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Neuroscience

एक विशिष्ट कार्यात्मक आंतरिक सिग्नल के संयोजन से neocortex माइक्रो डोमेन और दो photon इमेजिंग में न्यूरॉन्स की लक्षित लेबल

Published: December 12, 2012 doi: 10.3791/50025
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neuroscience, Medical University of South Carolina

Summary

फ्लोरोसेंट रंगों के साथ पूर्व निर्धारित neocortex के कार्यात्मक सूक्ष्म डोमेन में न्यूरॉन्स लेबलिंग के लिए एक विधि वर्णित है. पहले, आंतरिक संकेत ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए एक कार्यात्मक नक्शा प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है. फिर दो photon माइक्रोस्कोपी नक्शे के एक डोमेन सूक्ष्म के भीतर लेबल और छवि न्यूरॉन्स के लिए प्रयोग किया जाता है.

Protocol

1. सर्जिकल तैयारी

  1. संज्ञाहरण प्रेरित और लगातार दिल की दर पर नजर रखने, ज्वारीय सीओ 2, ईईजी, और तापमान के अंत. सभी प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और दक्षिण कैरोलिना के चिकित्सा विश्वविद्यालय के उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है और जो हम पहले से 9,15 प्रकाशित पर आधारित थे.
  2. एक स्केलपेल ब्लेड के साथ त्वचा को काटने से खोपड़ी की पृष्ठीय सतह बेनकाब. संयोजी ऊतकों एक Brudon curette का उपयोग कर हड्डी overlying काटना. साफ कपास इत्तला दे दी applicators और कपास धुंध का उपयोग कर हड्डी. खोपड़ी से हड्डी मोम (के रूप में की जरूरत है) लागू करने के लिए, छोटे दूत नसों के माध्यम से सामयिक रक्तस्राव को रोकने के लिए.
  3. खोपड़ी (ब्याज जहां craniotomy प्रदर्शन किया जाएगा के क्षेत्र पर) दंत काले रंग (सामग्री देखें) के साथ मिश्रित सीमेंट का उपयोग करके एक टाइटेनियम या स्टेनलेस स्टील सिर प्लेट संलग्न. सिर थाली के केंद्र में एक आयताकार खोलने craniotomy के लिए उपयोग और ऑप्टिकल इमेजिंग प्रदान करता है. सिर की थाली के शीर्ष पर एक धातु के चेंबर संलग्न. यह कक्ष एक द्रव जलाशय के रूप में इमेजिंग के लिए पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस के साथ की सेवा करेंगे.
  4. एक xy धातु पदों का उपयोग चरण के लिए सिर थाली सुरक्षित.
  5. एक दंत ड्रिल का उपयोग करके headplate के आयताकार उद्घाटन के भीतर हड्डी के एक बड़े क्षेत्र में पतली. thinned किया जाना क्षेत्र में अच्छी तरह से योजना बनाई craniotomy की सीमाओं से परे का विस्तार करना चाहिए. मोटी खोपड़ी गैर कृंतक स्तनधारियों की अगर उच्च संकल्प छवियों के लिए कर रहे हैं neocortex से अधिग्रहण कर लिया क्योंकि साइट पर craniotomy, हड्डी की मोटाई coverglass और neocortical सतह के बीच agarose की मोटाई हुक्म चलाना होगा thinned किया जाना चाहिए (नीचे देखें) .
  6. एक 2 x 2 मिमी हड्डी में craniotomy के लिए वर्ग रूपरेखा ड्रिल. चैम्बर ताजा कृत्रिम मस्तिष्कमेरु (ACSF) द्रव हड्डी shards को हटाने और अंतर्निहित प्रांतस्था को गर्मी लंपटता को कम करने के साथ समय - समय पर कुल्ला. हड्डी मोम लागू के रूप में की जरूरत है, कभी कभी खून बह रहा बंद.
  7. Lifहड्डी प्रालंब टी एक # 3 संदंश साथ.
  8. Dura के नीचे की परत एक ठीक (5CO #) संदंश और Vannas वसंत कैंची का उपयोग निकालें. ड्यूरा गैर कृंतक स्तनधारियों में मोटी और अपारदर्शी है लेकिन अलग परतों में हटाया जा सकता है. खून बह रहा है और दुर्लभ है, लेकिन Gelfoam साथ रोका जा सकता है और किसी भी रक्त अवशेषों धीरे ड्यूरा संदंश और ACSF साथ rinsing के शेष परत से हटाया जाना चाहिए. ड्यूरा की अंतिम परत पारदर्शी है और PIAL वाहिकाओं के माध्यम से यह स्पष्ट रूप से दिखाई दे होना चाहिए. आंतरिक संकेत इमेजिंग दौरान ड्यूरा के इस अंतिम परत बरकरार जा फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतकों के थोक लदान के बाद दो photon प्रयोग की इमेजिंग चरण के लिए सफलता की दर बढ़ाने (चर्चा देखने के लिए).
  9. गर्म 2% agarose (ACSF में भंग) की एक बूंद लागू करें और तुरंत craniotomy से अधिक एक coverglass जगह. कपाल - उच्छेदन की जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें कि श्वसन और हृदय pulsations एक शल्य विदारक माइक्रोस्कोप या oculars का उपयोग करके कम से कम कर रहे हैं दो -उज्ज्वल मैदान मोड में फोटॉन माइक्रोस्कोप.

