Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging

Summary

Un metodo è descritto per l'etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in predeterminate funzionali micro-domini della neocorteccia. Primo, imaging segnale intrinseco ottico viene utilizzato per ottenere una mappa funzionale. Poi microscopia a due fotoni è usato per l'etichetta e neuroni di immagine all'interno di un micro-dominio della mappa.

Abstract

Nella corteccia visiva primaria di non-mammiferi roditori, i neuroni sono raggruppati in base alla loro preferenza per le funzioni di stimolo come l'orientamento ^1-4, direzione ^5-7, dominanza oculare ^8,9 e disparità binoculare ^9. Selettività Orientamento è la caratteristica più studiati ed una mappa continua con un quasi-periodico disposizione per l'orientamento preferito è presente su tutta la corteccia visiva primaria ^10,11. L'integrazione dei contributi sinaptiche, cellulare e di rete che portano a risposte di stimolo selettivo in queste mappe funzionali richiede l'ibridazione di tecniche di imaging che si estendono su sub-micron di millimetro scale spaziali. Con l'imaging convenzionale segnale ottico intrinseco, il layout generale di mappe funzionali tutta la superficie della corteccia visiva può essere determinato ^12. Lo sviluppo in vivo di due fotoni microscopia utilizzando coloranti sensibili calcio permette di determinare la SYNAPTingresso ic arrivare a spine dendritiche singoli ¹³ o record di attività contemporaneamente da centinaia di singoli corpi cellulari neuronali ^6,14. Di conseguenza, combinando l'imaging intrinseca segnale con la sub-micron risoluzione spaziale di due fotoni microscopia offre la possibilità di determinare esattamente quali segmenti dendritiche e cellule contribuiscono al micro-dominio di ogni mappa funzionale nella neocorteccia. Qui mostriamo un alto rendimento metodo per ottenere rapidamente una mappa corticale orientamento e di una versione specifica micro-dominio in questa mappa funzionale per l'etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti in un non-roditore mammifero. Con il microscopio stesso utilizzato per l'imaging a due fotoni, dobbiamo prima di generare una mappa di orientamento utilizzando l'imaging intrinseca segnale ottico. Poi ci mostrano come assegnare un micro-dominio di interesse con una micropipetta caricato con colorante per l'etichetta sia una popolazione di corpi cellulari neuronali o l'etichetta di un singolo neurone in modo tale che dendriti e degli assoni, le spine sono visibili invivo. Nostri perfezionamenti rispetto ai metodi precedenti facilitare un esame della neuronali relazioni struttura-funzione con sub-cellulare risoluzione nel quadro neocorticali architetture funzionali.

Protocol

1. Preparazione chirurgica

1. Indurre l'anestesia e monitorare la frequenza cardiaca, terminare CO marea _2, EEG, e la temperatura. Tutte le procedure sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso della Medical University of South Carolina e si basano su quelle che abbiamo precedentemente pubblicato con il ^9,15.
2. Esporre la superficie dorsale del cranio tagliando la pelle con una lama da bisturi. Staccare il tessuto connettivo sovrastanti l'osso con una curette Brudon. Pulire l'osso con applicatori di cotone con punta e garza di cotone. Applicare la cera ossea (se necessario) al cranio, per arrestare l'emorragia occasionale attraverso piccole vene emissario.
3. Collegare un titanio o acciaio piastra di testa in acciaio al cranio (sopra la regione di interesse in cui la craniotomia verrà eseguita) utilizzando cemento dentale mescolato con vernice nera (vedi Materiali). Una apertura rettangolare al centro della piastra di testa fornisce l'accesso per la craniotomia e imaging ottico. Allegare una camera metallica sulla parte superiore della piastra di testa. Questa camera servirà come un serbatoio di fluido per l'imaging con la lente obiettivo immersione in acqua.
4. Fissare la piastra di testa per una fase xy con perni in metallo.
5. Assottigliare una vasta area dell'osso entro l'apertura rettangolare della piastra di testa utilizzando un trapano dentistico. L'area deve essere diluito deve estendersi ben oltre i confini della craniotomia previsto. Il cranio di spessore non roditori mammiferi deve essere diluito se immagini ad alta risoluzione sono da acquisire dalla neocorteccia perché al sito craniotomia, lo spessore dell'osso detterà lo spessore del agarosio tra la superficie e coverglass neocorticale (vedi sotto) .
6. Praticare un 2 x 2 mm quadrati contorno nell'osso per la craniotomia. Sciacquare la camera periodicamente con fresco liquido cerebrospinale artificiale (ACSF) per rimuovere frammenti ossei e ridurre al minimo la dissipazione del calore verso la corteccia sottostante. Applicare la cera ossea, se necessario, per fermare le emorragie occasionali.
7. Lift il lembo osseo con una pinza # 3.
8. Rimuovere tutti, ma il livello più basso di durata con una multa pinza (# 5CO) e forbici a molla Vännäs. La dura madre non roditori mammiferi è spessa e opaca, ma può essere rimossa in strati distinti. Il sanguinamento è raro, ma può essere fermato con Gelfoam e gli eventuali residui di sangue dovrebbe essere delicatamente rimosso dallo strato residuo di durata uso di pinze e risciacquo con ACSF. Lo strato finale di dura è trasparente e vasi piali deve essere chiaramente visibile attraverso di essa. Lasciare questo strato finale di dura intatto durante l'esposizione del segnale intrinseco aumenterà il tasso di successo di caricamento di massa di indicatori di calcio fluorescenti per la successiva a due fotoni di imaging fase dell'esperimento (vedi Discussione).
9. Applicare una goccia di caldo agarosio al 2% (sciolto in ACSF) e collocare immediatamente il coprioggetti sopra la craniotomia. Controllare la craniotomia per garantire che le pulsazioni respiratorie e cardiovascolari sono minime utilizzando un microscopio da dissezione chirurgica o gli oculari di duefotone microscopio in campo chiaro modalità.

