Summary
用荧光染料标记细胞在预定的新皮层的功能性微域的一种方法。首先，本征信号光学成像用来获得一个功能图。双光子显微镜被用于标签和图像的神经元内微域的地图。
Abstract
在非啮齿类哺乳动物初级视觉皮层的神经元聚集根据自己的喜好刺激的功能，如方向1-4，5-7方向，眼优势8,9和双眼视差9。方位选择性是最被广泛研究的功能，并具有准周期的布局为择优取向的连续映射在整个初级视觉皮层10,11是本。整合的突触，手机和网络的贡献，在这些功能的地图，以的刺激选择性的反应，需要杂交成像技术，跨越亚微米到毫米的空间尺度。与传统的内源信号光学成像，整体布局功能地图的整个表面上的视觉皮层可确定12。 在体内双光子显微镜使用钙敏感染料的发展使一个确定SYNAPT到达13或记录个人的树突棘IC输入端的活动，同时从数以百计的单个神经元细胞体6,14。因此，结合特性的信号与亚微米的空间分辨率的双光子显微镜成像提供准确地确定树突状段和细胞有助于在新皮质的任何功能的地图的微域的可能性。在这里，我们展示了一个高收益的方法快速获得皮质的方向图，针对一个特定的微域在这个功能的地图，用荧光染料标记细胞在非啮齿类哺乳动物。用于双光子成像具有相同的显微镜中，我们首先生成一个定向地图使用固有的信号的光学成像。然后，我们如何定位的利益，用微装有染料为标签的微域人口的神经元细胞体或标签的单个神经元的树突棘和轴突中是可见的体内。我们比以前的方法的改进，促进神经元的结构与功能的关系与亚细胞分辨率的新皮层的功能体系结构的框架中的一个考试。
Protocol
1。手术准备
- 诱导麻醉，并持续监测心跳率，结束潮汐CO 2，脑电图，及温度。南卡罗来纳大学医疗机构动物管理和使用委员会批准了所有的程序，是基于我们以前出版9,15。
- 公开的背用手术刀切割皮肤表面的头骨。解剖的结缔组织，覆盖骨使用一个Brudon的刮匙。用棉签涂抹和棉花纱布清洁骨。应用骨蜡（如需要）的头骨，偶尔通过小使者静脉的出血停止。
- 钛或不锈钢头板连接到所述颅骨（超过其中将执行开颅景点的区域）通过用黑色涂料（见材料 ）混合使用牙科用粘固剂。头板的中心的矩形开口中提供访问开颅和光学成像。将一个金属腔的头板。将作为该室的流体容器与水浸泡物镜成像。
- 固定头板使用金属柱的 xy阶段。
- 骨的大面积的薄的磁头板的矩形开口内，通过使用牙钻。被摊薄的区域必须远远超出计划开颅手术的边界。必须减薄高分辨率的图像时，取得的新皮层的，因为在开颅手术，骨的厚度将决定之间的盖玻片厚度的琼脂糖和新皮层表面的非啮齿类哺乳动物的厚头骨（见下文） 。
- 钻一个2×2平方毫米的轮廓骨开颅手术。定期清洗室，用新鲜的人工脑脊液（ACSF）去除骨碎片，减少热能散发到底层的皮质。涂上骨蜡，偶尔出血停止。
- LIFT＃3钳骨瓣。
- 删除所有底层的硬脑膜，用细镊子（＃5CO）和Vannas春风似剪刀。硬膜在非啮齿类哺乳动物是厚的和不透明的，但可以在不同的层中除去。出血是罕见的，但可以停止任何血液残余物，应以明胶海绵和轻轻地从其余层的硬脑膜钳和冲洗学联的。最后一层是透明的硬膜，并通过软脑膜血管清晰可见。离开这最后一层硬脑膜完整的内在信号成像过程中，会提高成功率，为以后的双光子成像阶段的实验荧光钙指标的批量加载（见讨论）。
- 滴一滴温暖的2％琼脂糖（溶解在ACSF），并立即将一个玻璃罩了开颅手术。检查开颅确保呼吸系统和心血管脉动是最小的通过使用外科解剖显微镜或两个目镜光子显微镜明视场模式。
2。内源信号的光学成像
- 添加凝胶泡沫浸泡学联的盖片玻璃的外侧周围，以防止琼脂糖从干燥期间内在信号成像。
- 将成像CCD相机的特性信号的标准C型安装的双光子显微镜（ 图1）的顶部的端口。将照明用光源附近的 xy阶段（ 图1A）上的气动工作台。定位和固定的光导过开颅手术和磁头板/室（ 图1B）。缩回主分色和反射镜下面的C型安装的端口，使得反射的红色光所需要的固有的信号将通过直接从开颅的CCD摄像机（ 图1C-D）。使用4倍的空中目标（0.13 NA，17毫米WD），2×2毫米视野是内在的信号成像。
- 将热过滤器在L的飞行路径，以防止从加热皮质。使用一个过滤器，通过绿光（546纳米中心λ）和记录数字的参考图像的皮质表面血管。
- 将在 z焦点移动到500微米以下的皮质表面。使用红色过滤器（630纳米中心λ）来照亮皮层内在的信号测量。位置使得皮质的表面被均匀地照射的导光体。屏蔽开颅从所产生的视觉刺激的显示的光。目前的视觉刺激和记录反射率数据的图像序列。在10分钟之内要产生一个定向地图，收集对应于4个重复序列8刺激（4方向和每个方向的两个方向）的数据。
- 分析的特性的信号数据，以产生的假彩色定向地图。选择潜在目标区域的神经元的双光子的标签， 例如，方向风车奇异性-在地图上点所有的择优取向收敛（ 图2A）。叠加定向地图和皮质表面血管的图像（ 图2B-C）。使用的布局，功能结构域和大型水面舰艇的位置，选择一个目标位置，避免与大血管和动脉15。
3。批量装载荧光钙指标
