Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones

Summary

Se describe un método para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en funcional predeterminada micro-dominios del neocórtex. En primer lugar, la imagen de la señal óptica intrínseca se utiliza para obtener un mapa funcional. Luego de dos fotones microscopía se utiliza para etiquetar y neuronas imagen dentro de un dominio de micro del mapa.

Abstract

En la corteza visual primaria de los mamíferos no roedores, las neuronas se agrupan de acuerdo a su preferencia por las características del estímulo como la orientación ^{1-4, 5-7} dirección dominación, ocular ^8,9 y disparidad binocular ^9. Selectividad de orientación es la característica más ampliamente estudiado y un mapa continuo con un diseño cuasi-periódico de orientación preferida está presente en toda la corteza visual primaria ^10,11. La integración de los aportes sinápticas, celular y de red que conducen a las respuestas de estímulos selectivos en estos mapas funcionales requiere de la hibridación de técnicas de imágenes que abarcan sub-micrón milímetros a escalas espaciales. Con los métodos convencionales de la señal óptica intrínseca, la disposición general de los mapas funcionales a lo largo de toda la superficie de la corteza visual se puede determinar ^12. El desarrollo in vivo de dos fotones microscopía utilizando colorantes sensibles al calcio permite a uno determinar la SYNAPTentrada ic llegar a las espinas dendríticas individuales ¹³ o registro de actividad simultánea de cientos de los distintos órganos de células neuronales ^6,14. Por consiguiente, la combinación de imágenes de señal intrínseca con la resolución submicrónica espacial de dos fotones microscopía ofrece la posibilidad de determinar exactamente qué segmentos dendríticas y células contribuyen a la micro-dominio de cualquier mapa funcional en el neocórtex. Aquí se demuestra un método de alto rendimiento para la rápida obtención de un mapa cortical y orientación dirigida a un microorganismo específico de dominio en este mapa funcional para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en un mamífero no roedora. Con el mismo microscopio usado para dos fotones de formación de imágenes, en primer lugar generar un mapa de orientación utilizando imágenes de señal óptica intrínseca. A continuación, le mostramos cómo dirigir una micro-dominio de interés utilizando una micropipeta cargada de tinte a cualquiera de etiqueta con una población de cuerpos de células neuronales o la etiqueta de una sola neurona de tal manera que las dendritas y los axones, las espinas son visibles envivo. Nuestros criterios de búsqueda sobre los métodos anteriores facilitar el examen de neuronales relaciones estructura-función con la sub-celular resolución en el marco de neocorticales arquitecturas funcionales.

Protocol

1. Preparación quirúrgica

1. Inducir la anestesia y vigilar continuamente la frecuencia cardíaca, terminar tidal CO _2, EEG, y la temperatura. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad Médica de Carolina del Sur y se basaron en los que previamente publicada ^9,15.
2. Exponer la superficie dorsal del cráneo por el corte de la piel con una cuchilla de escalpelo. Separe los tejidos conectivos que recubren el hueso utilizando una cureta Brudon. Limpie el hueso utilizando aplicadores con punta de algodón y gasa de algodón. Aplique la cera ósea (según sea necesario) con el cráneo, para detener el sangrado ocasional a través de pequeñas venas emisarias.
3. Adjuntar una placa de titanio o de acero inoxidable al cráneo (más de la región de interés en el que se realiza la craneotomía) mediante el uso de cemento dental mezclado con pintura de color negro (ver Materiales). Una abertura rectangular en el centro de la placa de cabeza proporciona el acceso para la craneotomía y formación de imágenes ópticas. Adjuntar una cámara de metal en la parte superior de la placa de cabeza. Esta cámara servirá como un depósito de fluido para la formación de imágenes con la lente de objetivo de inmersión en agua.
4. Fije la placa de cabeza a una etapa xy usando postes de metal.
5. Thin una gran área del hueso dentro de la abertura rectangular de la placa superior mediante el uso de un taladro dental. El área a ser adelgazada debe extenderse más allá de los límites de la craneotomía planificada. El cráneo grueso de los mamíferos no roedores, se debe diluir si imágenes de alta resolución de ser adquiridos a partir de la neocorteza porque en el sitio de la craneotomía, el espesor del hueso determinará el espesor de la agarosa entre el cubreobjetos y la superficie neocortical (ver más abajo) .
6. Haga un esquema de 2 x 2 mm cuadrados en el hueso de la craneotomía. Enjuague la cámara periódicamente con fluido nuevo cerebroespinal artificial (ACSF) para eliminar los fragmentos de hueso y minimizar la disipación de calor a la corteza subyacente. Aplicar cera de hueso, según sea necesario, para detener el sangrado ocasional.
7. Lift el colgajo óseo con un fórceps # 3.
8. Deje únicamente la capa inferior de la duramadre con una multa fórceps (# 5CO) y tijeras Vannas primavera. La duramadre en mamíferos no roedores es gruesa y opaca, pero se puede quitar en capas distintas. El sangrado es raro pero puede ser detenida con Gelfoam y cualquier residuo de sangre se debe extraer con cuidado la capa restante de duración utilizando fórceps y aclarado con ACSF. La última capa de la duramadre es transparente y los vasos piales debe ser claramente visible a través de ella. De salir de esta última capa de la duramadre intacta durante la formación de imágenes de la señal intrínseca aumentará la tasa de éxito de la carga a granel de indicadores de calcio fluorescente para la fase de formación de imágenes posterior de dos fotones del experimento (véase la discusión).
9. Aplicar una gota de tibia agarosa al 2% (disuelta en ACSF) e inmediatamente colocar un cubreobjetos sobre la craneotomía. Ver la craneotomía para asegurar que las pulsaciones respiratorias y cardiovasculares son mínimos mediante el uso de un microscopio de disección quirúrgica o los oculares de la de dosmicroscopio de fotones en el campo brillante modo.

