Quellen der Beleuchtung, wird zB visuellen Stimulus-Display, während Abbildungsoptik Sessions, nicht gezeigt. (C) Schematische Darstellung des Mikroskops und Lichtweg im herkömmlichen Zwei-Photonen-Imaging-Konfiguration. Siehe Ergänzende Abb. 20 in Shen et al. 2012 15 für eine Beschreibung der gesamten Zwei-Photonen Lichtweg. Der versenkbare Spiegel positioniert ist, um das Licht von dem Laser durch den dichroitischen und auf den Kortex abzulenken. Der primäre dichroitische, die den Laserstrahl reflektiert und durchläuft das emittierte Licht aus dem Kortex der PMT, wird in den Lichtweg durch Drehen des Filters Revolverkopf bewegt. (D) Für intrinsische Bildgebung der Spiegel ist eingefahren und das Filterrevolver gedreht wird, um den primären dichroitischen bewegen aus dem Weg, was einen direkten Lichtweg aus der Rinde der CCD-Kamera. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 2. Verwendung Funktionskarten mit intrinsischen Signal erhalten, um eine Bildgebung Mikrobereich-Neuronen für die Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen ausgewählt. (A) Orientierungsplan von Katze primären Sehrinde erworbenen über das intrinsische Signal optische Bildgebung. Die Farbe jedes Pixel ist das bevorzugte Orientierung an dieser Stelle. Mögliche Orientierung pinwheel Singularitäten für die Etikettierung Neuronen mit fluoreszierenden Farbstoffen innerhalb schwarze Kreise dargestellt. (B) Die Karte kortikalen Oberfläche Blutgefäße überlagert mit der Orientierung der Karte. (C) Pinwheels innerhalb der roten Kreise sind in der Nähe großer Blutgefäße oder Arteriolen und so das Windrad Ort innerhalb des grünen Kreises wird als Ziel für die Farbstoff Kennzeichnung gewählt. Das gestrichelte Rechteck entspricht dem Bereich in 3B gezeigt. Maßstab in (A) 500 μ m.
Abbildung 3. Optimierung der Pipette Platzierung zum Laden Neuronen mit Fluoreszenzfarbstoffen. (A) Schematische Seitenansicht des Aufzeichnungs Kammer zeigt, dass der Farbstoff Ladestelle in Sehrinde (rot-weiß Bullauge) gezielt werden soll ~ 200 um unterhalb der kortikalen Oberfläche. Die xy-Koordinate des Soll-entspricht dem Ort einer Orientierung pinwheel Singularität aus intrinsischen Signal Bildgebung bestimmt. Die Pipette wird die Rinde in einem 30 °-Winkel eingeben. Wenn der kortikalen Oberfläche parallel zu der xy-Ebene aufweist, wird die Pipettenspitze seitlich bewegen ungefähr 350 um vor Erreichen der pinwheel Singularität. (B) Ansicht von oben Aufnahme Kammer zeigt die kortikale Oberfläche Gefäßsystem und die Pipette Einstiegsposition (roter Stern) thbei ist 350 um aus dem Windrad Singularität. (C) Die xy Position ist so eingestellt, dass die Pipette Eintrittsposition unter 20x oder 40x Objektiv (3,3-3,5 mm WD) zentriert ist. (D) Das Ziel ist ~ 2 mm angehoben. (E) Die Pipette wird über der Kraniotomie gebracht und mit seiner Spitze die direkt oberhalb der Eingabeposition auf der kortikalen Oberfläche unter Verwendung grüner epi-Fluoreszenzlicht positioniert. (F) Die Pipette und objektiven werden gleichzeitig mit Hellfeldbeleuchtung abgesenkt, bis die kortikale Oberfläche Blutgefäße in den Fokus gerückt. (G) Die objektive und ACSF entfernt werden und ein Tropfen von 3% Agarose wird über der Kraniotomie aufgebracht. (H) Zwei-Photonen-Visualisierung mit einem 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) Ziels wird die Pipette nach unten folgen der gewählten Tiefe und kortikalen spritzen den Farbstoff. Nach der Bestätigung, dass Neurone erfolgreich mit Fluoreszenzfarbstoff, typischerweise eine höhere NA 20x Objektiv (1,0 NA, 2,0 mm WD) markiert wird verwendet, um Zwei-Photonen-t sammeln - und z-Zeitreihendaten. Schematisch s in A gezeigt, sind CH nicht maßstabsgetreu gezeichnet.