- 准备20％的Pluronic / DMSO的溶液通过添加1 g的Pluronic于5μl的DMSO。加热该混合物，在60℃下10分钟，以完全溶解的Pluronic。允许该混合物冷却至室温。 4微升普朗尼克/ DMSO混合添加的荧光钙指示剂俄勒冈绿488 BAPTA-1 AM（OGB-AM）到50微克小瓶。然后加入1微升的红色染料（的Alexa Fluor 594，2mM的原液）和35微升溶液移液管（见材料 ）的最终浓度为1 mM的OGB-1 AM。超声波清洗半小时的解决方案冷藏水浴用0.45μm的过滤器，以除去杂质，然后离心。
- 拉出长锥形吸移管具有外尖端直径为2.0-2.5微米。将5μl的染料混合物进入移液管。
- 卸下的最后一层硬膜，以便吸移管插入和获得最高质量的双光子图像。
- 确定为了达到其目标的皮质层的2/3，移液管必须放置在皮层表面上的确切位置。我们预定的皮质的目标是一个风车取向图（ 图2）中的奇异性。吸移管必须被驱动到皮质，在一个30°的角度，腔室的壁和目标之间传递。因此，标记的目标区域200微米以下的皮质表面，皮质表面上的吸液管进入位置将是约350微米的目标位置（ 图3中A，B）的侧方。
- 移动的 xy阶段（该动物和pipette显微操纵器被放置）的中心的目标（ 图3C）的皮质表面下进入位置。使用20倍或40倍物镜的工作距离（WD）的至少3毫米（见材料 ），以确保吸液管将很容易地输入不接触的目标或骨沿着壁的开颅皮层。一旦条目的位置为中心的目标下，提高目标的Z位置由2毫米（ 图3D）。随着绿色外延荧光灯打开，以可视化的红色那样Alexa染料中的移液管，使用的显微操作的对角线轴，使移液管，直到它的端部的中心（和集中）根据以上皮质表面条目位置目标直接（ 图3E）。
- 降低吸移管的吸移管的垂直方向（ 沿 z轴），直到到达皮质表面（ 图3F），而连续地观看通过移液管尖的OCU拉斯显微镜。用明视场照明，皮质表面血管和剩余脑膜膜（软脑膜和蛛网膜）是很容易看到的吸管接近皮质表面。如果吸移管未达到所需条目的位置，提高移液管并重新校准定位基于皮层的表面上的血管上的界标。
- 删除的目的，灯芯过多的脑脊液从开颅手术，并使用无绒的吸收矛干燥相邻的骨。滴一滴温暖的3％琼脂糖（溶解在学联）以稳定的皮质通过开颅（ 图3G）是可见的。在非啮齿类动物中，3％琼脂糖以抑制脉动的神经元的荧光染料成功的摄取是必要的。对于内源信号光学成像是必要的，因为只有2％的琼脂糖结合的2％琼脂糖和盖玻片提供必要的稳定性。在这里，没有盖玻片用于染料加载步骤3％琼脂糖必要的。琼脂糖凝固后，将40倍的目标（0.8 NA，3.3毫米WD），并重新填写室学联。
- 从明场切换双光子观赏和定位移液器吸头。使用显微操纵的对角线轴，使移液管，直到其前端到达皮层（ 图3H）中的所需深度。偶尔压力喷射喷的的染料混合物（几磅，每个脉冲0.1秒）将有助于防止吸头堵塞。由于OGB-1进入细胞后变得可见，红色Alexa的染料吸头内皮层的可视化是至关重要的。
- 尝试加载皮层神经元的三分之二与全剂量的染料，重新聚焦的目标上的皮质表面确认的移液管尖端部的深度，并确保的前端是在目标位置的基础上的布局之前表面的血管。如果吸移管是在层2/3的染料混合物，小喷应该照亮细胞外空间，并揭示黑暗的阴影圆形细胞体密集的组装。
- 加载神经元胞体皮质300-600微米直径的球体，染料混合物注入到细胞外空间使用30-90的脉冲，每个脉冲1.0秒，2-10磅。不应该是如此强烈，组织移动的脉冲压力。注射完成后，等待几分钟，然后取出的吸管和目标。等待1小时，以允许OGB-1 AM是充分考虑了由神经元。
- 取出琼脂糖用于染料荷载和冲洗的记录室。将一小滴2-3％琼脂糖表面上，并迅速在开颅手术中放置一个玻璃罩。由于荧光染料的光敏感，避免过度曝光的皮质亮场或落射荧光光。 使用 xy阶段的目标到目标支架和中心标记的皮质下区域，将高NA（1.0）20倍的目标。屏蔽开颅手术前traneous光源， 如视觉刺激显示，使用多图层的遮光材料。
4。单细胞电穿孔的荧光染料
- 为了研究树突状形态，准备的100μM的Alexa Fluor 594（1:20稀释2毫米的Alexa Fluor 594股票学联）的解决方案。功能成像的树突OGB盐可用于16,17。
- 拉出长锥形移液管的尖端尺寸为1μm，并加载到移液管的5微升染料。为目标的功能域的所有其他步骤是相同的批量加载方法（ 图1-3）。相邻的神经元细胞体膜的吸头定位，监控电极阻抗的增加和施加压力，喷染，照亮细胞外空间，并了解细胞体的阴影在双光子成像。
- 当吸头相邻的神经元细胞体膜是，使用Axoporator的800A应用1-3脉冲（-8到-10 V，10毫秒的脉冲）。的神经元与染料的直接填充与双光子显微镜容易地可视化。取出吸管，并收集在体内的树突和轴突的高清晰度图像。
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Representative Results