2. Intrinseca del segnale ottico Imaging

1. Aggiungere gel-schiuma imbevuta con ACSF intorno all'esterno del coprioggetto per evitare l'agarosio si secchi durante l'imaging segnale intrinseco.
2. Fissare la fotocamera intrinseca un elaboratore di immagini CCD allo standard C-mount porta sulla parte superiore del microscopio a due fotoni (Figura 1). Posizionare la sorgente di luce illuminante sul tavolo aria vicino alla fase xy (Figura 1A). Posizionare e fissare le guide di luce oltre la craniotomia e piastra di testa / camera (Figura 1B). Ritrarre il dicroico primario e lo specchio di sotto del C-mount porta in modo che la luce riflessa rossa necessaria per segnali intrinseci passerà direttamente dalla craniotomia alla telecamera CCD (Figura 1C-D). Utilizzando l'obiettivo 4x aria (0,13 NA, 17 mm WD), un 2 x 2 mm Campo di vista è disponibile per l'imaging del segnale intrinseco.
3. Inserire un filtro di calore nel light percorso per impedire la corteccia di riscaldamento. Utilizzare un filtro che lascia passare la luce verde (546 nm centro λ) e registrare l'immagine digitale di riferimento dei vasi sanguigni superficiali corticali.
4. Spostare lo stato attivo z a 500 micron sotto la superficie corticale. Utilizzare un filtro rosso (630 nm centro λ) per illuminare la corteccia per la misurazione dei segnali intrinseci. Posizionare le guide di luce in modo tale che la superficie corticale è uniformemente illuminata. Proteggere la craniotomia della luce prodotta dal display stimolo visivo. Presentare una sequenza di stimoli visivi e registrare immagini dati di riflettanza. Per generare una mappa di orientamento entro 10 min, raccogliere dati corrispondenti a quattro ripetizioni di una sequenza di 8 stimoli (4 orientamenti e due direzioni per ciascun orientamento).
5. Analizzare i dati del segnale intrinseco di generare una falsa mappa di orientamento a colori. Selezionare le regioni potenziale bersaglio per due fotoni etichettatura dei neuroni, ad esempio, l'orientamento singolarità pinwheel - punti della mappa in cuitutte le orientazioni preferenziali convergono (Figura 2A). Sovrapporre la mappa orientamento e l'immagine della vascolarizzazione superficie corticale (Figura 2B-C). Utilizzare il layout di domini funzionali e la posizione di navi di superficie di grandi dimensioni per selezionare una destinazione, evitando luoghi in cui i grandi vasi sanguigni e arteriole ^15.