2. Intrínseco señal óptica de imagen

1. Añadir gel-espuma empapado con ACSF alrededor del exterior del cubreobjetos para evitar que la agarosa de secado durante la formación de imágenes de la señal intrínseca.
2. Fije la señal intrínseca imagen de la cámara CCD para el estándar de montaje C puerto en la parte superior del microscopio de dos fotones (Figura 1). Coloque la fuente de iluminación de luz en la mesa de aire cerca de la etapa de XY (fig. 1A). Coloque y asegure las guías de luz de más de la craneotomía y placa superior / cámara (fig. 1B). Retraer el dicroico primario y el espejo debajo del orificio de montaje C, de modo que la luz reflejada rojo necesaria para señales intrínsecas pasará directamente de la craneotomía a la cámara CCD (Figura 1C-D). Uso del objetivo 4x aire (0,13 NA, 17 mm WD), un 2 x 2 mm campo de vista está disponible para la imagen de la señal intrínseca.
3. Insertar un filtro de calor en el light camino para prevenir la corteza de calefacción. El uso de un filtro que deja pasar la luz verde (546 nm centro λ) y grabar una imagen digital de referencia de los vasos sanguíneos superficiales corticales.
4. Mover el foco z a 500 micras debajo de la superficie cortical. Utilice un filtro rojo (630 nm centro λ) para iluminar la corteza para la medición de señales intrínsecas. Coloque las guías de luz de manera que la superficie cortical está uniformemente iluminado. Proteger la craneotomía de la luz producida por la pantalla estímulo visual. Presentar una secuencia de estímulos visuales y grabar imágenes de reflectancia de datos. Para generar un mapa de orientación dentro de 10 min, recoger datos correspondientes a 4 repeticiones de una secuencia de estímulos 8 (4 orientaciones y direcciones dos para cada orientación).
5. Analizar los datos de las señales intrínsecas para generar un mapa de color orientación falsa. Selección de regiones objetivo potenciales para dos fotones etiquetado de las neuronas, por ejemplo, la orientación singularidades pinwheel - puntos en el mapa dondetodas las orientaciones preferidas convergen (Figura 2A). Superponer el mapa de orientación y la imagen de la vasculatura superficie cortical (Figura 2B-C). Use la organización de los dominios funcionales y la ubicación de los buques de gran superficie para seleccionar un objetivo, evitando lugares con vasos sanguíneos grandes y arteriolas ^15.

