Summary
Bir yöntem olup, önceden belirlenmiş neokorteks fonksiyonel mikro etki floresan boyalar ile nöronlar etiketleme için açıklanmıştır. İlk olarak, iç sinyal optik görüntüleme fonksiyonel bir harita elde etmek için kullanılır. Sonra iki foton mikroskopi haritanın bir mikro-etki alanı içindeki etiket ve resim nöronlar için kullanılır.
Abstract
Kemirgen olmayan memeli primer görsel korteks, nöronların böyle bir yönelim 1-4, yön 5-7, baskın göz 8,9 ve binoküler eşitsizlik 9 olarak uyarıcı özellikler için kendi tercihinize göre kümelenmiş. Oryantasyon seçiciliği en çok çalışılan bir özelliktir ve tercihli yönelim için bir yarı-periyodik düzeni ile sürekli bir harita tüm primer görsel korteks 10,11 genelinde mevcuttur. Bu işlevsel haritaları uyarıcı seçici yanıtları yol, sinaptik hücresel ve ağ katkıları entegre milimetre mekansal ölçekler için alt-mikron yayılan görüntüleme tekniklerinin hibridizasyon gerektirir. Konvansiyonel intrinsik sinyal optik görüntüleme ile, görsel korteksin tüm yüzeyi boyunca işlevsel haritaların genel düzenini 12 tespit edilebilir. Kalsiyuma duyarlı boyalar kullanılarak in vivo olarak iki-fotonlu mikroskobu gelişme synapt belirlemek için bir olanakic giriş bireysel nöronal hücre gövdeleri 6,14 yüzlerce aynı anda bireysel dendritik dikenler az 13 veya kayıt aktivite gelen. Sonuç olarak, iki foton mikroskopi mikronaltı uzaysal çözünürlüğü ile intrinsik sinyal görüntüleme birleştirerek dendritik segmentleri ve hücrelerin neokorteks herhangi bir fonksiyonel haritanın mikro-etki katkıda bulunduğunu tam olarak belirleme olanağı sunuyor. Burada hızlı bir kortikal yönelim haritasını elde etmek ve bir kemirgen olmayan memeli floresan boyalar ile nöronlar etiketlenmesi için bu işlevsel harita belirli bir mikro-etki hedefleme için yüksek verim yöntemi göstermektedir. Iki foton görüntüleme için kullanılan aynı mikroskop ile önce intrinsik sinyal optik görüntüleme kullanarak bir yönelim haritasını oluşturur. Sonra da etikete boya ile yüklü bir mikropipet kullanarak ilgi bir mikro-etki hedef göstermek nöronal hücre gövdeleri veya etiket dendrit dikenleri ve aksonlar görülebilir böyle bir nöronun bir nüfusavivo. Önceki yöntemler üzerinde Bizim ayrıntılandırmaları neokortikal fonksiyonel mimarisi çerçevesinde alt-hücresel çözünürlük ile nöronal yapı-işlev ilişkilerinin incelenmesi kolaylaştıracaktır.
Protocol
1. Cerrahi Hazırlık
- Anestezi øndükle ve sürekli kalp atışlarının izlenmesi, tidal CO 2, EEG, ve sıcaklık bitirmek. Tüm prosedürler Güney Carolina Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve biz daha önce 9,15 yayınlanan bu esas alındı.
- Bistüri ile cilt keserek kafatasının dorsal yüzeyi Açığa. Bir Brudon küret kullanarak kemiği örten bağ dokuları diseke. Pamuk uçlu aplikatörler ve pamuklu gazlı bez kullanılarak kemik temizleyin. Küçük elçisi damarlar yoluyla zaman zaman kanamayı durdurmak için, kafatası kemik balmumu (gerektiği gibi) uygulayın.
- Siyah boya (Malzeme bakınız) ile karıştırılır diş çimento kullanılarak kafatası (kraniotomi yapılacağı ilgi bölge üzerinde) bir titanyum veya paslanmaz çelik kafa plakası takın. Kafa plakasının merkezinde bir dikdörtgen açılması kranyotomi için erişim sağlar ve optik görüntüleme. Baş levha üstüne bir metal haznesi takın. Bu haznesi suya daldırma objektif lens ile görüntüleme için bir sıvı rezervuar olarak hizmet verecek.
- Metal mesajları kullanarak bir xy aşamasına Baş levha sabitleyin.
- Bir diş matkap kullanılarak headplate dikdörtgen şeklindeki açılış içinde kemik geniş bir alanda ince. Inceltilmesi alan iyi planlanmış kraniotomi sınırlarının ötesine genişletmek gerekir. Kraniotomi yerinde, kemik kalınlığı coverglass ve neokortikal yüzeyi arasındaki agaroz kalınlığı dikte edecek, çünkü yüksek çözünürlüklü görüntüler neokorteks elde edilmesi halinde kemirgen olmayan memeli kalın kafatası (aşağıya bakınız) inceltilmiş olmalıdır .