3. Caricamento di massa degli indicatori di calcio fluorescenti

1. Preparare una soluzione di 20% Pluronic / DMSO aggiungendo 1 g di Pluronic in DMSO 5 microlitri. Riscaldare la miscela a 60 ° C per 10 minuti per sciogliere completamente il Pluronic. Permettere alla miscela di raffreddare a temperatura ambiente. Aggiungere 4 microlitri della Pluronic / DMSO miscela una fiala 50 mg dell'indicatore calcio fluorescente verde Oregon 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). Poi aggiungere 1 ml di un colorante rosso (Alexa 594, 2 mM soluzione stock) e 35 pl di soluzione di pipetta (vedi Materiali) per una concentrazione finale di 1 mM OGB-1 AM. Sonicare la soluzione per ½ ora inun bagno di acqua fredda, quindi si centrifuga con 0,45 micron filtro per rimuovere le impurità.
2. Tirare una pipetta lunga cono con un diametro esterno di punta 2,0-2,5 micron. Caricare 5 microlitri della miscela colorante nella pipetta.
3. Rimuovere lo strato finale di dura per facilitare l'inserimento pipetta e ottenere la più alta qualità a due fotoni immagini.
4. Determinare l'esatta posizione sulla superficie corticale che la pipetta deve essere posizionato in modo da raggiungere l'obiettivo in strato corticale 2/3. Il nostro obiettivo predeterminato corticale è una singolarità girandola nella mappa di orientamento (Figura 2). La pipetta deve essere guidato nella corteccia di un angolo di 30 ° per passare tra le pareti della camera e l'obiettivo. Così, per etichettare la regione bersaglio 200 micron sotto la superficie corticale, la posizione di ingresso pipetta sulla superficie corticale sarà di circa 350 micron laterali alla posizione di destinazione (Figura 3 AB).
5. Spostare la fase di xy (su cui l'animale e il pmicromanipolatore ipette sono posti) al centro della superficie corticale posizione di ingresso nell'ambito dell'obiettivo (Figura 3C). Utilizzare un obiettivo 20x o 40x con una distanza di lavoro (WD) di almeno 3 mm (vedi Materiali) per assicurare che la pipetta facilmente inserire la corteccia senza toccare l'obiettivo o l'osso lungo la parete della craniotomia. Una volta che la posizione di ingresso è centrata sotto l'obiettivo, sollevare la posizione Z dell'obiettivo da 2 mm (Figura 3D). Con l'epi-fluorescenza verde chiaro acceso per visualizzare il rosso Alexa colorante nella pipetta, utilizzare l'asse diagonale del micromanipolatore per spostare la pipetta fino a quando la punta è centrato (e concentrata) a titolo dell'obiettivo direttamente sopra l'ingresso della superficie corticale ( Figura 3E).
6. Abbassare la pipetta verticalmente (lungo l'asse Z) fino alla pipetta raggiunge la superficie corticale (Figura 3F), mentre continua la visualizzazione della punta della pipetta attraverso l'OCUlars del microscopio. Utilizzo in campo chiaro di illuminazione, le corticali vasi sanguigni superficiali e rimanenti membrane meningee (pia e aracnoide) sono facilmente visibili come la pipetta si avvicina alla superficie corticale. Se la pipetta non raggiunge la posizione desiderata, sollevare la pipetta e ricalibrare il targeting in base ai punti di riferimento vascolari sulla superficie corticale.
7. Rimuovere l'obiettivo, stoppino eccesso di liquido cerebrospinale dalla craniotomia e asciugare l'osso adiacente, con panno-free lance di assorbimento. Applicare una goccia di calda 3% agarosio (disciolto in ACSF) per stabilizzare la corteccia che è visibile attraverso la craniotomia (figura 3G). Nei non roditori, 3% agarosio è necessario smorzare pulsazioni per l'assorbimento efficace di coloranti fluorescenti da neuroni. Per l'imaging ottico di segnale intrinseco solo il 2% di agarosio è necessaria in quanto la combinazione di agarosio al 2% e il coprioggetto offre la stabilità necessaria. Qui, non coverglass viene utilizzato per il colorante di caricamento passo così agarosio al 3% ènecessario. Dopo l'agarosio si è solidificato, inserire un obiettivo 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) e ri-riempire la camera con ACSF.
8. Passare dal campo chiaro a due fotoni visualizzazione e individuare la punta della pipetta. Utilizzando l'asse diagonale del micromanipolatore, spostare la pipetta finché la punta raggiunge la profondità desiderata nella corteccia (figura 3H). Occasionali sbuffi di pressione di espulsione della miscela colorante (una psi pochi, ogni impulso 0,1 sec), aiuta a prevenire la punta della pipetta da intasamento. Poiché OGB-1:00 diventa visibile solo entrando cellule, il colorante rosso Alexa è critico per la visualizzazione della punta della pipetta all'interno della corteccia.
9. Prima di caricare i neuroni in strato corticale 2/3 con l'intera dose di colorante, rifocalizzare l'obiettivo sulla superficie corticale per confermare la profondità della punta della pipetta e garantire che la punta si trova nella posizione di destinazione sulla base del layout di vasi sanguigni superficiali. Se la pipetta è nel livello 2/3, piccoli sbuffi di miscela colorante dovrebbe illuminare l'spazio extracellulare e rivelano un gruppo denso di corpi cellulari circolari come ombre scure.
10. Per caricare corpi cellulari neuronali in una sfera di corteccia 300-600 micron di diametro, iniettare la miscela colorante nello spazio extracellulare usando 30-90 impulsi, ogni impulso 1,0 sec, 2-10 psi. Gli impulsi di pressione non dovrebbe essere così forte che il tessuto si muove. Dopo l'iniezione è stata completata, attendere pochi min, quindi rimuovere la pipetta e obiettivo. Attendere 1 ora per consentire il OGB-1 AM per essere prese pienamente-up dai neuroni.
11. Rimuovere l'agarosio utilizzata per il carico colorante e lavare la camera di registrazione. Mettere una piccola goccia di 2-3% agarosio in superficie e rapidamente mettere un coprioggetti sopra la craniotomia. Poiché i coloranti fluorescenti sono sensibili alla luce, evitare di sovraesporre la corteccia di campo chiaro o epi-fluorescente. Inserire un elevato NA (1.0) 20x obiettivo nel supporto obiettivo e ricentrare la regione corticale etichettata nell'ambito dell'obiettivo utilizzando la fase di xy. Proteggere la craniotomia da exfonti di luce traneous, ad esempio, la visualizzazione stimolo visivo, utilizzando strati multipli di materiale blackout.