3. Bulk Loading Indicadores de calcio fluorescente

1. Preparar una solución de 20% de Pluronic / DMSO mediante la adición de 1 g de Pluronic en 5 l de DMSO. Calentar la mezcla a 60 º C durante 10 min para disolver completamente el Pluronic. Dejar que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente. Añadir 4 l de la mezcla de Pluronic / DMSO a un vial de 50 mg de indicador de calcio fluorescente Oregon Green 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). A continuación, añadir 1 l de un colorante rojo (Alexa Fluor 594, 2 mM de solución madre) y 35 l de solución de la pipeta (véase Materiales) para una concentración final de 1 mM OGB-1 AM. Sonicar la solución durante media hora enun baño de agua helada y luego se centrifuga con un filtro de 0,45 micras para eliminar las impurezas.
2. Tire una pipeta cónica de longitud con un diámetro de la punta exterior de 2.0-2.5 m. Cargar 5 l de la mezcla de colorantes en la pipeta.
3. Retire la capa final de duración para facilitar la inserción pipeta y obtener la más alta calidad de dos fotones de imágenes.
4. Determinar la ubicación exacta en la superficie cortical que la pipeta debe ser colocado con el fin de alcanzar su objetivo en la capa cortical 2/3. Nuestro objetivo predeterminado cortical es una singularidad pinwheel en el mapa de orientación (Figura 2). La pipeta debe ser conducido en la corteza en un ángulo de 30 º para pasar entre la pared de la cámara y el objetivo. Por lo tanto, para etiquetar la región diana 200 micras por debajo de la superficie cortical, la posición de entrada de la pipeta en la superficie cortical será de aproximadamente 350 micras laterales a la posición de destino (Figura 3 AB).
5. Mover la fase XY (en el que el animal y el pmicromanipulador ipette se colocan) para centrar la posición de la superficie cortical entrada en el objetivo (Figura 3C). Utilice un objetivo de 20x o 40x con una distancia de trabajo (WD) de al menos 3 mm (véase Materiales) para asegurarse de que la pipeta entrará fácilmente en la corteza sin tocar el objetivo o el hueso a lo largo de la pared de la craneotomía. Una vez que la posición de entrada se centra en el objetivo, elevar la posición Z del objetivo por 2 mm (Figura 3D). Con la epi-fluorescencia verde semáforo se puso en rojo para visualizar el colorante Alexa en la pipeta, utilizar el eje diagonal de la micromanipulador para mover la pipeta hasta que su punta esté centrada (y centrado) con el objetivo directamente por encima de la posición de la superficie cortical entrada ( Figura 3E).
6. Bajar la pipeta verticalmente (a lo largo del eje z), hasta que la pipeta llegue a la superficie cortical (Figura 3F), mientras que continua viendo la punta de la pipeta a través de la OCUlars del microscopio. Uso de iluminación de campo brillante, los vasos sanguíneos y la superficie cortical restantes membranas meníngeas (piamadre y aracnoides) son fácilmente visibles como la pipeta se aproxima a la superficie cortical. Si la pipeta no llega a la posición de entrada deseada, elevar la pipeta y recalibrar de focalización basado en los puntos de referencia vasculares en la superficie cortical.
7. Retire el objetivo, absorbe y expulsa el exceso de líquido cefalorraquídeo de la craneotomía y secar el hueso adyacente usando sin pelusa lanzas de absorción. Aplicar una gota de tibia 3% de agarosa (disuelta en ACSF) para estabilizar la corteza que es visible a través de la craneotomía (Figura 3G). En no roedores, 3% de agarosa es necesario para amortiguar pulsaciones para una utilización eficaz de colorantes fluorescentes por las neuronas. Para las imágenes de la señal óptica intrínseca sólo 2% de agarosa es necesaria porque la combinación de 2% de agarosa y el cubreobjetos proporciona la estabilidad necesaria. Aquí, no cubreobjetos se utiliza para el paso de tinte de carga de modo 3% de agarosa senecesario. Después de que la agarosa se ha solidificado, insertar un objetivo de 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) y volver a llenar la cámara con ACSF.
8. Cambie de campo claro a dos fotones de visión y busque la punta de la pipeta. Usando el eje diagonal de la micromanipulador, mover la pipeta hasta que su punta alcanza la profundidad deseada en la corteza (Figura 3H). Ocasionales ráfagas de expulsión de presión de la mezcla de colorantes (un psi pocos, cada pulso de 0,1 s) le ayudará a evitar que la punta de la pipeta se obstruya. Debido OGB-1 AM sólo se hace visible al entrar en las células, el rojo colorante Alexa es crítica para la visualización de la punta de la pipeta en el interior de la corteza.
9. Antes de intentar cargar las neuronas en la capa cortical 2/3 con la dosis completa de tinte, re-enfocar el objetivo en la superficie cortical para confirmar la profundidad de la punta de la pipeta y asegurarse de que la punta está en la ubicación de destino basado en la disposición de vasos sanguíneos superficiales. Si la pipeta está en la capa 2/3, pequeñas bocanadas de la mezcla de colorantes debe iluminar laespacio extracelular y revelan un conjunto denso de los cuerpos celulares circulares como sombras oscuras.
10. Para cargar los cuerpos celulares neuronales en una esfera de diámetro corteza 300-600 micras, inyectar la mezcla de tintes en el espacio extracelular utilizando 30-90 pulsos, cada pulso de 1,0 seg, 2-10 psi. Los pulsos de presión no debe ser tan fuerte que el tejido se mueve. Después de la inyección se ha completado, espere unos pocos minutos, luego retire la pipeta y objetiva. Espere 1 hora para permitir la OGB-1 AM a estar plenamente en marcha por las neuronas.
11. Eliminar la agarosa utilizado para la carga de colorante y enjuagar la cámara de registro. Ponga una pequeña gota de 2-3% de agarosa en la superficie y poner rápidamente un cubreobjetos sobre la craneotomía. Debido a que los tintes fluorescentes son sensibles a la luz, evitar la sobre-exposición de la corteza de campo brillante o luz epi-fluorescente. Insertar un alto NA (1,0) 20x objetivo en el soporte objetivo y volver a centrar la región cortical etiquetado con arreglo al objetivo con la etapa xy. Proteja la craneotomía de exfuentes traneous luz, por ejemplo, visualización de estímulo visual, utilizando múltiples capas de material apagón.

