Summary
방법은 네크로의 미리 결정된 기능 마이크로 도메인에 형광 염료와 뉴런을 라벨에 설명되어 있습니다. 첫째, 고유 신호 광학 이미징은 기능지도를 얻을하는 데 사용됩니다. 그런 다음 두 광자 현미경은지도의 마이크로 도메인 내에서 라벨 및 이미지 뉴런하는 데 사용됩니다.
Abstract
비 쥐 포유류의 주요 시각 피질에서 뉴런은 같은 방향 1-4, 방향 5-7, 안구 지배력 8,9와 쌍안경 격차 구 등의 자극 기능에 대한 자신의 선호에 따라 클러스터됩니다. 오리엔테이션 선택성이 가장 널리 연구 기능 및 원하는 방향의 준주기적인 레이아웃과 지속적인지도 전체 기본 시각 피질 10,11에 걸쳐 존재합니다. 이 기능지도에 자극 선택적 응답을 초래할, 신경 세포 및 네트워크 기여를 통합하면 mm 공간적 스케일로 하위 미크론에 걸쳐 이미징 기술의 하이브리드가 필요합니다. 기존의 고유 신호를 광 이미징을 통해 시각 피질의 전체 표면에 걸쳐 기능지도의 전체적인 레이아웃은 12 결정될 수있다. 칼슘 민감한 염료를 사용하여 생체 내 두 광자 현미경의 개발은 synapt을 결정하는 하나를 수IC의 입력은 개별 neuronal 세포 기관 6,14 수백에서 동시에 각각의 수지상의 쪽에서 13 또는 기록 활동을 도착. 따라서, 두 광자 현미경의 하위 마이크론 공간 해상도로 고유 신호 영상을 결합하는 것은 수지상 세그먼트 및 세포 네크로의 모든 기능지도의 마이크로 도메인에 기여하는 정확히 결정의 가능성을 제공합니다. 여기 빠르게 대뇌 피질의 방향지도를 취득하고 비 쥐 포유류에 형광 염료와 뉴런을 라벨이 기능지도의 특정 마이크로 도메인을 타겟팅 할 수있는 높은 수율 방법을 보여줍니다. 두 광자 이미징에 사용 된 것과 같은 현미경으로, 우리는 먼저 고유 신호 광학 이미징을 사용하여 오리엔테이션지도를 생성합니다. 그럼 우리가 어느 라벨을 염료로로드 micropipette를 사용하여 관심있는 마이크로 도메인을 타겟팅하는 방법을 보여 neuronal 세포 기관 또는 라벨 수석, 쪽과 axons은에서 볼 수있는 그러한 하나의 뉴런을의 인구생체. 앞의 방법을 넘어 개선이 neocortical 기능 아키텍처의 프레임 워크의 하위 세포 해상도 neuronal 구조 - 기능 관계의 시험을 용이하게합니다.
Protocol
1. 외과 준비
- 마취를 유도하고 지속적으로 심장 박동을 모니터링 갯벌 CO 2, EEG, 온도를 모두 종료합니다. 모든 절차는 사우스 캐롤라이나의 의과 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 우리는 이전에 9,15을 발표 이들에 기초했다.
- 메스 블레이드로 피부를 절단하여 두개골의 등 표면을 쉽게받을 수 있습니다. Brudon의 퀴렛를 사용하여 뼈를 놓인 결합 조직을 해부. 면 스쳐 applicators과면 거즈를 사용하여 뼈를 청소합니다. 작은 사자의 정맥을 통해 가끔씩 출혈을 멈추게하기 위해 두개골에 뼈 왁스 (필요에 따라) 적용됩니다.
- 검은 색 페인트 (자료 참조)과 혼합 치과 시멘트를 사용하여 두개골 (craniotomy을 수행 할 것입니다 관심 지역 이상)에 티타늄 스테인레스 스틸 헤드 판을 연결합니다. 머리 판의 중앙에 사각형 오픈 craniotomy에 대한 액세스 및 광학 이미징을 제공합니다. 머리 판 위에 금속 챔버를 연결합니다. 이 챔버는 물 침적 목적 렌즈와 이미징을위한 유체 저수지 역할을합니다.
- 금속 게시물을 사용하여 XY 스테이지에 헤드 판을 고정합니다.
- 치과 드릴을 사용하여 headplate의 사각형 오픈에서 뼈의 넓은 지역을 희석. 얇게 할 영역은 잘 계획 craniotomy의 경계를 넘어 확장해야합니다. craniotomy 사이트에서, 뼈의 두께가 coverglass과 neocortical 표면 사이의 아가로 오스의 두께를 지시하기 때문에 고해상도 이미지가 네크로에서 획득 할 경우 비 쥐 포유류의 두꺼운 두개골은 (아래 참조) 얇게해야합니다 .