4. Single-cell Elettroporazione di coloranti fluorescenti

1. Per studiare la morfologia dendritica, preparare una soluzione di 100 mM Alexa Fluor 594 (diluizione 1:20 in ACSF di 2 mM Alexa Fluor 594 stock). Per l'imaging funzionale di dendriti un sale OGB può essere utilizzato ^16,17.
2. Tirare una pipetta lunga cono con dimensioni ugello di 1 um e caricare 5 microlitri di colorante nella pipetta. Tutte le altre fasi di mira un dominio funzionale è identico al metodo di caricamento bulk (Figure 1-3). Per posizionare la punta della pipetta adiacente ad una membrana neuronale corpo cellulare, monitorare l'aumento dell'impedenza dell'elettrodo ed applicare pressione sbuffi di colorante ad illuminare lo spazio extracellulare e vedere corpi cellulari come ombre durante due fotoni imaging.
3. Quando la punta della pipetta è adiacente ad una membrana neuronale corpo cellulare, utilizzare l'800A Axoporator applicareImpulsi 1-3 (-8 a -10 V, 10 ms di impulso). Il riempimento immediato del neurone con colorante è facilmente visualizzato con microscopia a due fotoni. Rimuovere la pipetta e raccogliere immagini ad alta risoluzione dei dendriti e degli assoni in vivo.

Representative Results

Per illustrare la precisione dei nostri metodi di etichettatura tinture, abbiamo mirato più piccolo micro-dominio di qualsiasi mappa noto funzionale nella neocorteccia non roditore. Scarsamente punteggiato tutta la mappa di orientamento nella corteccia visiva primaria sono singolarità. Questi si verificano nei punti in cui convergono tutte le orientazioni preferenziali in modo tale che nelle mappe in falsi colori di orientamento preferenziale, le regioni intorno l'aspetto singolarità come "girandole" (Figura 2A-B). Una girandola per craniotomia è selezionato per l'etichettatura colorante (cerchio verde nella figura 2C), avendo cura di evitare di navi di grandi dimensioni e arteriole, in particolare, ^15. Con la maggior parte-caricamento di OGB-1 AM, il rilevamento delle modifiche nella fluorescenza neuronale indicatore di calcio ad una sequenza di stimoli visivi grata orientate rivela monocellulari mappe risoluzione funzionali intorno singolarità pinwheel (Figura 4). Con singola cellula elettroporazione, l'organizzazione spaziale dei dendriti e degli assoni da comeingle neurone situato in una singolarità pinwheel è determinata in vivo (Figura 5).