- Kraniotomi için kemik bir 2 x 2 mm kare anahat delin. Kemik kırıkları kaldırmak ve altta yatan kortekse ısı dağılımını en aza indirmek için yeni yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ile periyodik odası durulayın. Gerektiği gibi zaman zaman kanamayı durdurmak için, kemik mum uygulayın.
- Lift # 3 forseps ile kemik flep.
- Tüm ama bir ince forseps (# 5CO) ve Vannas yay makas kullanılarak dura alt katmanı kaldırın. Kemirgen olmayan memelilerde, dura kalın, opak, fakat ayrı tabakalar halinde çıkarılabilir. Kanama nadir, ancak Gelfoam ile durdurulabilir ve her kan kalıntı yavaşça dura forseps kullanılarak ve ACSF ile durulama kalan tabaka kaldırılması gerekir. Dura son kat şeffaf ve pial damarları aracılığıyla açıkça görünür olmalıdır. Intrinsik sinyal görüntüleme sırasında dura bu son tabaka intakt bırakılması (Tartışma bakın) deney sonraki iki-foton görüntüleme aşaması için floresan kalsiyum göstergelerin toplu yükleme başarı oranını artıracaktır.
- Sıcak% 2'lik agaroz (ACSF çözünmüş) bir damla uygulayın ve hemen kraniotomi üzerinde coverglass yerleştirin. Solunum ve kardiyovasküler pulsasyonu cerrahi bir mikroskop veya bir oküler ile en az olmasını sağlamak için kontrol kranyotomi ikiAydınlık-alan modu foton mikroskop.
2. İçsel Sinyal Optik Görüntüleme
- Intrinsik sinyal görüntüleme sırasında kurumasını önlemek için agaroz coverglass dış çevresinde ACSF ile ıslatılmış jel köpüğü ekleyin.
- Iki foton mikroskobu (Şekil 1) üstüne standart C-mount noktasına intrinsik sinyal görüntüleme CCD kamera takın. Xy aşamada (Şekil 1A) yakınındaki hava masaya aydınlatıcı ışık kaynağı yerleştirin. Konumu ve kraniotomi ve headplate / odası (Şekil 1B) üzerinde ışık kılavuzları sabitleyin. Içsel sinyalleri için gerekli olan yansıyan kırmızı ışık, CCD kamera (Şekil 1 C-D) göre kranyotomi doğrudan geçecek şekilde ana renk değişikliği ve C montaj noktası aşağıda ayna çekin. 4x hava nesnel (0.13 NA, 17 mm WD), Görüş 2 x 2 mm alanını kullanarak intrinsik sinyal görüntüleme için kullanılabilir.
- L'de bir ısı filtre eklemeısıtma korteks önlemek için kilo yolu. Yeşil ışık (546 nm merkezi λ) ve kortikal yüzey kan damarlarının bir dijital referans görüntü kaydetmek geçer bir filtre kullanın.
- Kortikal yüzey altında 500 um z odağı taşıyın. Içsel sinyalleri ölçmek için korteks aydınlatmak için kırmızı bir filtre (630 nm merkezi λ) kullanın. Kortikal yüzey düzgün yandığını tür ışık kılavuzları yerleştirin. Görsel görüntüleme uyarıcı tarafından üretilen ışık kranyotomi koruyun. Görsel uyaranlara ve kayıt yansıma verileri görüntüler bir dizi sunun. 10 dakika içinde bir oryantasyon haritası oluşturmak için, 8 uyaranlara (Her yön için 4 yönelimleri ve iki yönde) bir dizi 4 tekrarlar karşılık gelen veri toplamak.
- Yanlış bir renk yönelim haritasını oluşturmak için intrinsik sinyal verilerini analiz edin. Nöronların iki foton etiketleme, örneğin, oryantasyon fırıldak tekilliklerin için potansiyel hedef bölge seçin - harita noktaları neredeTüm tercih yönelimleri (Şekil 2A) birleşir. Yönelim harita ve kortikal yüzey damar (Şekil 2B-C) görüntü bindirmesi. Büyük kan damarları ve arteriyoller 15 olan yerlerde kaçınarak, bir hedef seçmek için fonksiyonel alanları ve geniş yüzey damarlarının konumu düzenini kullanın.