- craniotomy의 뼈에서 2 X 2mm 광장 윤곽을 뚫는다. 뼈 조각을 제거하고 기본 피질에 열 손실을 최소화하기 위해 새로운 인공 뇌척수 (ACSF)에 정기적으로 실을 씻어. 필요에 따라 가끔씩 출혈을 멈추게하기 위해 뼈 왁스를 적용합니다.
- 난생t # 3 포셉과 뼈 플랩.
- 제외한 모든 좋은 포셉 (# 5CO)와 Vannas 스프링 가위를 사용하여 경질의 맨 아래 레이어를 제거합니다. 비 쥐 포유류의 경질은 두껍고 불투명하지만 서로 다른 층으로 제거 할 수 있습니다. 출혈은 드문이지만, Gelfoam으로 중단 할 수 있고 어떤 혈흔이 부드럽게 경질는 포셉을 사용하고 ACSF와 린스의 나머지 계층에서 제거해야합니다. 경질의 마지막 층은 투명하고 pial 선박은 확실하게 표시됩니다. 고유 신호 이미징 동안 경질의 최종 레이어를 그대로두면 (토론 참조) 실험 이후 두 광자 이미징 단계에 형광 칼슘 지표 대량로드의 성공 속도를 증가 할 것이다.
- 따뜻한 2% 아가로 오스 (ACSF에 용해)의 드롭을 적용하고 즉시 craniotomy을 통해 coverglass를 놓습니다. 호흡기 및 심장 혈관 pulsations은 수술 해부 현미경이나의 oculars 사용하여 최소한 있는지 확인하기 위해 craniotomy을 확인 두 -밝은 분야 모드에서 광자 현미경.
2. 고유 신호 광학 이미징
- 고유 신호 이미징 동안 건조에서 아가로 오스를 방지하기 위해 coverglass의 바깥 주위에 ACSF로 적셔 젤 거품을 추가합니다.
- 두 광자 현미경 (그림 1) 위의 표준 C-마운트 포트에 고유 신호 이미징 CCD 카메라를 연결합니다. XY 스테이지 (그림 1A) 근처의 공기 테이블에 조명 광원을 배치합니다. 위치 및 craniotomy 및 headplate / 챔버 (그림 1B)를 통해 빛 가이드를 확보. 고유 신호에 필요한 반사 붉은 빛이 CCD 카메라 (그림 1C-D)에 craniotomy에서 직접 통과 할 수 있도록 기본 이색 성 및 C-마운트 포트 아래에있는 거울을 취소. 4 배 공기 목적 (0.13 NA, 17mm WD),보기의 2 X 2mm 필드를 사용하면 고유 신호 이미징 사용할 수 있습니다.
- 리터에 열 필터를 삽입난방에서 피질을 방지하기 위해 항공 경로를 설정합니다. 녹색 빛 (546 nm의 중심 λ)와 대뇌 피질의 표면 혈관의 디지털 참조 이미지를 기록을 통과 필터를 사용합니다.
- 대뇌 피질의 표면 아래 500 μm로 Z 포커스를 이동합니다. 고유 신호를 측정하는 피질을 밝히는 빨간색 필터 (630 nm의 중심 λ)를 사용합니다. 대뇌 피질의 표면이 균일하게 조명되는 등의 빛 가이드를 배치합니다. 시각적 자극 디스플레이에 의해 발생 된 빛에서 craniotomy을 보호. 시각적 자극과 기록 반사율 데이터 이미지의 순서를 제시한다. 10 분 내에 오리엔테이션지도를 생성하려면, 8 자극 (각 방향 4 방향 및 두 방향)의 순서 4 반복에 해당하는 데이터를 수집합니다.
- 거짓 컬러 방향지도를 생성하는 고유 신호 데이터를 분석합니다. 뉴런의 두 광자 라벨, 예를 들어, 오리엔테이션 바람개비의 이론에 대한 잠재적 타겟 지역 선택 -지도에서 지점 위치모든 기본 방향은 (그림 2A) 수렴. 오리엔테이션지도와 대뇌 피질의 표면 vasculature (그림 2B-C)의 이미지를 입혀 라. 대형 혈관과 arterioles 15 위치를 피하고 대상을 선택 기능 도메인 및 대형 표면 선박의 위치의 레이아웃을 사용합니다.