Abbildung 4. Korrespondenz Orientierungspräferenz in Zwei-Photonen-und intrinsische Signal Bildgebung funktioneller Karten. (A) Zwei-Photonen abgebildeten Bereich zeigt Zellkörper mit OGB-1 bezeichnet Uhr im visuellen Kortex Layer 2/3. (B) bevorzugt Orientierung einzelner neuronalen Zellkörpern von der gleichen Seite auf (A) gezeigt. Rund um das Windrad Singularität, die in der abgebildeten Region zentriert wurde, ist eine organisierte Karte bevorzugten Reiz Orientierung. (C) Die Ausrichtung Karte mit intrinsische Signal Bildgebung erhalten. Das schwarze Quadrat entspricht dem Bereich, in (B) gezeigt. Diese Daten wurden aus dem gleichen Experiment in den 2A-C und 3B gezeigt ist, erhalten. Maßstab in (AB) 100 um und (C) 500 um.
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Abbildung 5. In vivo Morphologie eines einzelnen Neurons in einer Orientierung pinwheel Singularität. (A) Die Dendriten und Zellkörper eines einzelnen Neurons mit der Ausrichtung Karte aus dem gleichen visuellen kortikalen Website überlagert. Das Neuron mit Alexa Fluor 594 wurde unter Zwei-Photonen-Führung elektroporiert wurde ein z-Stapel in vivo gesammelt und dendritischen Prozesse zurückzuführen offline mit Neurolucida Software. Die Ausrichtung Karte wurde unter Verwendung intrinsische Signal Bildgebung vor Single-Cell Elektroporation. (B) Mittlere Intensität 10-um-z-Projektion von Rindenschicht 1 zeigt apikalen Dendriten. (CD) Mittlere Intensität 10-um-z-Projektionen von kortikalen Schicht 2/3 zeigen basalen Dendriten und Axone. Rote Pfeile zeigen Stacheln entlang Dendriten und weißen Pfeile zeigen auf einzelne Axone. Maßstabsbalken in (AD) 100 um.
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Discussion
Wir präsentieren eine Methode, um die Etikettierung von neuronalen Zellkörper (oder Dendriten und Axone) in vorgegebenen funktionalen Mikrodomänen des Neokortex Ziel. Zusammenführen intrinsische Signal optischen Bildgebung mit Zweiphotonenmikroskopie bietet die Möglichkeit, zu bestimmen, welche Zellen Synapsen und tragen zur Mikro-Domäne von irgendeinem der funktionellen Karte, ob neuronalen Selektivität korreliert mit der Position des Neurons in einem funktionellen Karte, und die neuronale Schaltungskomponenten dass Veränderung mit visuellen Erfahrung 7 oder die Anwendung klinisch therapeutische Arzneimittel 18.
Keine Karten für Stimulus Orientierung, Richtung, okuläre Dominanz oder binokulare Disparität in der Sehrinde von erwachsenen Wildtyp-Nager 6,19-21 berichtet worden. Allerdings hat das einfache Einlegen Neuronen mit Fluoreszenzfarbstoffen und Erreichen Bildgebung Stabilität, zusammen mit den leistungsstarken genetischen Werkzeuge für Mäuse in der überwiegenden Mehrheit der Studien führtenVerwendung von zwei-Photonen-Bildgebung der Hirnrinde in Nagetieren statt Frettchen, Katzen, Affen durchgeführt.
Hochauflösende Zwei-Photonen-Imaging von Neuronen im Nicht-Nagetier Säugetieren kann sehr herausfordernd wegen der langen OP-Zeiten, dickeren Knochen und Dura und zusätzliche Schritte notwendig, um Atmungs-und Herz-Kreislauf-vermittelten Pulsationen des Gehirns auf ein Minimum 15 zu halten. Übergänge von Operation, um intrinsische Signal Bildgebung und untrennbar mit Zwei-Photonen-Imaging müssen effizient, erfordern rechtzeitige Vorbereitung von Reagenzien, Farbstoffen und der Ausführung von Mikro-chirurgische Eingriffe. Mit der Zwei-Photonen-Mikroskop für intrinsische Signal Bildgebung entfällt die Notwendigkeit für einen Großteil der Anlagen in konventionellen intrinsische Signal optische Bildgebung Rigs 22 verwendet und reduziert die erforderliche Zeit zur inneren Bildgebung und Übergang zur abschließenden Zwei-Photonen-Imaging einzurichten.