3. Floresan Kalsiyum Göstergeler Toplu Yükleme
- 5 ul DMSO içinde 1 g Pluronic eklenmesi ile% 20 Pluronic / DMSO çözeltisi hazırlayın. Pluronic tamamen çözünmesi için 10 dakika boyunca 60 ° C'de karışım ısıtılır. Karışım, oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Floresan kalsiyum gösterge Oregon Green 488 Bapta-1:00 (AM OGB-1), 50 ug şişeye Pluronic / DMSO karışımına 4 ul ekle. Sonra bir kırmızı boya (Alexa Fluor 594, 2 mM stok çözeltisi) ve 1 ul OGB-01:00 1 mM nihai konsantrasyon için pipet çözelti 35 ul (Malzeme bakın). ½ saat için çözelti sonikasyonsoğutulmuş bir su banyosu ve ardından kirleri çıkarmak için filtreyi bir 0.45 mikron ile santrifüjlenir.
- 2.0-2.5 mikron dış uç çapı ile uzun konik pipet çekin. Pipet içine boya karışımı 5 ul yerleştirin.
- Pipet ekleme kolaylaştırmak ve yüksek kalitede iki foton görüntü elde etmek için dura son katmanı kaldırın.
- Pipet kortikal katman 2/3 'hedefine ulaşmak amacıyla oturtulması gerektiği kortikal yüzey üzerinde yerini belirleyin. Bizim önceden kortikal hedef yönlendirmesi harita (Şekil 2) bir fırıldak tekillik olduğunu. Pipet odasının duvar ve nesnel arasındaki geçmek için bir 30 ° açıyla korteksin içine yönlendirilmesi gerekir. Böylece, 200 mikron kortikal yüzeyin altında hedef bölge etiketlemek için, kortikal yüzey üzerinde pipet giriş pozisyonuna hedef pozisyon (Şekil 3 AB) yanal yaklaşık 350 mikron olacaktır.
- (Xy sahne üzerinde hareket ettirin hayvan ve pipette mikromanipülatör merkezi objektif (Şekil 3C) altında kortikal yüzey giriş pozisyonuna) yerleştirilir. Pipet kolayca kraniotomi duvar boyunca nesnel veya kemik dokunmadan korteks girecek olmasını sağlamak için en az 3 mm (Malzeme bakınız) bir çalışma mesafesi (WD) ile 20x veya 40x objektif kullanın. Giriş pozisyonuna hedefi altında ortalanmış sonra, 2 mm (Şekil 3B) tarafından objektif Z konumunu yükseltmek. Yeşil epi-floresan ışık pipet içinde kırmızı Alexa boya görselleştirmek açıkken, (ucu merkezli kadar doğrudan kortikal yüzey giriş pozisyonuna yukarıda hedefi altında (ve odaklanmış) pipet hareket mikromanipülatör ve çapraz eksen kullanın Şekil 3E).
- Sürekli ocu aracılığıyla pipet izlerken pipet, kortikal yüzey (Şekil 3F) ulaşana kadar pipet dikey (z ekseni boyunca) indirinmikroskop lars. Aydınlık alan aydınlatma kullanarak, kortikal yüzey kan damarları ve kalan meningeal membran (pia ve araknoid) pipet kortikal yüzey yaklaşırken kolayca görülebilir. Pipet istenilen giriş pozisyonuna ulaşamazsa, pipet yükseltmek ve kortikal yüzeyde vasküler görülecek dayalı hedefleme recalibrate.
- Nesnel çıkarın, kraniotomi gelen aşırı beyin omurilik sıvısı fitil ve tiftiksiz emilim spears kullanarak komşu kemikte kurulayın. Kraniotomi (Şekil 3G) aracılığıyla görünür korteks dengelemek için ılık% 3 agaroz (ACSF çözünmüş) bir damla uygulayın. Kemirgen olmayan,% 3 agaroz nöronlar tarafından floresan boyalar başarılı bir şekilde alımı için pulsasyonu kırmak için gereklidir. % 2 agaroz ve coverglass kombinasyonu gerekli stabilite sağladığından intrinsik sinyal optik görüntüleme için sadece% 2'lik agaroz gereklidir. Burada, herhangi bir coverglass% 3 agaroz böylece boya yükleme adımı için, malzemenin,gereklidir. Agaroz katılaşmış sonra ACSF ile odası, 40x objektif takın (0.8 NA, 3,3 mm WD) ve yeniden doldurun.
- Parlak alanında iki foton görüntüleme geçin ve pipet bulun. Ucu korteks (Şekil 3H), istenen derinliğe ulaşıncaya kadar mikromanipülatör bir çapraz eksen kullanarak, pipet hareket eder. Boya karışımı (bir kaç psi her darbenin 0.1 sn) Arasıra basınçlı ejeksiyon ponponları tıkanmasını pipet önlemeye yardımcı olacaktır. KGB-1 yalnızca hücre girdikten sonra görünür hale AM Çünkü, kırmızı Alexa boya korteks içindeki pipet ucu görselleştirme için kritik öneme sahiptir.