4. De celda única Electroporación de colorantes fluorescentes

1. Para el estudio de la morfología dendrítica, preparar una solución de 100 mM de Alexa Fluor 594 (dilución 1:20 en ACSF de 2 mM Alexa Fluor 594 stock). Para obtener imágenes funcionales de las dendritas de una sal OGB puede utilizarse ^16,17.
2. Tire una pipeta cónica larga con un tamaño de punta de 1 micras y con carga de 5 l de medio de contraste en la pipeta. Todos los demás pasos de la focalización de un dominio funcional son idénticos al método de carga a granel (Figuras 1-3). Para posicionar la punta de la pipeta adyacente a una membrana celular neuronal cuerpo, controlar el aumento de la impedancia de los electrodos y aplicar presión bocanadas de tinte para iluminar el espacio extracelular y ver los cuerpos celulares como sombras durante dos fotones de imágenes.
3. Cuando la punta de la pipeta es adyacente a una membrana celular neuronal cuerpo, utiliza el 800A Axoporator para aplicarPulsos de 1-3 (-8 a -10 V, 10 ms de pulso). El relleno inmediato de la neurona con colorante se visualiza fácilmente con dos fotones microscopía. Retire la pipeta y recoger imágenes de alta resolución de las dendritas y los axones in vivo.

Representative Results

Para ilustrar la precisión de los métodos de etiquetado de tinte, nos centramos en las más pequeñas micro-dominio de cualquier mapa que sepa que funciona en el neocórtex no roedor. Escasamente salpicado por todo el mapa de orientación en la corteza visual primaria son singularidades. Esto ocurre en los puntos donde convergen todas las orientaciones preferentes de tal manera que en los mapas de falso color de la orientación preferida, las regiones de todo el aspecto singularidad como "molinillos" (Figura 2A-B). Un molinillo de viento por craneotomía es seleccionado para el tinte de etiquetado (círculo verde en la figura 2C), asegurándose de evitar los grandes vasos y arteriolas en particular ^15. Con mayor parte de carga de OGB-1 AM, seguimiento de los cambios en la fluorescencia indicador de calcio neuronal a una secuencia de estímulos visuales de rejilla orientados revela una sola célula de mapas de resolución funcionales alrededor de singularidades Pinwheel (Figura 4). Con una sola célula de la electroporación, la organización espacial de las dendritas y los axones de taningle neurona situado en una singularidad molinete se determina in vivo (Figura 5).