2. आंतरिक सिग्नल ऑप्टिकल इमेजिंग

  1. Agarose आंतरिक संकेत इमेजिंग दौरान सुखाने से रोकने के coverglass के बाहर चारों ओर ACSF से लथपथ जेल फोम जोड़ें.
  2. मानक से दो photon माइक्रोस्कोप (1 चित्रा) के शीर्ष पर बंदरगाह C-माउंट आंतरिक संकेत इमेजिंग सीसीडी कैमरा संलग्न. XY मंच (चित्रा 1 ए) के पास हवा की मेज पर रोशन प्रकाश स्रोत रखें. स्थिति और सुरक्षित craniotomy और headplate / कक्ष (चित्रा 1B) पर प्रकाश गाइड. प्राथमिक dichroic और C-माउंट बंदरगाह नीचे दर्पण तो वापस लेना है कि परिलक्षित लाल आंतरिक संकेतों के लिए आवश्यक प्रकाश सीधे craniotomy से सीसीडी कैमरा (चित्रा 1C - डी) के लिए पारित करेंगे. 4x हवा (0.13 एनए, 17 मिमी WD) उद्देश्य, एक 2 x 2 मिमी देखने के क्षेत्र का उपयोग आंतरिक संकेत इमेजिंग के लिए उपलब्ध है.
  3. एल में एक गर्मी फ़िल्टर डालनेight हीटिंग से प्रांतस्था को रोकने के लिए पथ. एक फिल्टर है कि हरी प्रकाश (546 एनएम केंद्र λ) और cortical सतह रक्त वाहिकाओं के एक डिजिटल संदर्भ छवि रिकॉर्ड गुजरता का उपयोग करें.
  4. Cortical सतह के नीचे 500 मीटर z ध्यान केंद्रित हटो. एक लाल फिल्टर (630 एनएम केंद्र λ) का उपयोग करने के लिए आंतरिक संकेतों को मापने के लिए प्रांतस्था कोरोशनी देने. प्रकाश जैसे कि cortical सतह समान है प्रबुद्ध गाइड स्थिति. दृश्य उत्तेजना प्रदर्शन द्वारा उत्पादित प्रकाश से craniotomy ढाल. दृश्य उत्तेजनाओं और रिकॉर्ड reflectance डेटा छवियों के एक दृश्य पेश. 10 मिनट के भीतर एक अभिविन्यास नक्शा उत्पन्न करने के लिए, 8 उत्तेजनाओं (4 और झुकाव प्रत्येक उन्मुखीकरण के लिए दो दिशाओं) के एक दृश्य के 4 repetitions इसी डेटा इकट्ठा.
  5. आंतरिक संकेत डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक झूठी रंग उन्मुखीकरण नक्शा उत्पन्न करने के लिए. दो photon न्यूरॉन्स की लेबलिंग, जैसे, अभिविन्यास pinwheel singularities के लिए संभावित लक्ष्य के क्षेत्रों का चयन करें जहां नक्शे में अंकसभी पसंदीदा झुकाव एकाग्र (2A चित्रा). अभिविन्यास नक्शा और cortical सतह vasculature (चित्रा 2B - सी) की छवि ढ़कें. कार्यात्मक डोमेन और बड़े सतह वाहिकाओं का स्थान के लेआउट का उपयोग करने के लिए एक लक्ष्य का चयन करें, बड़े रक्त वाहिकाओं और 15 arterioles के साथ स्थानों से बचने के लिए.

3. फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतकों का थोक लोड हो रहा है

  1. 5 μl DMSO में 1 ग्राम Pluronic जोड़कर 20% Pluronic / DMSO के एक समाधान तैयार. 60 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पूरी तरह से भंग Pluronic मिश्रण गर्मी. मिश्रण को कमरे के तापमान को शांत करने के लिए अनुमति दें. एक फ्लोरोसेंट कैल्शियम सूचक ओरेगन ग्रीन Bapta 488-1 AM (ए. OGB-1) की 50 ग्राम की शीशी मिश्रण / Pluronic DMSO के 4 μl जोड़ें. फिर एक लाल रंग (Alexa Fluor 594, 2 मिमी स्टॉक समाधान) के 1 μl और विंदुक समाधान के 35 μl 1 मिमी OGB-1 AM की एक अंतिम एकाग्रता के लिए (सामग्री देखें) जोड़ने. में आधा घंटा के लिए समाधान Sonicateठंडा पानी स्नान और फिर एक 0.45 सुक्ष्ममापी अशुद्धियों को दूर करने के लिए फिल्टर के साथ अपकेंद्रित्र.
  2. 2.0-2.5 सुक्ष्ममापी की एक बाहरी टिप व्यास के साथ एक लंबे समय के शंकु विंदुक खींचो. विंदुक में डाई मिश्रण के 5 μl लोड.
  3. ड्यूरा की अंतिम परत के विंदुक प्रविष्टि की सुविधा और उच्चतम गुणवत्ता दो photon छवियों को प्राप्त निकालें.
  4. Cortical सतह पर सटीक स्थान है कि विंदुक क्रम में cortical परत 2/3 में अपने लक्ष्य तक पहुँचने के लिए रखा जाना चाहिए का निर्धारण करते हैं. हमारे पूर्व निर्धारित cortical लक्ष्य अभिविन्यास नक्शा (2 चित्रा) में एक pinwheel अपूर्वता है. विंदुक प्रांतस्था में एक 30 डिग्री कोण पर संचालित कक्ष दीवार और उद्देश्य के बीच पारित किया जाना चाहिए. इस प्रकार, cortical सतह के नीचे 200 मीटर लक्ष्य क्षेत्र लेबल, cortical सतह पर विंदुक प्रविष्टि स्थिति लगभग 350 लक्ष्य की स्थिति (3 चित्रा एबी) पार्श्व सुक्ष्ममापी होगा.
  5. XY मंच हटो (जिस पर जानवर और पीipette micromanipulator) उद्देश्य (चित्रा -3 सी) के तहत cortical सतह प्रविष्टि स्थिति केंद्र में रखा जाता है. कम से कम 3 मिमी (सामग्री देखें) करने के लिए सुनिश्चित करें कि विंदुक आसानी से craniotomy की दीवार के साथ उद्देश्य या हड्डी को छूने के बिना प्रांतस्था में प्रवेश करेंगे की एक काम दूरी (WD) के साथ एक 20x या 40x उद्देश्य का उपयोग. एक बार प्रविष्टि स्थिति उद्देश्य के तहत केंद्रित है, 2 मिमी (चित्रा 3 डी) द्वारा उद्देश्य के Z स्थिति बढ़ा. के साथ हरे रंग का प्रकाश महामारी प्रतिदीप्ति करने के लिए चालू विंदुक में लाल Alexa डाई कल्पना, micromanipulator की विकर्ण अक्ष का उपयोग करने के लिए विंदुक कदम जब तक अपनी टिप केंद्रित है और ध्यान केंद्रित cortical सतह प्रविष्टि की स्थिति के ऊपर सीधे उद्देश्य के तहत ( 3E चित्रा).
  6. विंदुक खड़ी (z अक्ष के साथ) कम जब तक विंदुक cortical सतह (3F चित्रा) तक पहुँच जाता है, जबकि लगातार ocu के माध्यम से विंदुक टिप को देखनेमाइक्रोस्कोप के लार्स. उज्ज्वल मैदान रोशनी का उपयोग, cortical सतह रक्त वाहिकाओं और शेष मस्तिष्कावरणीय झिल्ली (पिया और रेशेदार) आसानी से दिखाई विंदुक cortical सतह दृष्टिकोण हैं. यदि विंदुक इच्छित प्रविष्टि स्थिति तक पहुँच नहीं है, पिपेट बढ़ाने और cortical सतह पर संवहनी स्थलों पर आधारित लक्ष्यीकरण recalibrate.