- Pipet derinliği onaylamak için kortikal yüzey üzerinde yeniden odaklanmak, boyanın tam doz ile objektif kortikal katman 2/3 nöronların yüklemek ve ucu düzeni esas hedef konumda olduğundan emin olmak için çalışmadan önce yüzey kan damarları. Pipet katman 2/3 'de ise, boya karışımının küçük Puffs yanmalıdırekstrasellüler boşluğa ve koyu gölgeler gibi dairesel hücre gövdeleri yoğun bir derleme ortaya koymaktadır.
- Korteks 300-600 mikron çaplı bir küre nöronal hücre gövdeleri yüklenmesi için, 30-90 bakliyat, her nabız 1.0 sn, 2-10 psi kullanarak ekstrasellüler boşluğa boya karışımı enjekte. Basınç sinyalleri doku taşınacak şekilde güçlü olmamalıdır. Enjeksiyon işlemi tamamlandıktan sonra, bir kaç dakika bekleyin, daha sonra, pipet ve objektif çıkarın. KGB-1 nöronlar tarafından tamamen alınan-up yapılacak AM izin 1 saat bekleyin.
- Boya yükleme için kullanılan agaroz çıkarın ve kayıt oda durulama. Yüzey üzerinde% 2-3 agaroz küçük bir damla koyun ve hızlı bir kranyotomi üzerinde bir coverglass yerleştirin. Floresan boyalar ışığa duyarlı olduğundan, parlak alan veya epi-floresan ışık korteks fazla maruz bırakmaktan kaçının. Xy sahne kullanarak hedefi altında objektif sahibi ve yeniden merkezi etiketli kortikal bölgeye yüksek NA (1.0) 20x objektif yerleştirin. Eski En kraniotomi koruyuntraneous ışık kaynakları, örneğin, görsel uyaran ekran karartma malzemenin çoklu katmanlar kullanarak.
4. Floresan Boyalar Tek hücreli Elektroporasyon
- Dendritik morfoloji eğitim için 100 mcM Alexa Fluor 594 (2 mM Alexa Fluor 594 stoklar ACSF olarak 01:20 seyreltme) bir solüsyon hazırlanır. Dendritlerin işlevsel görüntüleme için bir OGB tuz 16,17 kullanılabilir.
- 1 mikron bir ipucu boyutu ile uzun konik pipet çekin ve pipet içine boya 5 ul yükleyin. Fonksiyonel bir etki hedefleyen diğer tüm adımları toplu yükleme yöntemi (Şekil 1-3) ile aynıdır. Bir nöron hücre gövdesi zarı bitişik pipet yerleştirmek için, empedans artışı izlemek ve ekstrasellüler alanı aydınlatmak ve iki-foton görüntüleme sırasında gölgeler gibi hücre gövdeleri görmek için boya basınç ponponları uygulayın.
- Pipet, bir nöronal hücre gövdesi zarı bitişik olduğunda, uygulamak için Axoporator 800A kullanın1-3 bakliyat (-8 -10 V, 10 msn nabız). Boya ile nöronun hemen dolgu iki foton mikroskopi ile kolayca görüntülenmiştir. Pipet çıkarın ve in vivo olarak dendrit ve akson yüksek çözünürlüklü görüntüler toplamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bizim boya etiketleme yöntemleri hassasiyeti göstermek için, biz kemirgen olmayan neokorteks bilinen herhangi bir fonksiyonel haritanın küçük mikro-etki hedeflenmiş. Seyrek tekilliklerin olan birincil görsel korteks yönelim harita boyunca noktaladı. Bunların hepsi tercih yönelimleri gibi yakınsama noktalarda meydana geldiğini tercihli yönelim, "fırıldak" (Şekil 2A-B) gibi tekillik göz çevresindeki bölgelerin sahte renk haritalarında. Kraniotomi başına bir fırıldak özellikle 15 büyük gemi ve arteriyoller önlemek için emin olmak, boya etiketleme (Şekil 2C yeşil daire) için seçilir. KGB-1 GM Toplu yükleme ile odaklı ızgara görsel uyaranlara dizisi nöronal kalsiyum göstergesi floresans değişiklikleri izleme fırıldak tekilliklerin etrafına tek hücreli çözümlemesinin işlevsel haritaları (Şekil 4) açığa çıkarır. Tek hücreli elektroporasyon ile dendrit ve akson mekansal organizasyon olarak gelenbir fırıldak tekilliği bulunan ocak ateşi nöron vivo (Şekil 5) belirlenir.