Figura 1. Configuración intrínseca de la señal óptica de imágenes. (A) El animal se coloca en la etapa xy y de imagen de la señal intrínseca se realiza a través de una cámara CCD montada en el microscopio de dos fotones. La fuente de luz y equipo utilizado para controlar la sesión de formación de imágenes son presentadas a la configuración para la formación de imágenes intrínseca y alejado antes de la fase de formación de imágenes de dos fotones de comenzar el experimento. (B) Cierre de vista del objetivo de 4x y la iluminación de 630 nm a través de guías de luz líquida. O los dos conductores de luz adjunta a postes metálicos (izquierda), o un solo anillo iluminador directamente unido a la objetiva (derecha) se puede utilizar. El material utilizado para Blackout proteger el objetivo de otras fuentes de iluminación, por ejemplo, visualización de estímulo visual, durante las sesiones de formación de imágenes ópticas, no se muestra. (C) Esquema de la trayectoria de la luz del microscopio y en la configuración de imagen convencional de dos fotones. Ver Fig. Complementario. 20 en Shen et al. 2012 ¹⁵ para una descripción de la trayectoria de la luz completa de dos fotones. El espejo retráctil se coloca para desviar la luz desde el láser a través de la dicroico y en la corteza. El dicroico primario, el cual pasa el haz de láser y refleja la luz emitida desde la corteza a la del PMT, se mueve en la trayectoria de la luz girando la torreta filtro. (D) En el caso de imágenes intrínseco del espejo se retrae y la torreta filtro está activado para mover el dicroico primario fuera del camino, lo que permite una vía directa la luz de la corteza de la cámara CCD. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

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Figura 2. El uso de mapas funcionales obtenidos con las imágenes de la señal intrínseca para seleccionar un dominio de micro-para el etiquetado de las neuronas con tintes fluorescentes. (A) mapa de orientación de gato corteza visual primaria adquirida a través de imágenes de la señal óptica intrínseca. El color de cada píxel representa la orientación preferida en esa ubicación. Los posibles singularidades pinwheel orientación adecuada para el etiquetado de las neuronas con tintes fluorescentes se presentan dentro de los círculos negros. (B) El mapa de corticales vasos sanguíneos superficiales superpone con el mapa de orientación. (C) Pinwheels dentro de círculos rojos son cerca de los vasos sanguíneos grandes o arteriolas y así que el sitio pinwheel dentro del círculo verde es elegido como el objetivo para el etiquetado de tinte. El rectángulo de trazos corresponde a la región que se muestra en la Figura 3B. Barra de escala en (A) 500 ymu; m.

Figura 3. La optimización de la colocación de pipeta para la carga de las neuronas con tintes fluorescentes. (A) vista lateral esquemática de la cámara de registro indica que el sitio de carga de colorante a ser el objetivo de la corteza visual (ojo de buey rojo y blanco) es de ~ 200 micras por debajo de la cortical superficie. La coordenada xy de la diana corresponde a la ubicación de una singularidad pinwheel orientación determinada a partir de imágenes de la señal intrínseca. La pipeta se introduce la corteza en un ángulo de 30 °. Si la superficie cortical es paralela a la superficie de la platina xy, la punta de la pipeta se mueve lateralmente aproximadamente 350 micras antes de llegar a la singularidad de remolino. (B) Vista superior de la cámara de registro muestra la vasculatura superficie cortical y la posición de entrada pipeta (estrella roja) tha es de 350 m desde la singularidad molinete. (C) la posición del portaobjetos XY se ajusta de modo que la posición de entrada pipeta está centrado bajo el objetivo de 40x 20x o (3.3 a 3.5 mm WD). (D) El objetivo se eleva ~ 2 mm. (E) La pipeta se pone sobre la craneotomía y su punta se coloca directamente sobre la posición de entrada en la superficie cortical usando verde epi-fluorescente luz. (F) La pipeta y el objetivo se bajan simultáneamente usando iluminación de campo brillante hasta que los vasos sanguíneos superficiales corticales entrar en foco. (G) El objetivo ACSF y se retiran y una gota de agarosa al 3% se aplica sobre la craneotomía. (H) de dos fotones visualización con un 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) objetivo se utiliza para seguir la pipeta hacia abajo a la profundidad elegida cortical y se inyecta el medio de contraste. Después de confirmar que las neuronas están correctamente etiquetadas con tinte fluorescente, típicamente, una mayor NA objetivo 20x (1,0 NA, 2,0 mm WD) se utiliza para recoger dos fotones t - y los datos de la serie Z. Esquemático s se muestra en A, CH no están dibujados a escala.