3. 형광등 칼슘 지표의 대량로드
- 5 μl DMSO에 1g의 Pluronic을 추가하여 20 % Pluronic / DMSO의 솔루션을 준비합니다. 완전히 Pluronic를 해산하기 위해 10 분 동안 60 ° C에서 혼합물을 가열. 혼합물이 실내 온도에 냉각 할 수 있습니다. 형광 칼슘 표시기 오레곤 그린 488 Bapta-1시 (AM OGB-1)의 50 μg의 유리 병에 Pluronic / DMSO 혼합물의 4 μl를 추가합니다. 그런 다음 빨간색 염료 (알렉사 형석 594, 2 MM 주식 솔루션) 1 μl와 OGB - 새벽 1 시까 지 1 ㎜의 최종 농도에 대한 피펫 솔루션의 35 μl를 (자료 참조) 추가 할 수 있습니다. 에 ½ 시간에 대한 솔루션을 Sonicate차가운 물 목욕 후 불순물을 제거 할 필터 0.45 μm와 원심 분리기.
- 2.0-2.5 μm의 외부 팁 직경 긴 테이퍼 피펫을 당겨. 피펫으로 염료 혼합물의 5 μl를로드합니다.
- 피펫 삽입을 용이하게하고 최고 품질의 두 광자 이미지를 얻을 경질의 마지막 층을 제거합니다.
- 피펫은 대뇌 피질의 레이어 3분의 2 년에 목표에 도달하기 위해 배치해야하는 대뇌 피질의 표면에 정확한 위치를 결정합니다. 우리 미리 대뇌 피질의 목표는 방향지도 (그림 2)에 바람개비 특이점입니다. 피펫은 챔버 벽과 목적 사이를 통과하기 위해 30 ° 각도로 피질로 구동해야합니다. 따라서, 200 μm 대뇌 피질의 표면 아래에 대상 지역을 라벨, 대뇌 피질의 표면에 피펫 항목 위치가 대상 위치 (그림 3 AB)에 측면 약 350 μm 될 것입니다.
- (XY 스테이지를 이동하는 동물과 Pipette의 micromanipulator은 센터 목적 (그림 3C)에서 대뇌 피질의 표면 입력 위치에) 배치됩니다. 피펫 쉽게 craniotomy의 벽을 따라 목적이나 뼈를 건드리지 않고도 피질을 입력 될 수 있도록 최소 3 ㎜ (자료 참조) 작동 거리 (WD)으로 20x 또는 40x 목표를 사용합니다. 항목의 위치는 목표 아래 중앙되면, 2mm (그림 3D)에 의해 목표의 Z 위치를 올립니다. 녹색 에피 형광 빛이 피펫에 빨간색 알렉사 염료를 시각화에 대한 설정으로, (그 팁을 중심으로 될 때까지 직접 대뇌 피질의 표면 항목 위치 위의 목적에 따라 (그리고 집중) 피펫을 이동 micromanipulator의 대각선 축를 사용하여 그림 3E).
- 지속적으로 ocu을 통해 피펫 팁을 보면서 피펫은 대뇌 피질의 표면 (그림 3 층)에 도달 할 때까지 피펫 수직을 (Z 축을 따라) 낮 춥니 다현미경의 라스 요. 밝은 분야 조명을 사용하여 대뇌 피질의 표면 혈관과 남아있는 수막 멤브레인 (피아와 거미집 모양의)는 피펫은 대뇌 피질의 표면을 접근으로 쉽게 볼 수 있습니다. 피펫가 원하는 항목 위치에 도달하지 않는 경우, 피펫을 마련하고 대뇌 피질의 표면에 혈관 랜드 마크를 기반으로 타겟팅을 재조정.
- 목표를 제거 craniotomy에서 초과 중추 신경계를 등심과 보푸라기가없는 흡수 창을 사용하여 인접한 뼈를 건조. craniotomy (그림 3G)를 통해 볼 수 있습니다 피질을 안정하는 따뜻한 3퍼센트 아가로 오스 (ACSF에 용해)의 방울을 적용합니다. 비 설치류에서 3% 아가로 오스는 뉴런의 형광 염료의 성공적인 이해에 pulsations을 저해 할 필요가 있습니다. 2퍼센트 아가로 오스와 coverglass의 조합에 필요한 안정성을 제공하기 때문에 고유 신호를 광 이미징의 경우 불과 2 %의 아가로 오스가 필요합니다. 여기 더 coverglass는 3% 아가로 오스 그래서 염료로드 단계를위한 것입니다 사용되지 않습니다필요. 아가로 오스가 확정 된 후 ACSF과 챔버를 40x 목표를 삽입 (0.8 NA, 3.3 mm WD)하고 다시 작성하십시오.