Figura 1. Intrinseca configurazione di imaging segnale ottico. (A) L'animale è posizionato sulla scena xy e imaging segnale intrinseco viene eseguita tramite una telecamera CCD montata sul microscopio a due fotoni. La sorgente di luce e il computer utilizzato per controllare la sessione di imaging sono portato verso la configurazione per l'imaging intrinseca ed allontanato prima due fotoni fase di imaging dell'esperimento inizia. (B) Primo piano vista dell'obiettivo 4x e 630 nm di illuminazione attraverso guide di luce liquida. Sia due guide di luce collegato a pali metallici (sinistra), o un singolo anello illuminante collegato direttamente all'obiettivo (destra) può essere utilizzato. Blackout materiale utilizzato per proteggere l'obiettivo da fonti esterne di illuminazione, ad esempio, mostra stimolo visivo, durante le sessioni di imaging ottico, non è mostrato. (C) Schema del microscopio e nel percorso ottico convenzionale a due fotoni configurazione imaging. Vedi Fig. supplementare. 20 in Shen et al. 2012 ¹⁵ per una descrizione completa dei due fotoni percorso ottico. Lo specchio retrattile è posizionato per deviare la luce dal laser attraverso la dicroico e sulla corteccia. Il dicroico primario, che passa il fascio laser e riflette la luce emessa dalla corteccia al di PMT, viene spostato nel percorso ottico ruotando la torretta filtro. (D) Per l'imaging intrinseca lo specchio è retratto e la torretta filtro è attivato per spostare il dicroico primario di mezzo, che consente un percorso diretto dalla corteccia alla telecamera CCD. Clicca qui per ingrandire la figura .

nt "fo: keep-together.within-page =" always ">

Figura 2. Utilizzo di mappe funzionali ottenuti con l'imaging segnale intrinseco per selezionare un micro-dominio per l'etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti. (A) Orientamento mappa da gatto corteccia visiva primaria acquisito tramite l'imaging ottico di segnale intrinseco. Il colore di ogni pixel è l'orientamento preferito in quella posizione. Potenziali singolarità girandola di orientamento adatti per l'etichettatura di neuroni con coloranti fluorescenti sono presenti all'interno di cerchi neri. (B) La mappa dei vasi sanguigni superficiali corticali sovrapposte con la mappa di orientamento. (C) Girandole entro cerchi rossi sono vicino a grandi vasi sanguigni o arteriole e così il sito girandola all'interno del cerchio verde viene scelto come bersaglio per l'etichettatura colorante. Il rettangolo tratteggiato corrisponde alla regione mostrata nella figura 3B. Barra di scala in (A) 500 μ m.

Figura 3. Ottimizzazione del posizionamento pipetta per caricare neuroni con coloranti fluorescenti. (A) Schema vista laterale della camera di registrazione indica che il sito di carico colorante ad essere orientati corteccia visiva (occhio di bue rosso e bianco) è ~ 200 micron al di sotto della corticale superficie. La coordinata xy del target corrisponde alla posizione di una singolarità girandola orientamento determinato dalle immagini del segnale intrinseco. La pipetta entra la corteccia con un angolo 30 °. Se la superficie corticale è parallela alla superficie del piano xy, la punta della pipetta si sposta lateralmente circa 350 micron prima di raggiungere la singolarità girandola. (B) Vista superiore della camera di registrazione mostra la vascolarizzazione corticale superficie e la posizione di immissione pipetta (stella rossa) °è a 350 micron dalla singolarità girandola. (C) La posizione xy è regolato in modo che la posizione di ingresso pipetta è centrata sotto l'20x o 40x (3,3-3,5 millimetri WD). (D) L'obiettivo è sollevata ~ 2 mm. (E) La pipetta è portato sopra la craniotomia e la sua punta è posizionata direttamente sopra la posizione di immissione sulla superficie corticale con epi-verde fluorescente. (F) La pipetta e obiettivo si abbassano contemporaneamente con illuminazione in campo chiaro fino a quando le corticali vasi sanguigni superficiali vengono messi a fuoco. (G) L'obiettivo e ACSF vengono rimossi e una goccia di agarosio al 3% è applicato sulla craniotomia. (H) a due fotoni di visualizzazione con un 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) obiettivo è usato per seguire la pipetta fino alla profondità prescelta corticale e iniettare il colorante. Dopo la conferma che i neuroni sono correttamente etichettati con colorante fluorescente, tipicamente, una maggiore NA obiettivo 20x (1,0 NA, 2,0 mm WD) viene utilizzato per raccogliere due fotoni t - z dati di serie. Schematico s mostrato in A, CH non sono in scala.