  7. उद्देश्य निकालें, craniotomy से अतिरिक्त मस्तिष्कमेरु द्रव बाती और आसन्न हड्डी सूखी प्रकार का वृक्ष मुक्त अवशोषण भाले का उपयोग. प्रांतस्था कि craniotomy (चित्रा 3 जी) के माध्यम से दिखाई देता है को स्थिर करने के लिए गर्म 3% agarose (ACSF में भंग) की एक बूंद लागू करें. गैर कृन्तकों में, 3% agarose न्यूरॉन्स द्वारा फ्लोरोसेंट रंजक के सफल तेज pulsations गीला हो जाना आवश्यक है. आंतरिक संकेत ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए केवल 2% agarose क्योंकि 2% agarose और coverglass के संयोजन के लिए आवश्यक स्थिरता प्रदान करता है की जरूरत है. यहाँ, कोई कदम coverglass डाई लोडिंग के लिए प्रयोग किया जाता है तो 3% agarose हैआवश्यक है. बाद agarose जम गया है, एक 40x उद्देश्य डालने (0.8 एनए, 3.3 मिमी WD) और फिर से भरना ACSF साथ कक्ष.
  8. उज्ज्वल मैदान से दो photon देखने के लिए स्विच और विंदुक टिप का पता लगाने. Micromanipulator की विकर्ण अक्ष का उपयोग, पिपेट कदम जब तक इसकी टिप प्रांतस्था (चित्रा 3H) में वांछित गहराई तक पहुँचता है. डाई मिश्रण (एक कुछ साई, प्रत्येक नाड़ी 0.1 सेकंड) के समसामयिक दबाव इंजेक्शन puffs clogging से विंदुक टिप को रोकने में मदद मिलेगी. क्योंकि OGB-1 AM कोशिकाओं में प्रवेश करने पर केवल दृश्यमान हो जाता है, लाल Alexa डाई प्रांतस्था अंदर विंदुक टिप के दृश्य के लिए महत्वपूर्ण है.
  9. डाई की पूरी खुराक के साथ cortical परत 2/3 में न्यूरॉन्स को लोड करने के लिए, फिर से ध्यान केंद्रित cortical सतह पर उद्देश्य विंदुक टिप की गहराई की पुष्टि करने और यह सुनिश्चित करें कि टिप के लेआउट के आधार पर लक्ष्य स्थान में करने का प्रयास करने से पहले सतह रक्त वाहिकाओं. यदि विंदुक 2/3 परत में है, डाई मिश्रण के छोटे puffs रोशन करना चाहिएबाह्य अंतरिक्ष और अंधेरा छाया के रूप में परिपत्र सेल शरीर के एक घने विधानसभा प्रकट.
  10. प्रांतस्था 300-600 सुक्ष्ममापी व्यास के एक क्षेत्र में neuronal सेल निकायों को लोड करने के लिए, कोशिकी 30-90 दालों, प्रत्येक नाड़ी 1.0 सेकंड, 2-10 साई का उपयोग कर अंतरिक्ष में डाई मिश्रण इंजेक्षन. दबाव की दालों इतना मजबूत है कि ऊतक चालें नहीं होना चाहिए. इंजेक्शन के बाद पूरा हो गया है, कुछ मिनट रुको, तो विंदुक और उद्देश्य को हटा दें. 1 घंटा के लिए प्रतीक्षा करने के लिए अनुमति देते हैं OGB-1 न्यूरॉन्स द्वारा पूरी तरह से लिया.
  11. डाई लोड करने के लिए इस्तेमाल किया agarose निकालें और रिकॉर्डिंग कक्ष कुल्ला. 2-3% agarose की सतह पर एक छोटी सी बूंद रखो और जल्दी craniotomy से अधिक एक coverglass जगह. क्योंकि फ्लोरोसेंट रंजक प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं, उज्ज्वल मैदान या महामारी फ्लोरोसेंट रोशनी प्रांतस्था उजागर करने से बचें. उद्देश्य और xy मंच का उपयोग कर उद्देश्य के तहत फिर से केन्द्र लेबल cortical क्षेत्र धारक में एक उच्च NA (1.0) 20x उद्देश्य डालें. पूर्व से craniotomy शील्डtraneous प्रकाश स्रोतों, उदाहरण के लिए, दृश्य उत्तेजना प्रदर्शन, अंधकार सामग्री की कई परतों का उपयोग.