Figura 4. Correspondencia de preferencia orientación en mapas de imagen de dos fotones de señal intrínseca y funcional. (A) Dos fotones área de la imagen que muestra cuerpos de las células marcadas con OGB-1 de la mañana en la corteza visual capa 2/3. (B) Orientación preferencia de cuerpos de células neuronales individuales del mismo sitio se muestra en (A). Alrededor de la singularidad molinillo que tuvo su epicentro en la región fotografiada es un mapa de orientación organizada estímulo preferido. (C) El mapa de orientación obtenida con la imagen de la señal intrínseca. El cuadrado negro corresponde a la región que se muestra en (B). Estos datos se obtuvieron a partir del mismo experimento mostrado en las Figuras 2A-C y 3B. Barra de escala en (AB) 100 micras y (C) micras 500.

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Figura 5. En la morfología in vivo de una sola neurona en una singularidad pinwheel orientación. (A) Las dendritas y cuerpo celular de una neurona individual se superpone el mapa de orientación en el mismo sitio cortical visual. La neurona se sometió a electroporación con Alexa Fluor 594 en virtud de dos fotones de orientación, una z-pila se recogió in vivo, y procesos dendríticos fueron rastreadas utilizando el software de Neurolucida desconectado. El mapa de orientación se obtuvo utilizando imágenes de señal intrínseca antes de una sola célula de la electroporación. (B) La intensidad promedio de 10 micras-z-proyección de la capa cortical 1 muestra las dendritas apicales. (CD) Intensidad Media 10-m-z proyecciones de la capa cortical 2/3 dendritas y axones basales muestran. Las flechas rojas muestran las espinas a lo largo de las dendritas y las flechas blancas señalan los axones individuales. Las barras de escala en (AD) 100 micras.

Discussion

Se presenta un método para dirigir el etiquetado de los cuerpos celulares neuronales (o dendritas y axones) en pre-determinados micro-dominios funcionales de la corteza cerebral. La fusión de imágenes de la señal óptica intrínseca con dos fotones microscopía ofrece la posibilidad de determinar que sinapsis y células contribuyen a la micro-dominio de cualquiera de los mapas funcionales, si correlatos neuronales selectividad con la ubicación de la neurona en un mapa funcional, y el circuito neuronal componentes que cambian con la experiencia visual ⁷ o la aplicación de fármacos terapéuticos clínicamente ^18.

No hay mapas para la orientación estímulo, dirección, dominancia ocular, o disparidad binocular se han reportado en la corteza visual de adultos de tipo salvaje roedores ^6,19-21. Sin embargo, la facilidad de carga neuronas con tintes fluorescentes y el logro de la estabilidad de imagen, junto con las poderosas herramientas genéticas disponibles para los ratones se ha traducido en la gran mayoría de los estudiosutilizando dos fotones de formación de imágenes de la corteza cerebral que se realiza en los roedores en lugar de hurones, gatos y monos.

De alta resolución de imagen de dos fotones de neuronas en mamíferos no roedores puede ser muy difícil debido a los tiempos quirúrgicos largos y gruesos huesos y dura, y los pasos adicionales necesarios para mantener las pulsaciones mediadas respiratorias y cardiovasculares del cerebro a un mínimo de ^15. Las transiciones de la cirugía a la filmación de la señal intrínseca e intrínseca a dos fotones de imágenes deben ser eficientes, lo que requiere la preparación oportuna de los reactivos, colorantes y la ejecución de micro-quirúrgicos. Con el microscopio de dos fotones para obtener imágenes de señal intrínseca evita la necesidad de gran parte de los equipos utilizados en las plataformas convencionales de señales intrínsecas de imágenes ópticas ²² y reduce el tiempo necesario para configurar imágenes intrínseca y la transición al posterior de dos fotones de imágenes.