Figura 4. Corrispondenza di preferenza di orientamento nelle mappe di segnale a due fotoni e intrinseche imaging funzionale. (A) a due fotoni zona con immagini che mostra corpi cellulari marcati con OGB-1 AM in strato di corteccia visiva 2/3. (B) di preferenza Orientamento singoli corpi cellulari neuronali dallo stesso sito indicato in (A). Intorno alla singolarità girandola che è stato centrato nella regione immaginata è una mappa di orientamento organizzata stimolo preferito. (C) La mappa di orientamento ottenuto con immagini segnale intrinseco. Il quadrato nero corrisponde alla regione mostrata in (B). Questi dati sono stati ottenuti dal stesso esperimento mostrato nelle figure 2A-C e 3B. Scala in bar (AB) e 100 micron (C) 500 micron.

d/50025/50025fig5.jpg "/>
Figura 5. Nella morfologia in vivo di un singolo neurone in una singolarità girandola di orientamento. (A) I dendriti e il corpo cellulare di un singolo neurone ricoprirle con la mappa di orientamento dallo stesso sito corticale visiva. Il neurone è stato elettroporata con Alexa Fluor 594 in due fotoni di orientamento, una z-stack è stato raccolto in vivo, e processi dendritici sono stati rintracciati in linea utilizzando il software Neurolucida. La mappa di orientamento è stato ottenuto utilizzando l'imaging intrinseca del segnale prima di singola cellula elettroporazione. (B) Nella media intensità 10-micron-z-proiezione da strato corticale 1 mostra dendriti apicali. (CD) Nella media intensità 10-micron-z-proiezioni strato corticale due terzi mostrano dendriti basali e assoni. Le frecce rosse indicano le spine lungo dendriti e frecce bianche scegliere assoni individuali. Barre di scala in (AD) 100 micron.

Discussion

Vi presentiamo un metodo per indirizzare l'etichettatura dei corpi cellulari neuronali (o dendriti e degli assoni) in pre-determinati funzionali micro-domini della neocorteccia. Fusione di imaging intrinseca segnale ottico con due fotoni microscopia offre la possibilità di determinare quali sinapsi e cellule contribuiscono al micro-dominio di ogni mappa funzionale, sia correlato selettività neuronali con la posizione del neurone in una mappa funzionale, e il circuito neuronale componenti che cambiano con l'esperienza visiva ⁷ o l'applicazione di farmaci terapeutici clinicamente ^18.

Non ci sono mappe per l'orientamento stimolo, direzione, dominanza oculare, o di disparità binoculare sono stati riportati nella corteccia visiva di adulti wild-type roditori ^6,19-21. Tuttavia, la facilità di caricamento neuroni con coloranti fluorescenti e raggiungere la stabilità imaging, insieme con gli strumenti potenti genetiche disponibili per topi ha portato alla maggioranza degli studiutilizzando l'imaging a due fotoni della corteccia cerebrale in corso nei roditori invece di furetti, gatti e scimmie.

Ad alta risoluzione delle immagini a due fotoni di neuroni non roditori mammiferi può essere molto difficile a causa dei tempi lunghi interventi chirurgici, spesso ossa e la durata, e le misure supplementari necessarie per mantenere le pulsazioni mediate respiratorie e cardiovascolari del cervello al minimo ^15. Le transizioni da un intervento chirurgico a immagini segnale intrinseca e intrinseca a due fotoni di imaging devono essere efficienti, che richiedono una tempestiva preparazione di reagenti, coloranti e l'esecuzione di micro-chirurgici. Utilizzando il microscopio a due fotoni per imaging segnale intrinseco evita la necessità di molte delle attrezzature utilizzate in impianti convenzionali intrinseche di imaging segnali ottici ²² e riduce il tempo richiesto per impostare l'imaging intrinseca e alla successiva transizione a due fotoni imaging.