- 밝은 분야의 두 광자보기로 전환하여 피펫 팁을 찾습니다. 그 끝이 피질 (그림 3H)에서 원하는 깊이를 도달 할 때까지 micromanipulator의 대각선 축를 사용하여 피펫 이동합니다. 염료 혼합물 (몇 PSI, 각 펄스 0.1 초)의 수시 압력 분출 퍼프는 막힘에서 피펫 팁을 방지하는 데 도움이됩니다. OGB-1은 세포를 입력시 표시됩니다 AM 때문에, 붉은 알렉사 염료는 피질 내부의 피펫 팁의 시각화를 위해 중요합니다.
- 피펫 팁의 깊이를 확인하는 대뇌 피질의 표면에 재 집중, 염료의 전체 용량과 목표를 대뇌 피질의 층 3분의 2의 뉴런을로드하고 끝이의 레이아웃에 따라 대상 위치에 있는지 확인하기 전에 표면 혈관. 피펫은 레이어 3분의 2 인 경우, 염료 혼합물의 작은 퍼프가를 조명한다세포 공간과 어두운 그림자처럼 원형 세포 기관의 조밀 한 조립을 알 수있다.
- 대뇌 피질 300-600 μm 직경의 영역에 neuronal 세포의 시체를로드를 들어, 30-90 펄스, 각 펄스 1.0 초, 2-10 PSI를 사용하여 세포 공간으로 염료 혼합물을 주입. 압력 펄스는 조직 움직이 너무 강한 안됩니다. 주입이 완료되면, 몇 분 기다린 다음 피펫과 목표를 제거합니다. OGB-1 뉴런에 의해 완벽하게 촬영 업 할 수 있도록 오전 1 시간 기다립니다.
- 염료로드에 사용 된 아가로 오스를 제거하고 녹음 챔버를 씻어. 표면에 2~3% 아가로 오스의 작은 방울을 넣고 빠르게 craniotomy을 통해 coverglass를 놓습니다. 형광 염료가 빛에 민감한 때문에, 밝은 필드 또는 에피 형광등에 피질이 과잉 노출하지 마십시오. XY 단계를 사용하여 목적에 따라 목적 홀더 및 재 중심이라는 대뇌 피질의 영역으로 높은 NA (1.0) 20x 목표를 넣습니다. 예에서 craniotomy을 보호traneous 광원, 예를 들어, 시각 자극 디스플레이, 정전 소재의 여러 레이어를 사용합니다.
4. 형광 염료의 단일 셀 Electroporation
- 수지상 형태를 연구의 경우, 100 μM 알렉사 형석 594 (2 MM 알렉사 형석 594 주식 ACSF에 1시 20분 희석)의 솔루션을 준비합니다. 수석의 기능 이미징을위한 OGB 소금은 16,17을 사용할 수 있습니다.
- 1 μm의 끝 크기가 긴 테이퍼 피펫을 뽑아 피펫으로 염료의 5 μl를로드합니다. 기능 도메인을 타겟팅하는 다른 모든 단계를 대량로드 방법 (그림 1-3)과 동일합니다. neuronal 전지 본체 막에 인접한 피펫 팁을 위치, 전극 임피던스의 증가를 모니터링하고 세포 공간을 조명하고 두 광자 이미징 동안 그림자처럼 세포의 시체를 볼 수있는 염료의 압력 퍼프를 적용 할 수 있습니다.
- 피펫 팁은 neuronal 전지 본체 막에 인접한 경우, 적용 할 Axoporator 800A를 사용1-3 펄스 (-8에 -10 V, 10 밀리 초 펄스). 염색과 신경의 즉각적인 충전이 두 광자 현미경으로 쉽게 시각화입니다. 피펫를 제거하고 생체의 수석과 axons의 고해상도 이미지를 수집합니다.