Nuestro enfoque está específicamente diseñado para ofrecer una alta resolución de dos photonelada de imagen en pre-determinados dominios funcionales. Esto proporciona charla cruzada mínima de señales funcionales entre los cuerpos de las células neuronales, y las espinas dendríticas y los axones individuales se pueden resolver in vivo. Con una gran apertura numérica (NA = 1,0) objetivo y llenar la abertura posterior del objetivo con óptica de haz de expansión (ver Fig. Complementario. 20 en Shen et al., 2012 ¹⁵⁾ son fundamentales para la alta resolución de imagen. Dependiendo de la velocidad de formación de imágenes en XY y / o Z, pulsaciones respiratorios y cardiovasculares pueden reducir la resolución de imagen efectiva no importa lo bueno que la AN y la ruta de luz óptica son. Al limitar el tamaño de la craneotomía en no roedores a 2 x 2 mm, utilizando la concentración relativamente alta de agarosa con un cubreobjetos, y la realización de una suspensión neumotórax y lumbar cuando necesarias, ¹⁵ pulsaciones cerebrales están limitados a 1-2 m. Minimizando las pulsaciones inducidas respiratorias y cardiovasculares de la neocorteza a 1-2 micras durante la mayor partecarga de indicadores de calcio también se asegura de que la corteza forma un sello hermético alrededor de la pipeta insertada y que no colorante pistas a lo largo del vástago de la pipeta a la superficie cortical. Selección de inyección de medio de contraste y imágenes de sitios lejos de las arteriolas grandes también es fundamental para obtener imágenes de alta calidad funcional porque relativamente rápido sensoriales evocados hiperemia (hemodinámica) artefactos serán excluidos ^15.

En el sitio de la craneotomía, dejando la capa final de duramadre intacta durante la formación de imágenes fluorescentes señal intrínseca y las fases de preparación de tinte - por lo que la eliminación de justo antes de la inserción de la pipeta en la corteza de carga de colorante - aumenta la tasa de éxito y la calidad de etiquetado neuronal en la siguiente maneras: (1) mantiene la superficie de limpieza cortical y / o impide la regeneración del tejido dural de manera que la punta de la pipeta es menos probable que se obstruyen y la transparencia del tejido se mantiene, (2) evita tener la agarosa utilizado para el tacto de la formación de imágenes intrínseca cortcos vasos sanguíneos superficiales que pueden ser dañados cuando la agarosa se retira, (3) evita que la agarosa utilizado durante la imagen intrínseca de entrar entre la duramadre y la corteza debajo del cráneo alrededor de los bordes de la craneotomía. Agarosa en estas regiones se incrementará la distancia entre el cubreobjetos y la superficie cortical, que hace que la inserción de la pipeta más difícil, lleva a la compresión del tejido cortical y reduce la transparencia para formación de imágenes.

En la preparación de la AM tintes fluorescentes para carga a granel, el 20% de Pluronic / DMSO mezcla nunca debe ser usado más allá de 1 semana desde su preparación inicial - Pluronic viejo / DMSO extingue la fluorescencia. Para la carga a granel óptimo de muchos cuerpos celulares adyacentes con un indicador funcional, por ejemplo, OGB-1 AM, la mezcla de colorantes se almacena en hielo, se carga en la pipeta, según sea necesario, pero siempre se inyecta en el cerebro dentro de 2 horas de su preparación.

Durante la fase de carga a granel deel experimento, repetido 1 seg pulsos de presión en lugar de una inyección continua de 1 min permite iterativo de calibración de los parámetros de inyección, lo que asegura que el colorante o presión en exceso no se aplica. Debido al daño potencial de los tejidos de las inserciones de pipeta de múltiples necesarias para etiquetar regiones muy grandes de tejido y la toxicidad potencial de grandes volúmenes de Pluronic / DMSO a partir de una serie de muchas inyecciones, se prefiere un sitio de 300-600 micras de inyección de tinte por 2 x 2 craneotomía mm. En comparación con las inyecciones de ¹⁴ ciego, de dos fotones de navegación visualmente guiado alrededor de los vasos sanguíneos, el uso de contraste negativo de cuerpos de células neuronales para determinar la posición de la lámina, y calibre de la propagación del líquido a presión de eyección como un índice del volumen de células que se marcado con OGB-1 AM, mejora la calidad de carga de colorante en las preparaciones no roedora.