4. फ्लोरोसेंट रंगों के एकल कक्ष electroporation

  1. वृक्ष के समान आकारिकी के अध्ययन के लिए, 100 सुक्ष्ममापी Alexa Fluor 594 (2 मिमी Alexa Fluor 594 स्टॉक ACSF में कमजोर पड़ने 1:20) के समाधान तैयार. Dendrites के कार्यात्मक इमेजिंग के लिए एक OGB नमक 16,17 इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. 1 सुक्ष्ममापी की टिप के आकार के साथ एक लंबे समय के शंकु विंदुक खींचो और डाई के 5 μl विंदुक में लोड. एक कार्यात्मक डोमेन को लक्षित करने के अन्य सभी कदम थोक loading विधि (1-3 आंकड़े) समान हैं. Neuronal सेल शरीर झिल्ली निकट विंदुक टिप इलेक्ट्रोड प्रतिबाधा में वृद्धि पर नजर रखने और डाई दबाव puffs बाह्य अंतरिक्ष रोशन और दो photon इमेजिंग के दौरान छाया के रूप में सेल शरीर देख लागू.
  3. जब विंदुक टिप neuronal सेल शरीर झिल्ली निकट है, Axoporator 800A उपयोग करने के लिए लागू होते हैं1-3 दालों (-8 -10 वी, 10 मिसे नाड़ी). डाई के साथ न्यूरॉन के तत्काल भरने तत्काल दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ कल्पना है. विंदुक निकालें और vivo में और dendrites और axons की उच्च संकल्प छवियों इकट्ठा.