Il nostro approccio è specificamente progettato per fornire alta risoluzione due-phoimmagini ton in domini funzionali predeterminate. In questo modo minimizza le interferenze di segnali funzionali tra corpi cellulari neuronali, e spine dendritiche singoli e degli assoni possono essere risolti in vivo. Utilizzando una elevata apertura numerica (NA = 1,0) obiettivo e riempire l'apertura posteriore dell'obiettivo con ottica fascio di espansione (vedi Fig. complementare. 20 in Shen et al., 2012 ¹⁵⁾ sono critici per imaging ad alta risoluzione. A seconda della velocità di imaging in XY e / o Z, pulsazioni respiratorie e cardiovascolari può ridurre la risoluzione effettiva di imaging non importa quanto bene la NA e il percorso ottico della luce sono. Limitando la dimensione craniotomia nei non roditori a 2 x 2 mm, utilizzando la concentrazione relativamente alta di agarosio con il coprioggetti, ed eseguendo una sospensione pneumotorace e lombare quando necessario ^15, pulsazioni cerebrali sono limitate a 1-2 micron. Minimizzare pulsazioni indotte respiratorie e cardiovascolari della neocorteccia a 1-2 micron durante la maggior partecaricamento di indicatori calcio assicura anche che la corteccia forma una tenuta ermetica attorno alla pipetta inserito e che nessun colorante traccia lungo il gambo della pipetta alla superficie corticale. Selezione iniezione colorante e siti di imaging lontano da arterie di grandi dimensioni è essenziale anche per l'imaging di alta qualità funzionale perché relativamente veloci sensoriale-evocati iperemia (emodinamica) artefatti saranno escluse ^15.

Al sito craniotomia, lasciando lo strato finale di dura intatto durante l'imaging segnale intrinseco e tinture fluorescenti fasi di preparazione - pertanto ritirato appena prima dell'inserimento pipetta nella corteccia di colorante di caricamento - aumenta il tasso di successo e la qualità di etichettatura neuronale nel seguente modi: (1) mantiene pulita la superficie corticale e / o previene la ricrescita durale tessuto in modo che la punta della pipetta è meno probabile intasarsi e la trasparenza del tessuto viene mantenuto, (2) evita che l'agarosio utilizzata per l'imaging intrinseca del tocco cortical vasi sanguigni superficiali che possono essere danneggiati durante l'agarosio è rimosso, (3) impedisce l'agarosio utilizzata durante l'imaging intrinseca di penetrare tra la dura e sotto la corteccia cranio attorno ai bordi della craniotomia. Agarosio in queste regioni aumenterà la distanza tra il coprioggetti e la superficie corticale che rende l'inserimento della pipetta più difficile, porta alla compressione del tessuto corticale e riduce la trasparenza per l'imaging.

Durante la preparazione del PM coloranti fluorescenti per caricamento di massa, il 20% Pluronic / DMSO miscela non deve mai essere usata oltre 1 settimana da sua iniziale preparazione - Pluronic vecchia / DMSO spegne fluorescenza. Per il caricamento bulk ottimale di molti corpi cellulari adiacenti con un indicatore funzionale, ad esempio, OGB-1 AM, la miscela colorante è memorizzato su ghiaccio, caricato nella pipetta desiderata ma sempre iniettato nel cervello entro 2 ore della sua preparazione.

Durante la fase di caricamento di massal'esperimento, ripetuto 1 sec impulsi di pressione piuttosto che una iniezione continua di 1 min consente iterativa calibrazione dei parametri di espulsione, che assicura che colorante o eccessiva pressione non viene applicata. A causa del potenziale danno tissutale da inserimenti pipette multiple necessarie per etichettare regioni molto grandi di tessuto e potenziale tossicità da grandi volumi di Pluronic / DMSO da una tale serie di iniezioni molti, preferiamo uno 300-600 micron sito di iniezione colorante per 2 x 2 craniotomia mm. Rispetto ai ciechi ¹⁴ iniezioni, a due fotoni navigazione visivamente guidato attorno ai vasi sanguigni, uso di contrasto negativo di corpi cellulari neuronali per determinare la posizione e sagoma lamina, la diffusione del colorante sulla pressione di espulsione come indice del volume di cellule che saranno etichettato con OGB-1 AM, migliora la qualità di colorante di caricamento in preparazioni non roditori.