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Representative Results
우리 염료 라벨 방법의 정밀도를 설명하기 위해, 우리는 비 쥐 네크로에 알려진 기능지도의 가장 작은 마이크로 도메인을 대상으로. 띄엄 띄엄 이론은 기본 영상 피질의 방향지도를 통해 끝까지. 이들은 모두 원하는 방향 이러한 수렴 지점에서 발생하는 선호하는 취향, "풍차"(그림 2A-B)와 같은 특이한 모양 주변 지역의 위색지도 인치 craniotomy 당 하나의 바람개비는 특히 15 대형 선박과 arterioles을 방지해야하는 것 염료 라벨 (그림 2C에 녹색 동그라미)으로 선택됩니다. OGB-1스러워 대량로드로 방향 격자 시각적 자극의 순서로 neuronal 칼슘 표시기 형광의 추적 변화는 바람개비 이론과 주변의 단일 셀 해상도 기능지도를 (그림 4) 공개한다. 단일 셀 electroporation로, 수석과 axons의 공간 조직에서바람개비의 특이점에있는 화롯불 신경 세포는 생체 (그림 5)에서 결정된다.
1 그림. 고유 신호 광학 이미징 설치. (A) 동물 XY 스테이지 및 고유 신호 이미징에 위치는 두 광자 현미경에 장착 된 CCD 카메라를 통해 수행됩니다. 이미지 세션을 제어하는 데 사용 광원과 컴퓨터는 고유 이미지에 대한 설정으로 가져 와서 실험이 시작의 두 광자 이미징 단계 이전까지는 이동합니다. (B) 4X 목적 및 액체 빛이 가이드를 통해 630 nm의 조명의 전망을 닫습니다. 두 가지 가벼운 가이드는 금속 게시물 (왼쪽)에 부착하거나 직접 목적 (오른쪽)에 부착 한 조명 링을 사용할 수 있습니다. 정전 소재에 사용 조명의 외부 소스에서 목표를 보호, 예를 들어, 광학 이미징 세션 동안 시각적 인 자극 디스플레이, 표시되지 않습니다. 종래의 두 광자 이미징 구성에서 현미경과 빛 경로 (C) 도식. 보충 그림을 참조하십시오. 셴 외 20. 2,012 15 전체 두 광자 빛 경로에 대한 설명. 연중 이용 가능한 접이식 미러는 이색 통해 피질로 레이저의 빛을 편향에 위치하고 있습니다. 레이저 빔을 전달하고 PMT의에 피질에서 나오는 빛을 반영하는 기본 이색은, 필터 터렛을 돌려 빛을 경로로 이동합니다. (D) 고유 영상은 거울이 후퇴되고 필터 터렛은 CCD 카메라에 피질에서 직접 빛 경로를 허용하는 방식의 기본 이색를 이동 설정되어 있습니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 형광 염료와 뉴런의 라벨을위한 마이크로 도메인을 선택하고 고유 신호 영상을 획득 기능지도를 사용합니다. 고양이 차 시각 피질에서 (A) 오리엔테이션지도는 고유 신호를 광 이미징을 통해 인수했다. 각 픽셀의 색상이 해당 위치에서 원하는 방향을 나타냅니다. 형광 염료와 뉴런을 라벨에 적합한 잠재적 인 방향 바람개비의 이론은 검은 색 원 안에 표시됩니다. (B) 대뇌 피질의 표면 혈관의지도 방향지도 입혔다. (C) 빨간색 동그라미 안의 풍차는 큰 혈관이나 arterioles 근처 등 녹색 동그라미 안에 바람개비 사이트는 염료 라벨의 대상으로 선정된다. 점선 사각형은 그림 3B에 표시된 지역에 해당합니다. & (A) 500 스케일 바무, m.
그림 3. 형광 염료와 뉴런을로드하는 동안 피펫 배치를 최적화. 기록 챔버의 (A) 도식 측면보기는 염료로드 사이트가 시각 피질 (빨간색과 흰색 황소의 눈)에서 타겟이 될 것을 보여줍니다 것이 ~ 200 μm 대뇌 피질 아래입니다 표면. 대상의 XY 좌표는 고유 신호 이미징에서 결정된 오리엔테이션 바람개비의 특이점의 위치에 해당합니다. 피펫은 30 ° 각도로 피질을 입력합니다. 대뇌 피질의 표면이 XY 단계 표면에 평행 인 경우, 피펫 팁은 바람개비 특이점에 도달하기 전에 옆으로 약 350 μm 이동합니다. (B) 녹음 챔버의 상단보기는 대뇌 피질의 표면 vasculature 및 피펫 항목 위치 (붉은 별) 일을 보여줍니다에 바람개비 특이점에서 350 μm입니다. (C) XY 스테이지의 위치는 피펫 입력 위치는 20x 또는 40x 목적 (3.3-3.5 mm WD)에서 중심되는 등 조정됩니다. (D)의 목표는 ~ 2mm 증가합니다. (E) 피펫은 craniotomy를 통해 배달됩니다 및 팁 바로 녹색 에피 형광등을 사용하여 대뇌 피질의 표면에 항목 위치 위에 위치합니다. 대뇌 피질의 표면 혈관이 초점으로 올 때까지 (F) 피펫과 목적은 밝은 분야 조명을 사용하는 동시에 인하됩니다. (G) 객관적이고 ACSF을 제거하고 3% 아가로 오스의 드롭은 craniotomy으로 적용됩니다. 40x (0.8 NA, 3.3 mm WD) 목적으로 (H) 2 - 광자 시각화가 선택한 대뇌 피질의 깊이에 피펫을 따라 염료를 주입하는 데 사용됩니다. 및 z 시리즈 데이터 - 뉴런이 성공적으로 20x 목표 (1.0 NA, 2.0 mm WD) NA 일반적으로 더 높은 형광 염료와 함께 표시됩니다 확인한 후 두 광자 t를 수집하는 데 사용됩니다. 개략도 s이 (가)에 도시 된 바와 같이, CH는 규모에 그려되지 않습니다.