Unser Ansatz ist speziell für hochauflösende zwei-pho bietenTonne Bildgebung in vorbestimmten funktionellen Domänen. Dies bietet minimales Übersprechen von funktionalen Signale zwischen Nervenzellen Körper und einzelnen dendritischen Dornen und Axone in vivo geklärt werden. Mit einer hohen numerischen Apertur (NA = 1,0) objektive und Füllen der hinteren Apertur des Objektivs mit Strahlaufweitungsoptik (siehe Ergänzende Abb. 20 in Shen et al., 2012 15) sind entscheidend für die hochauflösende Bildgebung. Abhängig von der Geschwindigkeit der Bildgebung in XY und / oder Z können Atemwegs-und Herz-Kreislauf-Pulsationen die effektive Bildauflösung, egal wie gut die NA und optischen Strahlengang zu vermindern. Durch die Begrenzung der Größe in Kraniotomie Nichtnagern bis 2 x 2 mm, unter Verwendung des relativ höheren Konzentration von Agarose mit einem Deckglas, und Durchführen eines Pneumothorax und lumbalen Suspension, wenn erforderlich 15, Gehirn Pulsationen 1-2 um begrenzt sind. Minimierung der Atemwege und Herz-Kreislauf-induzierte Schwingungen des Neocortex auf 1-2 um während bulkBeladen Calciumindikatoren auch sichergestellt, dass die Rinde eine dichte Abdichtung rund um den eingefügten Pipette bildet und dass kein Farbstoff verfolgt bis entlang dem Schaft der Pipette dem kortikalen Oberfläche. Auswahl Farbstoffinjektion und Imaging Websites weg von großen Arterien ist auch entscheidend für hochwertige funktionelle Bildgebung, da relativ schnell sensorisch-evozierte Hyperämie (hämodynamischen) Artefakte 15 ausgeschlossen werden.
Am Kraniotomie Website, so dass die letzte Schicht der Dura intakt in die intrinsische Signal Bildgebung und Fluoreszenzfarbstoff Vorbereitungsphasen - also das Entfernen es kurz vor der Pipette Einsetzen in der Hirnrinde für Farbstoff Belastung - erhöht den Erfolg und die Qualität der neuronalen Kennzeichnung in der folgenden Möglichkeiten: (1) hält die kortikale Oberfläche sauber und / oder verhindert dural Gewebeneuwachstum so dass die Pipettenspitze weniger verstopft ist und die Transparenz des Gewebes aufrechterhalten wird, (2) wird vermieden, dass die Agarose für intrinsische Bildgebung Touch der verwendeten cortical Oberfläche Blutgefäßen, die beschädigt wird, wenn die Agarose kann entfernt zu werden, (3) verhindert, während die Agarose intrinsische Bildgebung Eindringen zwischen der Dura und dem Kortex unterhalb des Schädels an den Rändern der Kraniotomie verwendet. Agarose in diesen Regionen erhöht den Abstand zwischen dem Deckglas und dem kortikalen Oberfläche, die das Einlegen der Pipette erschwert, führt die Kompression des kortikalen Gewebe und verringert die Transparenz für Bildgebung.
Bei der Vorbereitung der AM Fluoreszenzfarbstoffe für Bulk Loading, die 20% Pluronic / DMSO-Gemisch sollte nie über 1 Woche von seiner ursprünglichen Herstellung verwendet werden - alte Pluronic / DMSO die Fluoreszenz. Für eine optimale Bulkbeladung vieler benachbarten Zellkörper mit einer funktionellen Indikator, beispielsweise OGB-1 AM ist die Farbstoffmischung auf Eis gelagert, geladen in die Pipette nach Bedarf aber immer in das Gehirn innerhalb von 2 Stunden nach ihrer Herstellung injiziert.
Während der Bulk-Loading Phasedas Experiment wiederholt, 1 sec Druckimpulse anstatt einer kontinuierlichen Injektion von 1 min ermöglicht iterative Kalibrierung von Ausstoßkanälen Parametern, so dass übermäßiger Druck Farbstoff oder nicht angelegt wird gewährleistet. Wegen der möglichen Gewebeschäden durch Mehrpipetten Insertionen notwendig, sehr große Bereiche des Gewebes und potenzielle Toxizität von großen Volumina von Pluronic / DMSO aus einer solchen Reihe von vielen Spritzen bezeichnen, bevorzugen wir ein 300 bis 600 um Farbstoff Injektionsstelle pro 2 x 2 Kraniotomie mm. Verglichen mit blinden Einspritzungen 14, Zwei-Photonen visuell geführten Navigation um Blutgefäße Verwendung negativer Kontrast von neuronalen Zellkörpern zur Lamina Position zu bestimmen, und Ausmessen der Ausbreitung des Farbstoffs auf Druck Ausstoßen als Index des Volumens der Zellen, wird beschriftet mit OGB-1 AM, verbessert sich die Qualität des Farbstoffes Belastung in Nicht-Nagetier Vorbereitungen.