为了说明我们的染料标记方法的精度，我们针对最小的微域非啮齿类动物的新皮质中的任何已知的功能图。在初级视觉皮层的方向图是稀疏穿插在整个奇点。这些发生在所有优选方位点收敛等，在优选的方向，周围的区域“风车”（ 图2A-B）的奇异性的样子的假彩色地图。每一个风车开颅手术选择染料标记（绿色圆圈在图2C），一定要避免大血管和小动脉，特别是15。批量加载OGB凌晨1点，跟踪变化的序列定向光栅视觉刺激的神经元的钙离子指 示剂荧光显示，单细胞分辨率功能地图的风车奇点（ 图4）。单细胞电穿孔，空间组织的树突和轴突炉火位于风车奇异性的神经元被确定在体内 （ 图5）。
图1。内源信号的光学成像设置：（A）被定位在该动物的 xy阶段和内在信号成像进行双光子显微镜安装在经由CCD照相机。光源和计算机用于控制成像会议的带来的内在成像设置的双光子成像阶段，在实验开始前搬走。 （B）关闭的4倍物镜和630纳米液体光导照明通过。无论是两个导光体连接到金属柱（左），或者可以使用一个单一的照明环连接到直接的目标（右）。遮光材料，用来屏蔽来自外部源的照明的目标， 例如 ，视觉刺激显示，在成像光学会话期间，未示出。 （C）在以往的双光子成像配置显微镜和光路的示意图。见补充图。 Shen 等人 2012年的20 15的描述的完整的双光子光路。的可伸缩的反射镜被定位成偏转来自光源的激光通过分色和皮层上。的主要的二色性，其中通过激光束，并反映了发射的光从皮质到的PMT，被移动到光路中，通过旋转过滤器炮塔。 （D）内在的成像镜收缩和过滤器的炮塔转向移动主分色的方式，允许直接从皮质到CCD相机的光路。 点击这里查看大图 。
图2。使用功能的地图，获得内在的信号成像，选择用荧光染料标记细胞的微域 （A）方向图，通过收购猫初级视觉皮层内源信号的光学成像。的各像素的颜色表示在该位置的择优取向。潜在的定向风车奇点适合用荧光染料标记细胞在黑色圆圈内所示。 （B）在皮质表面血管的地图重叠的取向图。 （C）风车的红色圆圈内的大血管或动脉和附近的风车现场的绿色圆圈内选择作为染料标记的目标。虚线矩形对应于图3B中所示的区域。比例尺（A）500万亩;米。
图3。优化的吸液管放置装载用荧光染料的神经元。（A）示意图侧的观点录音室显示，的染料负载的网站，以进行有针对性的视觉皮层（红色-和-白牛的眼睛）〜200微米以下的皮质表面。 的 xy坐标的目标对应的位置从内在信号成像确定的取向的风车奇异性。 30°角，吸液管将进入皮质。如果是皮质表面的 xy阶段的表面平行，在移液 管尖将横向移动约350微米到达风车奇异之前。 （B）录音室的顶视图显示了皮质表面的血管和移液管入口位置（红星）日就是350微米风车奇异。 （C） 的 xy阶段的位置进行调整，使得吸液管的入口位置为中心的20倍或40倍的物镜（3.3-3.5毫米WD）下。 （D）的目的是提出〜2毫米。 （E）移液器带来了开颅手术，其顶端的正上方的入口位置的皮质表面上使用绿色落射荧光光。 （F）的吸管和目标是降低同时使用皮质表面血管的明视场照明，直到成为焦点。 （G）的目标和学联和下降3％琼脂糖应用了开颅手术。 （H）双光子的可视化与40倍（0.8 NA，3.3毫米WD）的目标是用于跟踪移液管下降到所选择的皮质骨厚度，并注入染料。确认后，神经元被成功标记的荧光染料，通常情况下，更高的NA 20倍的物镜（1.0 NA，的WD2.0毫米）是用来收集两光子吨 -和z系列数据的。概要 s中的A所示，CH不是按比例绘制。
图4。对应的取向偏好双光子和内在的信号成像功能图。（A）表示OGB-1的细胞体标记的双光子成像面积AM在视觉皮层2/3层。 （B）在（A）所示的来自同一站点的个别神经元细胞体的取向偏好。成像区域集中在周围的的风车奇异，是一个有组织的首选刺激方向的地图。 （C）获得的定向地图具有内在信号成像。黑色正方形对应于（B）中所示的区域。这些数据被从图2A-C和图3B中所示的相同的实验中获得的。在100μm的（A，B）和（C）为500μm的比例尺。
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图5（A）在方向风车奇异的单个神经元的形态在体内单个神经元的树突和细胞体的覆盖方向图相同的视觉皮质的网站。神经元的电双光子的指导下，用Alexa Fluor 594 的 z-堆栈被收集在体内 ，和树枝状突起跟踪脱机使用Neurolucida软件。使用内部信号成像单细胞电穿孔前获得定位地图。 （B）的平均强度10-μm的z轴投影从皮质层1显示顶树突。 （CD）平均照度10微米的 z皮质层的2/3显示了基树突和轴突的预测。红色箭头显示的刺沿的树突和白色箭头指向个人轴突。 （AD）100微米的比例尺。
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Discussion