4 그림. (A) OGB-1로 표시된 셀의 시체를 보여주는 두 - 광자 이미징 영역은 시각 피질 층 3분의 2에서 두 광자와 고유 신호 이미징 기능지도의 방향 환경 설정의 통신.입니다. (B) 같은 사이트에서 개인 neuronal 세포 기관의 오리엔테이션 환경 설정 (A)에 표시. 이미징 지역 중심으로 한 바람개비 특이점 주변 선호하는 자극 방향의 조직지도입니다. (C) 방향지도는 고유 신호 영상을 획득하였습니다. 검은 색 사각형은 (B)에 표시된 지역에 해당합니다. 이러한 데이터는 그림 2A-C와 3B에 표시된 동일한 실험에서 얻은되었습니다. (AB) 100 μm와 (C) 500 μm의 스케일 바.
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그림 5. 오리엔테이션 바람개비의 특이점에서 단일 신경 세포의 생체 형태합니다. (A) 단일 신경 세포의 수석 및 전지 본체가 동일한 시각 피질 사이트에서 오리엔테이션지도 입혔다. 뉴런은 두 광자지도 아래 알렉사 형석 594으로 electroporated되었습니다 Z-스택은 생체에서 수집되었으며, 수지상 프로세스는 Neurolucida 소프트웨어를 사용하여 오프라인으로 추적했다. 방향지도는 단일 셀 electroporation하기 전에 고유 신호 이미징을 사용하여 얻은 것입니다. (B) 대뇌 피질의 레이어 1에서 평균 강도를 10 μm-Z-투영 꼭대기 수석을 보여줍니다. (CD) 평균 농도 10 μm-Z-투영 대뇌 피질 층 삼분의이 쇼를 기초 수석과 axons에서. 빨간색 화살표는 개별 axons을 가리킨 수석과 흰색 화살표를 따라 쪽을 보여줍니다. (AD) 100 μm의 크기 바.
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Discussion
우리는 네크로의 미리 정해진 기능 마이크로 도메인에 neuronal 세포 기관 (또는 수석과 axons)의 라벨을 타겟팅하는 방법을 제시한다. 두 광자 현미경과 고유 신호 광학 이미징을 병합하는 시냅스와 세포가 어떤 기능지도의 마이크로 도메인에 기여하는 결정의 가능성을 제공 여부 기능지도에서 뉴런의 위치, 그리고 neuronal 회로와 neuronal 선택성의 상호 구성 요소를 시각적 경험 7 임상 치료 약물 (18)의 응용 프로그램과 그 변화.
자극 방향, 방향, 안구 지배력, 또는 쌍안경 차이에 대한지도는 성인 야생 형 설치류 6,19-21의 시각적 피질에보고되지 않았습니다. 그러나, 형광 염료와 뉴런를로드하고 마우스에 사용할 수있는 강력한 유전자 도구와 함께 이미지 안정성을 달성의 용이성이 연구의 대부분이 발생하고 있습니다설치류 대신 ferrets, 고양이, 그리고 원숭이에서 수행되는 대뇌 피질의 2 광자 이미징을 사용합니다.
비 쥐 포유류의 뉴런의 높은 해상도 두 광자 이미징 때문에 긴 수술 시간, 두꺼운 뼈와 경질하고, 최소 15 뇌 호흡, 심장 혈관 중재 pulsations을 유지하는 데 필요한 추가 단계로 매우 도전이 될 수 있습니다. 수술의 고유 신호 이미징과 두 광자 이미징에 고유로 전환은 시약, 염료 및 마이크로 수술 절차의 실행 적시에 준비를 필요로 효율적해야합니다. 고유 신호 이미징을위한 두 광자 현미경을 사용하면 기존의 고유 신호를 광 이미징 rigs 22 사용하고 이후 두 광자 이미징에 고유 이미징 및 전환을 설정하는 데 필요한 시간을 줄여 장비의 많은에 대한 필요성을받지 않으려면.