Il protocollo che descriviamo qui porta alla etichettatura successo di neuroni con coloranti fluorescenti a targeted micro-domini in ogni animale ha tentato. Per il carico sfuso con OGB-1 AM, abbiamo costantemente ottenere risposte evocate visualmente in 75-100% dei neuroni simultaneamente impressi ^9,15 e la tecnica è sensibile al rilevamento di potenziali di azione in vivo singoli ^23,24.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Life support/experiment prep
Isoflurane	Webster Vet	NDC 57319-474-05
Isoflurane vaporizer	Midmark	VIP 3000
Feedback regulated heating blanket	Harvard Apparatus	50-7079F
ECG monitor	Digicare Biomedical	LifeWindow Lite
EEG amplifier	A-M Systems	1800
EEG display monitor	Hewlett Packard	78304A
End tidal CO2 monitor	Respironics	Novametrix Capnoguard 1265	Optimize ventilation
Carbide drill burrs for drilling bone	Henry Schein	fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip)
Cement for headplate/chamber	Dentsply	675571, 675572
Black Powder Tempera Paint	Sargent Art Inc.	22-7185	Add to cement to improve light shielding and reduce reflections
Agarose - Type III-A	Sigma	A9793	For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging
Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness	World Precision Instruments	502040, 502041	For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed
Brudon curettes	George Tiemann	105-715-0, 105-715-3	Cleaning skull surface
Bone wax	Ethicon	W31G	Quickly stop bleeding
Cotton Tipped Applicator	Electron Microscopy Sciences	72308-05	Clean and dry bone surface
Dumont #5CO Forceps	Fine Science Tools	11295-20	Grab individual layers of dura or pia
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03	Cut dura
Gelfoam	Pfizer	09-0396-05	To stop bleeding on the dura
Absorption spears	Fine Science Tools	18105-01	Ultra-fast and lint-free wicking of CSF
Blackout material	Thorlabs	BK5	Shield craniotomy
2. Dye preparation / injection
Dimethyl Sulphoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Pluronic	Sigma	P2443
Oregon Green 488 Bapta-1 AM	Invitrogen	O6807	Calcium indicator
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A10438
Centrifugal filter (0.45 μm pore size)	Millipore	UFC30HV00	To remove impurities before injection
Glass pipette puller	Sutter Instruments	P97
Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter)	World Precision Instruments	1B150F-4	Dye ejection pipette
Microloader	Eppendorf	5242 956 003	For loading dye into pipette
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285	To position pipette
Pressure pulse controller	Parker Hannifin	PicoSpritzer III	For pressure injection of the dye
Single-cell electroporator	Molecular Devices	Axoporator 800A	For electroporation of the dye
3. Intrinsic imaging
4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD)	Olympus	UPLFLN4X
Intrinsic hardware / software	Optical Imaging Inc.	Imager 3001 / VDAQ	VDAQ software is used for episodic imaging
CCD Camera	Adimec	Adimec-1000
Light source power supply	KEPCO	ATE 15-15M
Light source	Optical Imaging Inc.	HAL 100	Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW
Green filter (for vascular image)	Optical Imaging Inc.	λ = 546 nm (bandpass 30 nm)	For reference image of surface vasculature
Red filter (for intrinsic signal)	Optical Imaging Inc.	λ = 630 nm (bandpass 30 nm)	To collect intrinsic signals
Heat filter	Optical Imaging Inc.	KG-1
4. Two-photon rig/imaging
Two-photon microscope and software	Prairie Technologies		See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai XF
20x (0.5 NA; 3.5 mm WD)	Olympus	UMPLFLN20X	0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging)
20x (1.0 NA; 2.0 mm WD)	Olympus	XLUMPLFLN20X
40x (0.8 NA; 3.3 mm WD)	Olympus	LUMPLFLN40X/IR
Air table	Newport	ST-200	Isolates preparation from external vibrations
xy stage	Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA)		Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage
Recipes Artificial Cerebro-Spinal Fluid NaCl (135 mM), KCl (5.4 mM), MgCl2 (1.0 mM), CaCl2 (1.8 mM), HEPES (5 mM), pH 7.4 Pipette Solution14 NaCl (150 mM), KCl (2.5 mM), HEPES (10 mM), pH 7.4