El protocolo se describe aquí un etiquetamiento éxito de las neuronas con tintes fluorescentes en alquitrángeted micro-dominios en cada animal tratado. Para la carga a granel con OGB-1 AM, consistentemente obtener respuestas evocadas visualmente-en 75-100% de las neuronas simultáneamente fotografiadas ^9,15 y la técnica es sensible a la detección de potenciales de acción individuales in vivo ^23,24.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Life support/experiment prep
Isoflurane	Webster Vet	NDC 57319-474-05
Isoflurane vaporizer	Midmark	VIP 3000
Feedback regulated heating blanket	Harvard Apparatus	50-7079F
ECG monitor	Digicare Biomedical	LifeWindow Lite
EEG amplifier	A-M Systems	1800
EEG display monitor	Hewlett Packard	78304A
End tidal CO2 monitor	Respironics	Novametrix Capnoguard 1265	Optimize ventilation
Carbide drill burrs for drilling bone	Henry Schein	fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip)
Cement for headplate/chamber	Dentsply	675571, 675572
Black Powder Tempera Paint	Sargent Art Inc.	22-7185	Add to cement to improve light shielding and reduce reflections
Agarose - Type III-A	Sigma	A9793	For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging
Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness	World Precision Instruments	502040, 502041	For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed
Brudon curettes	George Tiemann	105-715-0, 105-715-3	Cleaning skull surface
Bone wax	Ethicon	W31G	Quickly stop bleeding
Cotton Tipped Applicator	Electron Microscopy Sciences	72308-05	Clean and dry bone surface
Dumont #5CO Forceps	Fine Science Tools	11295-20	Grab individual layers of dura or pia
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03	Cut dura
Gelfoam	Pfizer	09-0396-05	To stop bleeding on the dura
Absorption spears	Fine Science Tools	18105-01	Ultra-fast and lint-free wicking of CSF
Blackout material	Thorlabs	BK5	Shield craniotomy
2. Dye preparation / injection
Dimethyl Sulphoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Pluronic	Sigma	P2443
Oregon Green 488 Bapta-1 AM	Invitrogen	O6807	Calcium indicator
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A10438
Centrifugal filter (0.45 μm pore size)	Millipore	UFC30HV00	To remove impurities before injection
Glass pipette puller	Sutter Instruments	P97
Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter)	World Precision Instruments	1B150F-4	Dye ejection pipette
Microloader	Eppendorf	5242 956 003	For loading dye into pipette
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285	To position pipette
Pressure pulse controller	Parker Hannifin	PicoSpritzer III	For pressure injection of the dye
Single-cell electroporator	Molecular Devices	Axoporator 800A	For electroporation of the dye
3. Intrinsic imaging
4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD)	Olympus	UPLFLN4X
Intrinsic hardware / software	Optical Imaging Inc.	Imager 3001 / VDAQ	VDAQ software is used for episodic imaging
CCD Camera	Adimec	Adimec-1000
Light source power supply	KEPCO	ATE 15-15M
Light source	Optical Imaging Inc.	HAL 100	Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW
Green filter (for vascular image)	Optical Imaging Inc.	λ = 546 nm (bandpass 30 nm)	For reference image of surface vasculature
Red filter (for intrinsic signal)	Optical Imaging Inc.	λ = 630 nm (bandpass 30 nm)	To collect intrinsic signals
Heat filter	Optical Imaging Inc.	KG-1
4. Two-photon rig/imaging
Two-photon microscope and software	Prairie Technologies		See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai XF
20x (0.5 NA; 3.5 mm WD)	Olympus	UMPLFLN20X	0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging)
20x (1.0 NA; 2.0 mm WD)	Olympus	XLUMPLFLN20X
40x (0.8 NA; 3.3 mm WD)	Olympus	LUMPLFLN40X/IR
Air table	Newport	ST-200	Isolates preparation from external vibrations
xy stage	Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA)		Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage
Recipes Artificial Cerebro-Spinal Fluid NaCl (135 mM), KCl (5.4 mM), MgCl2 (1.0 mM), CaCl2 (1.8 mM), HEPES (5 mM), pH 7.4 Pipette Solution14 NaCl (150 mM), KCl (2.5 mM), HEPES (10 mM), pH 7.4