우리의 접근은 특히 고해상도의 두 검사하고 사진을 제공하도록 설계되었습니다미리 정해진 기능 도메인의 톤 이미징. 이 최소한의 크로스 neuronal 세포 기관, 개인 수지상의 쪽과 axons 사이의 기능적 신호의 이야기 생체에서 해결 될 수 있습니다. 높은 수치 개구 (NA = 1.0) 목표를 사용하고 빔 확장 광학 (보충 그림을 참조하십시오. 셴 외.에 20, 2012 15)와 목적의 뒷면 조리개를 작성하는 고해상도 영상을위한 중요합니다. XY 및 / 또는 Z에서 이미지의 속도에 따라 호흡기 및 심장 혈관 pulsations은 NA 및 광학 빛의 경로가 얼마나 좋은 상관없이 효과적인 이미지 해상도를 줄일 수 없습니다. , 2 X 2mm로 비 설치류에서 craniotomy의 크기를 제한 coverglass와 아가로 오스의 비교적 높은 농도를 사용하여 필요한 15 뇌 pulsations은 1-2 μm로 제한하는 경우 pneumothorax와 허리 정지를 수행하여. 대량 중 1-2 μm로 네크로의 호흡기 및 심장 혈관 유도 pulsations를 최소화칼슘 지표를로드하면 피질이 삽입 된 피펫 주위에 방수 밀봉을 형성하고 더 염료는 대뇌 피질의 표면에 피펫의 칼을 따라 위로 추적하지 않는다는 것을 보장합니다. 비교적 빠르고 감각 - evoked 충혈 (hemodynamic) 유물이 15를 제외되기 때문에 거리에 큰 arterioles에서 염료 주입 및 이미징 사이트를 선택하면 고품질의 기능성 이미징을위한 중요합니다.
craniotomy 사이트에서, 고유 신호 이미징 및 형광 염료 준비 단계에 걸쳐 그대로 경질의 마지막 층을 떠난 - 따라서 단지 염료를로드하기위한 피질에 피펫 삽입 전에 제거 - 다음에 neuronal 라벨의 성공 속도와 품질을 향상 방법 : (1) 피펫 팁이 가득하게 될 확률이 낮아 있으며, 조직의 투명성이 유지 될 수 있도록 경질 막 조직 regrowth을 청소 대뇌 피질의 표면을 유지 및 / 또는 방지하고, (2) 아가로 오스는 고유 이미징 터치에 사용하지 방지 cort아가로 오스를 제거하면 손상된 질 수 있습니다 ICAL 표면 혈관, (3) craniotomy의 가장자리 주변의 두개골 아래 경질, 피질 사이의 입력에서 고유 이미징 동안 사용 된 아가로 오스를 방지 할 수 있습니다. 아가로 오스는이 지역에서 대뇌 피질의 조직의 압축에 이르게 및 이미징에 대한 투명성을 감소, coverglass 더 어려운 피펫의 삽입을 만드는 대뇌 피질의 표면 사이의 거리를 증가시킬 것이다.
대량로드하기위한 형광 염료 AM 준비 할 때, 20 % Pluronic / DMSO 혼합물은 초기 준비에서 일주 이상 사용해서는 안됩니다 - 이전 Pluronic / DMSO는 형광 quenches. 기능 지표, 예를 들어, OGB - 오전 1시 많은 인접 셀 기관의 최적의 대량로드를 들어, 염료 혼합물은, 얼음에 저장되어 필요에 따라 피펫에로드하지만 항상 그것의 준비 2 시간 내에 뇌에 주입.
대량로드 단계 동안실험이 아니라 1 분의 연속 주입보다 압력의 1 초 펄스를 반복 과도한 염색이나 압력이 적용되지 않는 보장 분출 매개 변수의 보정을 반복 할 수 있습니다. 때문에 많은 주사 이러한 일련의 Pluronic / DMSO의 큰 볼륨에서 조직 및 잠재적 인 독성의 매우 큰 영역을 레이블에 필요한 여러 피펫의 삽입에서 잠재적 인 조직 손상, 우리는 2 곱하기 2는 당 300-600 μm 염료 주입 사이트를 선호 mm craniotomy. 맹인 주사 14, 혈관, 얇은 판의 위치를 결정하는 neuronal 세포 기관의 부정적인 대비 사용, 수 세포의 볼륨의 인덱스로 압력 분사시 염료의 확산를 측정 약 두 광자 시각적으로 안내 탐색에 비해 OGB - 오전 1시 라벨이 아닌 쥐 준비에 염료로드의 질이 향상됩니다.