我们提出一个方法来定位标签在预先确定的功能性微域的新皮层的神经元细胞体（或树突和轴突）。合并内在信号光学成像与双光子显微镜提供的可能性确定哪些突触和细胞有助于微域的任何功能的地图，是否选择性神经元的神经元中的功能图的位置，以及神经元电路相关组件这种变化的视觉体验7或应用临床治疗的药物18。
据报道，在视觉皮层的成年野生型啮齿动物6,19-21没有刺激方位，方向，眼优势，或双目视差图。但是，轻松的加载用荧光染料，实现成像稳定性，再加上强大的遗传工具，可用于小鼠的神经元，导致绝大多数的研究使用双光子成像正在执行在啮齿动物，而不是雪貂，猫，和猴子的大脑皮层。
高分辨率双光子成像技术在非啮齿类哺乳动物的神经元是非常具有挑战性，因为手术时间长，较厚的骨骼和持续时间，以及需要额外的步骤，保持呼吸系统和心血管系统的大脑至少15介导的脉动。从手术到固有的信号成像和内在的双光子成像的转变必须是有效的，要求及时编制试剂，染料和显微手术程序的执行。使用双光子显微镜的内在信号成像省却了需要在传统的内源信号的光学成像钻机22所使用的设备，并减少所需的时间设置内在成像和过渡到随后的双光子成像的大部分。
我们的做法是专为提供高清晰度的2-PHO吨成像在预先设定的功能域。这提供了最低可以解决在体内的神经元细胞体，和个人的树突和轴突的功能之间的信号串扰。使用高数值孔径（NA = 1.0）的目标填充回孔径扩束镜（见补充图。20 Shen 等人 ，2012年15）的目标是为高分辨率成像的关键。根据成像的速度在XY和/或Z，呼吸系统和心血管系统的脉动可能会降低的有效成像分辨率再好的NA和光路。通过开颅大小限制在非啮齿类动物2×2毫米，用盖玻片使用相对更高浓度的琼脂糖，和执行气胸和腰椎的悬浮液，必要时15，脑脉动被限制到1-2微米。最大限度地减少呼吸系统和心血管系统引起的脉动，在大量的新大脑皮层1-2微米加载钙指标也确保皮层形成紧密的密封，围绕插入的移液管和没有染料追踪沿着柄的吸移管向皮层表面。选择染料注入和成像的网站远离大的动脉也为高品质的功能性成像的关键，因为是比较快的，感觉诱发充血（血流动力学）文物将被排除在外15。
在开颅手术现场，留下的最后一层硬脑膜完整的整个内在的信号成像和荧光染料的准备阶段 - 从而消除之前的吸管插入到皮质染料吸附量 - 增加神经元的标签，在下面的成功率和质量方式：（1）保持皮质表面清洁和/或防止硬脑膜的组织再生，从而使移液管尖头是不太可能以堵塞，维持组织的透明度，（2）避免了琼脂糖用于内在成像的触控CORTICAL表面血管琼脂糖除去时，可能会损坏，（3）防止内在成像过程中使用的，从输入之间的硬脑膜和皮层下面的颅骨的边缘周围的开颅琼脂糖。在这些区域会增加琼脂糖盖玻片之间的距离和皮质表面，这使得更加困难的吸移管插入，导致皮质组织的压缩，并减少用于成像的透明度。
准备AM荧光染料批量加载时，20％的Pluronic / DMSO混合不应该使用超过1周，从最初的准备 - 老普朗尼克/ DMSO淬灭荧光。为了获得最佳的批量加载的许多相邻的细胞体的功能指标， 例如 ，英国乐施凌晨1点，染料混合物被存储在冰面上，根据需要加载到移液管，但总是注入2小时内其准备的大脑。
在大容量装载阶段的实验中，重复1秒的脉冲压力，而不是1分钟的连续注射允许迭代的喷射参数的校准，这确保了过多的染料或不施加压力。由于从多个需要的吸移管插入标记非常大的区域，从大量的从这样一系列的许多注射的Pluronic / DMSO的组织和潜在毒性的潜在的组织损伤，我们优选1 300-600微米每2×2的染料注射部位毫米开颅手术。相比盲注射液14，双光子血管周围，利用神经元细胞体的阴性对照，以确定片材位置，和测量压力喷射的传播时的染料作为指标的体积的细胞，这将是视觉引导的导航标记与OGB凌晨1点，提高质量的染料吸附量在非啮齿类准备。
我们在这里描述的协议用荧光染料中的焦油会导致成功的标记的神经元针对性的微域试图在每一个动物。为批量加载OGB凌晨1点，我们始终得到视觉诱发电位在75％-100％，同时成像的神经元9,15和23,24 体内的单个动作电位的技术是敏感的检测。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持的国家眼科研究所R01EY017925和R21EY020985的资金从达纳白厅基础PK我们也感谢马修·彼得雷拉外科手术的帮助，格雷斯·迪翁示于图5A追踪树突补助; PRATIK Chhatbar为的手稿上的意见。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||
| 1. Life support/experiment prep | |||||||||
| Isoflurane | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | |||||||
| Isoflurane vaporizer | Midmark | VIP 3000 | |||||||