Şekil 1. İçsel sinyal optik görüntüleme ayarları. (A) hayvan xy sahne ve intrinsik sinyal görüntüleme konumlandırılmış iki foton mikroskop üzerine monte edilmiş bir CCD kamera ile yapılır. Görüntüleme oturumunu kontrol etmek için kullanılan ışık kaynağı ve bilgisayar intrinsik görüntüleme için kurulum getirdi ve deney başlar ve iki-foton görüntüleme aşamasından önce uzağa taşınır. (B) 4x objektif ve sıvı ışık kılavuzları ile 630 nm aydınlatma görünümü kadar kapatın. Ya iki ışık kılavuzları metal ileti (sol) bağlı, ya da doğrudan hedefi (sağ) bağlı tek bir aydınlatıcı halka kullanılabilir. Açılan malzeme için kullanılan aydınlatma dış kaynaklardan objektif kalkan, örneğin, optik görüntüleme oturumları sırasında görsel uyarana ekran, gösterilmez. Konvansiyonel iki-fotonlu görüntüleme konfigürasyonunda mikroskop ve ışık yolu (C) şematik. Ek Şekil bakın. Shen ve ark 20. 2012 15 tam iki foton ışık Yolun açıklaması için. Çekilebilir ayna dikroik yoluyla ve korteks üzerine lazer ışık saptırmak için konumlandırılmış. Lazer ışını geçirir ve PMT için korteksten yayılan ışığı yansıtır ilköğretim dikroik, filtre taret çevirerek ışık yolu taşınır. (D) intrinsik görüntüleme için ayna geri çekilir ve filtre taret CCD kameraya korteks doğrudan bir ışık yolu izin yolu birincil dikroik dışarı taşımak için açıktır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Floresan boyalar ile nöronlar etiketleme için bir mikro-alanı seçmek için intrinsik sinyal görüntüleme ile elde edilen fonksiyonel haritalar kullanma. Cat primer görsel korteks (A) Oryantasyon haritası intrinsik sinyal optik görüntüleme ile satın aldı. Her pikselin rengi o konumda tercihli yönelim temsil eder. Floresan boyalar ile nöronlar etiketleme için uygun potansiyel yönelim fırıldak tekilliklerin siyah çevrelerinde gösterilmiştir. (B) kortikal yüzey kan damarlarının haritası yönelim harita ile kaplanmış. (C) kırmızı çevrelerinde Pinwheels büyük kan damarları veya arteriol yakın oldukları ve bu nedenle yeşil daire içinde fırıldak sitesi boya etiketleme için hedef olarak seçilmiştir. Kesikli çizgi dikdörtgen Şekil 3B de gösterilen bölge karşılık gelir. Ve (A) 500 Ölçek çubuğuMu; m.
Şekil 3,. Floresan boyalar ile nöronlar yüklenmesi için pipet yerleştirme optimize. Kayıt odasına (A) şematik yan görünüm boya yükleme sitesi görsel korteks (kırmızı-beyaz boğa gözü) olarak hedef alacağı göstermektedir ~ 200 mikron kortikal altında yüzey. Hedef xy koordinat intrinsik sinyal görüntüleme belirlenen oryantasyon fırıldak tekillik konuma gelir. Pipet 30 ° açıyla korteks girecek. Kortikal yüzey xy aşamasında yüzeye paralel ise, pipet fırıldak tekillik ulaşmadan yanal yaklaşık 350 mikron hareket edecektir. (B) kayıt odasına üstten görünümü kortikal yüzey damar ve pipet giriş pozisyonuna (kırmızı yıldız) inci gösterirde fırıldak tekillik 350 mikron. (C) xy sahne pozisyon pipet giriş pozisyonuna 20x veya 40x objektif (3,3-3,5 mm WD) altında ortalanmış olduğu gibi ayarlanır. (D) amacı, ~ 2 mm yükseltilir. (E) pipet kranyotomi üzerine getirilir ve ucunun doğrudan doğruya yeşil epi-floresan ışık kullanılarak kortikal yüzey üzerinde giriş pozisyonu üstünde konumlandırılmıştır. Kortikal yüzey kan damarları odak haline gelene kadar (F) pipet ve objektif parlak alan aydınlatma kullanılarak eş zamanlı olarak indirilir. (G) ve hedef ACSF çıkarılır ve% 3 agaroz bir damla kranyotomi üzerine uygulanır. 40x (0.8 NA, 3,3 mm WD) hedefi ile (H) İki foton görüntüleme seçilen kortikal derinliğe pipet aşağı izleyin ve boya enjekte etmek için kullanılır. Ve z-serisi verileri - nöronlar başarılı bir 20x objektif (1.0 NA, 2.0 mm WD) NA, tipik olarak yüksek bir floresanslı boya ile etiketlenir emin olduktan sonra iki-fotonlu t toplamak için kullanılır. Şematik s A gösterildiği gibi, CH ölçekli çizilmez.