우리가 여기서 설명하는 프로토콜은 타르에 형광 염료와 뉴런의 성공적인 라벨로 연결모든 동물의 geted 마이크로 도메인 시도했습니다. AM OGB-1과 대량로드를 들어, 우리는 지속적으로 동시에 이미징 뉴런 9,15의 75~100%에 시각 evoked 응답을 획득하고 기술은 생체 23,24의 단일 행동 전위의 검출에 민감합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
그림 5A에 표시된 수석을 추적하는 그레이스 디온;이 작품은 또한, 우리는 수술 절차에 도움을 마 Petrella 감사 국립 안과 연구소 R01EY017925과 R21EY020985과 데이 & 화이트 홀 재단에서 PK까지 자금의 보조금에 의해 지원되었으며, Pratik Chhatbar에 대한 원고에 대한 의견.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||
| 1. Life support/experiment prep | |||||||||
| Isoflurane | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | |||||||
| Isoflurane vaporizer | Midmark | VIP 3000 | |||||||
| Feedback regulated heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7079F | |||||||
| ECG monitor | Digicare Biomedical | LifeWindow Lite | |||||||
| EEG amplifier | A-M Systems | 1800 | |||||||
| EEG display monitor | Hewlett Packard | 78304A | |||||||
| End tidal CO2 monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Optimize ventilation | ||||||
| Carbide drill burrs for drilling bone | Henry Schein | fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip) | |||||||
| Cement for headplate/chamber | Dentsply | 675571, 675572 | |||||||
| Black Powder Tempera Paint | Sargent Art Inc. | 22-7185 | Add to cement to improve light shielding and reduce reflections | ||||||
| Agarose - Type III-A | Sigma | A9793 | For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging | ||||||
| Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness | World Precision Instruments | 502040, 502041 | For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed | ||||||
| Brudon curettes | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Cleaning skull surface | ||||||
| Bone wax | Ethicon | W31G | Quickly stop bleeding | ||||||
| Cotton Tipped Applicator | Electron Microscopy Sciences | 72308-05 | Clean and dry bone surface | ||||||
| Dumont #5CO Forceps | Fine Science Tools | 11295-20 | Grab individual layers of dura or pia | ||||||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | Cut dura | ||||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | To stop bleeding on the dura | ||||||
| Absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Ultra-fast and lint-free wicking of CSF | ||||||
| Blackout material | Thorlabs | BK5 | Shield craniotomy | ||||||
| 2. Dye preparation / injection | |||||||||
| Dimethyl Sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | |||||||
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | Calcium indicator | ||||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | |||||||
| Centrifugal filter (0.45 μm pore size) | Millipore | UFC30HV00 | To remove impurities before injection | ||||||
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P97 | |||||||
| Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Dye ejection pipette | ||||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | For loading dye into pipette | ||||||
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | To position pipette | ||||||
| Pressure pulse controller | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | For pressure injection of the dye | ||||||
| Single-cell electroporator | Molecular Devices | Axoporator 800A | For electroporation of the dye | ||||||
| 3. Intrinsic imaging | |||||||||
| 4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) | Olympus | UPLFLN4X | |||||||
| Intrinsic hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software is used for episodic imaging | ||||||
| CCD Camera | Adimec | Adimec-1000 | |||||||
| Light source power supply | KEPCO | ATE 15-15M | |||||||
| Light source | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW | ||||||
| Green filter (for vascular image) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (bandpass 30 nm) | For reference image of surface vasculature | ||||||
| Red filter (for intrinsic signal) | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm (bandpass 30 nm) | To collect intrinsic signals | ||||||
| Heat filter | Optical Imaging Inc. | KG-1 | |||||||
| 4. Two-photon rig/imaging | |||||||||
| Two-photon microscope and software | Prairie Technologies | See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power | |||||||
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | |||||||
| 20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) | Olympus | UMPLFLN20X | 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging) | ||||||
| 20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) | Olympus | XLUMPLFLN20X | |||||||
| 40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | |||||||
| Air table | Newport | ST-200 | Isolates preparation from external vibrations | ||||||
| xy stage | Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA) | Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage | |||||||
|
|||||||||
References
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