| Feedback regulated heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7079F | |||||||
| ECG monitor | Digicare Biomedical | LifeWindow Lite | |||||||
| EEG amplifier | A-M Systems | 1800 | |||||||
| EEG display monitor | Hewlett Packard | 78304A | |||||||
| End tidal CO2 monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Optimize ventilation | ||||||
| Carbide drill burrs for drilling bone | Henry Schein | fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip) | |||||||
| Cement for headplate/chamber | Dentsply | 675571, 675572 | |||||||
| Black Powder Tempera Paint | Sargent Art Inc. | 22-7185 | Add to cement to improve light shielding and reduce reflections | ||||||
| Agarose - Type III-A | Sigma | A9793 | For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging | ||||||
| Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness | World Precision Instruments | 502040, 502041 | For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed | ||||||
| Brudon curettes | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Cleaning skull surface | ||||||
| Bone wax | Ethicon | W31G | Quickly stop bleeding | ||||||
| Cotton Tipped Applicator | Electron Microscopy Sciences | 72308-05 | Clean and dry bone surface | ||||||
| Dumont #5CO Forceps | Fine Science Tools | 11295-20 | Grab individual layers of dura or pia | ||||||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | Cut dura | ||||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | To stop bleeding on the dura | ||||||
| Absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Ultra-fast and lint-free wicking of CSF | ||||||
| Blackout material | Thorlabs | BK5 | Shield craniotomy | ||||||
| 2. Dye preparation / injection | |||||||||
| Dimethyl Sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | |||||||
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | Calcium indicator | ||||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | |||||||
| Centrifugal filter (0.45 μm pore size) | Millipore | UFC30HV00 | To remove impurities before injection | ||||||
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P97 | |||||||
| Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Dye ejection pipette | ||||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | For loading dye into pipette | ||||||
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | To position pipette | ||||||
| Pressure pulse controller | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | For pressure injection of the dye | ||||||
| Single-cell electroporator | Molecular Devices | Axoporator 800A | For electroporation of the dye | ||||||
| 3. Intrinsic imaging | |||||||||
| 4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) | Olympus | UPLFLN4X | |||||||
| Intrinsic hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software is used for episodic imaging | ||||||
| CCD Camera | Adimec | Adimec-1000 | |||||||
| Light source power supply | KEPCO | ATE 15-15M | |||||||
| Light source | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW | ||||||
| Green filter (for vascular image) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (bandpass 30 nm) | For reference image of surface vasculature | ||||||
| Red filter (for intrinsic signal) | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm (bandpass 30 nm) | To collect intrinsic signals | ||||||
| Heat filter | Optical Imaging Inc. | KG-1 | |||||||
| 4. Two-photon rig/imaging | |||||||||
| Two-photon microscope and software | Prairie Technologies | See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power | |||||||
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | |||||||
| 20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) | Olympus | UMPLFLN20X | 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging) | ||||||
| 20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) | Olympus | XLUMPLFLN20X | |||||||
| 40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | |||||||
| Air table | Newport | ST-200 | Isolates preparation from external vibrations | ||||||
| xy stage | Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA) | Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage | |||||||
|
|||||||||
References
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