Şekil 4. (A) OGB-1 ile etiketli hücre gövdeleri gösteren iki-foton görüntülü alan görsel korteks tabakası 2/3 iki-foton ve intrinsik sinyal görüntüleme fonksiyonel haritalarda yönelim tercih Yazışmalar. AM. (B) Aynı sitede bireysel nöronal hücre gövdeleri yönelimi tercih (A) 'da gösterilmektedir. Görüntülü bölgede yoğunlaştı fırıldak tekilliğin çevresinde tercih edilen uyarıcı yönelim organize bir harita. (C) yönelimi haritası intrinsik sinyal görüntüleme ile elde edilen. Siyah kare (B) 'de gösterildiği bölgeye karşılık gelir. Bu veriler, Şekil 2A-C ve 3B'de gösterilen aynı deneyden elde edilmiştir. (AB) 100 mikron ve (C) 500 mikron Ölçü çubuğu.
d/50025/50025fig5.jpg "/>
Şekil 5,. Bir oryantasyon çarkıfelek tekilliği tek bir in vivo nöron morfolojisi. (A) tek bir nöronun dendrit ve hücre gövdesi aynı görsel kortikal site haritası oryantasyon ile kaplanır. Nöron iki-fotonlu eşliğinde Alexa Fluor 594 ile electroporated edildi, z-yığın in vivo toplandı ve dendritik işlemler Neurolucida yazılımı kullanılarak çevrimdışı takip edildi. Yönelim haritasını tek hücreli elektroporasyon önce intrinsik sinyal görüntüleme kullanılarak elde edilmiştir. (B) kortikal tabaka 1 Ortalama yoğunluğu 10 mikron-z-projeksiyon apikal dendritler gösterir. (CD) Ortalama yoğunluğu 10 mikron-z-projeksiyonlar kortikal katman 2/3 kez bazal dendrit ve aksonlar. Kırmızı oklar bireysel aksonları gelin dendrit ve beyaz oklar boyunca dikenleri göstermektedir. (AD) 100 mikron Ölçek çubuklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz neokorteks önceden belirlenmiş fonksiyonel mikro alanlarda nöronal hücre gövdeleri (ya da dendrit ve akson) ve etiketleme hedeflemek için bir yöntem mevcut. Iki foton mikroskopi ile intrinsik sinyal optik görüntüleme birleştirme sinapslar ve hücrelerin herhangi bir fonksiyonel haritanın mikro-etki katkıda belirleme imkanı sunuyor, ister işlevsel haritası nöronun konumu ve nöronal devre ile nöronal seçicilik korele bileşenleri görsel deneyim 7 veya klinik tedavi edici ilaçlar 18 uygulaması ile bu değişiklik.
Uyarıcı yönlendirme, yön, baskın göz, dürbün ya da eşitsizlik yok haritalar yetişkin vahşi tip kemirgenler 6,19-21 arasında görsel korteks bildirilmiştir. Ancak, floresan boyalar ile nöronlar yükleme ve fareler için uygun güçlü bir genetik araçlarla birlikte, görüntüleme istikrarına ulaşılabilmesi kolaylığı çalışmaların büyük çoğunluğu sonuçlandıkemirgenler yerine gelincikleri, kedi ve maymunlarda gerçekleştirilen serebral korteksin iki foton görüntüleme kullanarak.
Kemirgen olmayan memeli nöronların Yüksek çözünürlüklü iki foton görüntüleme çünkü uzun ameliyat süreleri, kalın kemik ve dura ve minimum 15 beynin solunum ve kardiyovasküler aracılı pulsasyonu tutmak için gerekli ek adımlar çok zor olabilir. Cerrahiden intrinsik sinyal görüntüleme ve iki-foton görüntüleme içsel geçişler reaktifleri, boyalar ve mikro-cerrahi işlemlerin yürütülmesi zamanında hazırlık gerektiren, verimli olması gerekir. Intrinsik sinyal görüntüleme için iki-fotonlu mikroskop kullanarak geleneksel sinyal esas optik görüntüleme kulesi 22 içinde kullanılan ve sonraki iki-fotonlu görüntüleme için içsel görüntüleme ve geçiş kurmak için gerekli zamanı kısaltmaktadır, teçhizat çok için ihtiyacı ortadan kaldırmaktadır.