Das Protokoll beschreiben wir hier führt zu erfolgreichen Kennzeichnung von Neuronen mit fluoreszierenden Farbstoffen in targezielte Mikro-Domänen in jedem Tier versucht. Für Bulkbeladung mit OGB-1 AM, konsequent zu erhalten visuell hervorgerufenen Reaktionen in 75-100% der gleichzeitig abgebildet Neuronen 9,15 und die Technik ist empfindlich für die Detektion von einzelnen Aktionspotentiale in vivo 23,24.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Gnade Dion für das Verfolgen der Dendriten in 5A gezeigt;; Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Eye Institute R01EY017925 und R21EY020985 und Finanzierung von den Dana & Whitehall Foundations PK Wir danken auch Matthew Petrella für die Unterstützung bei chirurgischen Eingriffen unterstützt und Pratik Chhatbar für Anmerkungen zum Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||
| 1. Life support/experiment prep | |||||||||
| Isoflurane | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | |||||||
| Isoflurane vaporizer | Midmark | VIP 3000 | |||||||
| Feedback regulated heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7079F | |||||||
| ECG monitor | Digicare Biomedical | LifeWindow Lite | |||||||
| EEG amplifier | A-M Systems | 1800 | |||||||
| EEG display monitor | Hewlett Packard | 78304A | |||||||
| End tidal CO2 monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Optimize ventilation | ||||||
| Carbide drill burrs for drilling bone | Henry Schein | fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip) | |||||||
| Cement for headplate/chamber | Dentsply | 675571, 675572 | |||||||
| Black Powder Tempera Paint | Sargent Art Inc. | 22-7185 | Add to cement to improve light shielding and reduce reflections | ||||||
| Agarose - Type III-A | Sigma | A9793 | For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging | ||||||
| Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness | World Precision Instruments | 502040, 502041 | For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed | ||||||
| Brudon curettes | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Cleaning skull surface | ||||||
| Bone wax | Ethicon | W31G | Quickly stop bleeding | ||||||
| Cotton Tipped Applicator | Electron Microscopy Sciences | 72308-05 | Clean and dry bone surface | ||||||
| Dumont #5CO Forceps | Fine Science Tools | 11295-20 | Grab individual layers of dura or pia | ||||||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | Cut dura | ||||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | To stop bleeding on the dura | ||||||
| Absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Ultra-fast and lint-free wicking of CSF | ||||||
| Blackout material | Thorlabs | BK5 | Shield craniotomy | ||||||
| 2. Dye preparation / injection | |||||||||
| Dimethyl Sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | |||||||
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | Calcium indicator | ||||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | |||||||
| Centrifugal filter (0.45 μm pore size) | Millipore | UFC30HV00 | To remove impurities before injection | ||||||
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P97 | |||||||
| Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Dye ejection pipette | ||||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | For loading dye into pipette | ||||||
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | To position pipette | ||||||
| Pressure pulse controller | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | For pressure injection of the dye | ||||||
| Single-cell electroporator | Molecular Devices | Axoporator 800A | For electroporation of the dye | ||||||
| 3. Intrinsic imaging | |||||||||
| 4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) | Olympus | UPLFLN4X | |||||||
| Intrinsic hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software is used for episodic imaging | ||||||
| CCD Camera | Adimec | Adimec-1000 | |||||||
| Light source power supply | KEPCO | ATE 15-15M | |||||||
| Light source | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW | ||||||
| Green filter (for vascular image) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (bandpass 30 nm) | For reference image of surface vasculature | ||||||
| Red filter (for intrinsic signal) | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm (bandpass 30 nm) | To collect intrinsic signals | ||||||
| Heat filter | Optical Imaging Inc. | KG-1 | |||||||
| 4. Two-photon rig/imaging | |||||||||
| Two-photon microscope and software | Prairie Technologies | See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power | |||||||
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | |||||||
| 20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) | Olympus | UMPLFLN20X | 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging) | ||||||
| 20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) | Olympus | XLUMPLFLN20X | |||||||
| 40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | |||||||
| Air table | Newport | ST-200 | Isolates preparation from external vibrations | ||||||
| xy stage | Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA) | Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage | |||||||
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References
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