Bizim yaklaşım özellikle yüksek çözünürlüklü iki pho sağlamak için tasarlanmıştırÖnceden belirlenmiş ton fonksiyonel etki görüntüleme. Bu minimum çapraz nöronal hücre gövdeleri ve bireysel dendritik dikenleri ve aksonlar arasında fonksiyonel sinyallerin tartışma in vivo çözülebilir sağlar. Yüksek sayısal açıklık (NA = 1.0) objektif kullanma ve kiriş genişletme optikler (Ek Şekil bakın. Shen ve ark. 20, 2012 15) ile objektif arka diyafram doldurma yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kritik öneme sahiptir. XY ve / veya Z görüntüleme hızına bağlı olarak, solunum ve kardiyovasküler pulsasyonu NA ve optik ışık yolu ne kadar iyi olursa olsun etkin görüntüleme çözünürlüğünü düşürebilir. , 2 x 2 mm olmayan kemirgenler kraniotomi boyutunu sınırlayan bir coverglass ile agaroz nispeten yüksek konsantrasyon kullanılarak ve gerekli 15, beyin pulsasyonu 1-2 mikron sınırlı zaman bir pnömotoraks ve lomber süspansiyon yapılarak. Dökme sırasında 1-2 um neokorteks solunum ve kardiyovasküler kaynaklı titreşimler en aza indirmekkalsiyum göstergeleri yükleme zamanda korteksin takılı pipet etrafında sıkı bir sızdırmazlık oluşturur ve hiçbir boya kortikal yüzeye pipet sap boyunca yukarı izler o sağlar. Nispeten hızlı duyu-uyarılmış hiperemi (hemodinamik) eserler 15 alınmayacaktır çünkü uzakta büyük arteriol gelen boya enjeksiyonu ve görüntüleme siteleri seçilmesi aynı zamanda yüksek kaliteli fonksiyonel görüntüleme için önemlidir.
Kraniotomi sitede, intrinsik sinyal görüntüleme ve floresan boya hazırlık aşamaları boyunca bozulmadan dura son kat bırakarak - böylece sadece boya yükleme için korteksin içine pipetle yerleştirilmeden önce çıkarmadan - Aşağıdaki nöronal etiketleme başarı oranı ve kalitesini artırır yolları: (1) pipet ucu tıkanmış olsun olasılığı düşüktür ve doku şeffaflık sağlanmalıdır böylece dural doku regrowth temiz kortikal yüzey tutar ve / veya engeller, (2) agaroz intrinsik görüntüleme dokunuş için kullanılan sahip önler cortAgaroz çıkartıldığı zaman zarar görebilir nik yüzey kan damarları, (3) kranyotomi etrafındaki kafatası altında dura ve korteks arasında girmesini esas görüntüleme sırasında kullanılan agaroz önler. Agaroz bu bölgelerde kortikal dokusu sıkıştırma yol açar ve görüntüleme için saydamlık azaltır coverglass ve daha zor pipet ekleme yapar kortikal yüzeyi arasındaki mesafe artar.
Toplu yükleme için floresan boyalar AM hazırlarken,% 20 Pluronic / DMSO karışımı olan ilk hazırlık itibaren 1 hafta ötesine asla kullanılmamalıdır - Eski Pluronic / DMSO floresans doyurur. Bir fonksiyonel gösterge, örneğin, OGB-01:00 ile birçok bitişik hücre gövdelerinin en uygun dökme yük için, boya karışımı, buz üzerinde saklanır gerektiği şekilde pipet içine yüklenmiş, ancak her zaman hazırlık 2 saat içinde beyin içine enjekte edilir.
Ve toplu yükleme aşamasındaDeney, yerine 1 dakika sürekli enjeksiyon basıncı altında 1 saniye bakliyat tekrarlanan aşırı boya veya baskı uygulanmaz olmasını sağlar püskürtme parametrelerin kalibrasyonu, iteratif için olanak sağlar. Çünkü birçok enjeksiyon gibi bir dizi Pluronic / DMSO büyük miktarda doku ve potansiyel toksisite çok büyük bölgeleri etiketlemek için gereken birden pipet eklemeleri gelen potansiyel doku hasarı, biz 2 x 2 başına bir 300-600 mikron boya enjeksiyon yerinde tercih mm kraniotomi. Kör iğne 14, kan damarları, lamina konumunu belirlemek için nöronal hücre gövdelerinin negatif kontrast kullanımı, ve olacaktır hücrelerin hacminin bir indeks olarak basınç püskürtmenin ardından boya yayılmasını ölçme çevresinde iki-fotonlu görsel olarak yönlendirilen navigasyon ile karşılaştırıldığında KGB-1 AM ile etiketlenmiş, kemirgen olmayan hazırlıkları boya yükleme kalitesini artırır.
Burada tarif protokol tar floresan boyalar ile nöronların başarılı etiketleme yol açarHer hayvan geted mikro etki çalıştı. AM OGB-1 ile toplu yükleme için, sürekli olarak aynı anda görüntülü nöronların 9,15 75-100% görsel-uyarılmış yanıtlar elde edilir ve tekniği vivo 23,24 tek aksiyon potansiyellerinin tespiti duyarlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Şekil 5A gösterilen dendritler izlemek için Grace Dion;; Bu eser Biz de cerrahi işlemler için yardım Matthew Petrella teşekkür Ulusal Göz Enstitüsü R01EY017925 ve R21EY020985 ve Dana & Whitehall Kuruluşlar PK fonlarından hibe tarafından desteklenen ve Pratik Chhatbar için yazması üzerine yorumlar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||
| 1. Life support/experiment prep | |||||||||
| Isoflurane | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | |||||||
| Isoflurane vaporizer | Midmark | VIP 3000 | |||||||
| Feedback regulated heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7079F | |||||||
| ECG monitor | Digicare Biomedical | LifeWindow Lite | |||||||
| EEG amplifier | A-M Systems | 1800 | |||||||
| EEG display monitor | Hewlett Packard | 78304A | |||||||
| End tidal CO2 monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Optimize ventilation | ||||||
| Carbide drill burrs for drilling bone | Henry Schein | fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip) | |||||||
| Cement for headplate/chamber | Dentsply | 675571, 675572 | |||||||
| Black Powder Tempera Paint | Sargent Art Inc. | 22-7185 | Add to cement to improve light shielding and reduce reflections | ||||||
| Agarose - Type III-A | Sigma | A9793 | For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging | ||||||
| Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness | World Precision Instruments | 502040, 502041 | For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed | ||||||
| Brudon curettes | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Cleaning skull surface | ||||||
| Bone wax | Ethicon | W31G | Quickly stop bleeding | ||||||
| Cotton Tipped Applicator | Electron Microscopy Sciences | 72308-05 | Clean and dry bone surface | ||||||
| Dumont #5CO Forceps | Fine Science Tools | 11295-20 | Grab individual layers of dura or pia | ||||||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | Cut dura | ||||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | To stop bleeding on the dura | ||||||
| Absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Ultra-fast and lint-free wicking of CSF | ||||||
| Blackout material | Thorlabs | BK5 | Shield craniotomy | ||||||
| 2. Dye preparation / injection | |||||||||
| Dimethyl Sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | |||||||
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | Calcium indicator | ||||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | |||||||
| Centrifugal filter (0.45 μm pore size) | Millipore | UFC30HV00 | To remove impurities before injection | ||||||
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P97 | |||||||
| Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Dye ejection pipette | ||||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | For loading dye into pipette | ||||||
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | To position pipette | ||||||
| Pressure pulse controller | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | For pressure injection of the dye | ||||||
| Single-cell electroporator | Molecular Devices | Axoporator 800A | For electroporation of the dye | ||||||
| 3. Intrinsic imaging | |||||||||
| 4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) | Olympus | UPLFLN4X | |||||||
| Intrinsic hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software is used for episodic imaging | ||||||
| CCD Camera | Adimec | Adimec-1000 | |||||||
| Light source power supply | KEPCO | ATE 15-15M | |||||||
| Light source | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW | ||||||
| Green filter (for vascular image) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (bandpass 30 nm) | For reference image of surface vasculature | ||||||
| Red filter (for intrinsic signal) | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm (bandpass 30 nm) | To collect intrinsic signals | ||||||
| Heat filter | Optical Imaging Inc. | KG-1 | |||||||
| 4. Two-photon rig/imaging | |||||||||
| Two-photon microscope and software | Prairie Technologies | See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power | |||||||
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | |||||||
| 20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) | Olympus | UMPLFLN20X | 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging) | ||||||
| 20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) | Olympus | XLUMPLFLN20X | |||||||
| 40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | |||||||
| Air table | Newport | ST-200 | Isolates preparation from external vibrations | ||||||
| xy stage | Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA) | Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage | |||||||
|
|||||||||
References
- Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
- Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
- Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns. Nature. 353, 429-431 (1991).
- Ohki, K., et al. Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels. Nature. 442, 925-928 (2006).
- Shmuel, A., Grinvald, A. Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18. J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).
- Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
- Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity. Nature. 456, 952-956 (2008).
- Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex. Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).
- Kara, P., Boyd, J. D. A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex. Nature. 458, 627-631 (2009).
- da Costa, N. M., Martin, K. A. Whose Cortical Column Would that Be. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16 (2010).
- Kaschube, M., et al. Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex. Science. 330, 1113-1116 (2010).
- Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex. Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).
- Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, 501-505 (2011).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).
- Nevian, T., Helmchen, F. Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation. Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).
- Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex. Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471, 177-182 (2011).
- Rochefort, N. L., et al. Development of direction selectivity in mouse cortical neurons. Neuron. 71, 425-432 (2011).
- Mrsic-Flogel, T. D., et al. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-972 (2007).
- Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. Brain mapping: The Methods. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).
- Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
- Hofer, S. B., et al. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).