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Representative Results

हमारे डाई लेबलिंग तरीकों का सटीक वर्णन करने के लिए, हम छोटी neocortex गैर कृंतक में किसी भी ज्ञात कार्यात्मक नक्शे के सूक्ष्म डोमेन को निशाना बनाया. कम प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था में उन्मुखीकरण नक्शा भर punctuated singularities हैं. ये अंक है जहां सभी पसंदीदा झुकाव ऐसे एकाग्र होते हैं कि पसंदीदा अभिविन्यास, "pinwheels" (चित्रा 2A-B) की तरह अपूर्वता देखो के आसपास के क्षेत्रों के झूठे रंग नक्शे में. एक craniotomy प्रति pinwheel डाई लेबलिंग (चित्रा 2C में ग्रीन सर्कल) के लिए चुना जाता है, 15 विशेष रूप से बड़े जहाजों और arterioles से बचने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है. OGB-1 के थोक लदान के साथ, neuronal कैल्शियम सूचक प्रतिदीप्ति में परिवर्तन उन्मुख झंझरी दृश्य उत्तेजनाओं के एक दृश्य के लिए ट्रैकिंग एकल कोशिका pinwheel singularities के आसपास संकल्प कार्यात्मक नक्शे (4 चित्रा) से पता चलता है. एकल कोशिका electroporation dendrites और axons के स्थानिक संगठन के रूप में सेएक pinwheel अपूर्वता में स्थित चिमनी न्यूरॉन vivo (5 चित्रा) में निर्धारित किया जाता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. आंतरिक संकेत ऑप्टिकल इमेजिंग सेटअप (ए) पशु xy मंच और आंतरिक संकेत इमेजिंग पर तैनात है एक सीसीडी कैमरा दो photon माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार के माध्यम से किया जाता है. प्रकाश स्रोत और कंप्यूटर इमेजिंग सत्र को नियंत्रित करने के लिए प्रयोग किया जाता है पर आंतरिक इमेजिंग के लिए सेटअप करने के लिए लाया जाता है और दो photon इमेजिंग के चरण से पहले प्रयोग शुरू होता है दूर चले गए. (बी) 4x उद्देश्य और तरल प्रकाश गाइड के माध्यम से 630 एनएम रोशनी के दृश्य. या तो दो प्रकाश गाइड धातु पदों (बाएं) से जुड़ा है, या एक एकल रोशन अंगूठी सीधे उद्देश्य (सही) करने के लिए संलग्न किया जा सकता है. अंधकार सामग्री के लिए इस्तेमाल किया रोशनी के बाहरी स्रोतों से उद्देश्य ढाल, उदाहरण के लिए, ऑप्टिकल इमेजिंग सत्र के दौरान दृश्य प्रोत्साहन प्रदर्शन, नहीं दिखाया गया है. (सी) और पारंपरिक इमेजिंग विन्यास में दो photon प्रकाश पथ खुर्दबीन के योजनाबद्ध. पूरक अंजीर देखें. शेन एट अल में पूर्ण प्रकाश पथ के दो photon एक विवरण के लिए 20. +२०१२ 15. वापस लेने योग्य दर्पण dichroic के माध्यम से और प्रांतस्था पर लेजर से प्रकाश से ध्यान हटाने के लिए तैनात है. प्राथमिक dichroic, जो लेजर बीम गुजरता है और PMT के लिए प्रांतस्था से उत्सर्जित प्रकाश को दर्शाता है प्रकाश पथ में फिल्टर बुर्ज मोड़ द्वारा ले जाया जाता है. (डी) आंतरिक इमेजिंग के लिए दर्पण मुकर गया है और फिल्टर बुर्ज प्राथमिक dichroic रास्ते से बाहर स्थानांतरित कर दिया जाता है, एक प्रत्यक्ष प्रांतस्था से प्रकाश सीसीडी कैमरा पथ की अनुमति बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

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चित्रा 2
चित्रा 2. कार्यात्मक आंतरिक संकेत इमेजिंग के साथ प्राप्त करने के लिए फ्लोरोसेंट रंगों के साथ न्यूरॉन्स लेबल के लिए एक सूक्ष्म डोमेन का चयन नक्शे का उपयोग (ए) बिल्ली प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था से ओरिएंटेशन नक्शा आंतरिक संकेत ऑप्टिकल इमेजिंग के माध्यम से हासिल कर ली. प्रत्येक पिक्सेल का रंग उस स्थान पर पसंदीदा अभिविन्यास का प्रतिनिधित्व करता है. संभावित अभिविन्यास pinwheel फ्लोरोसेंट रंगों के साथ न्यूरॉन्स लेबलिंग के लिए उपयुक्त singularities काले घेरे के भीतर दिखाए जाते हैं. (बी) cortical सतह रक्त वाहिकाओं के नक्शा अभिविन्यास नक्शे के साथ मढ़ा. (सी) लाल हलकों के भीतर Pinwheels बड़े रक्त वाहिकाओं या arterioles के पास हैं और इसलिए हरी सर्कल के भीतर pinwheel साइट डाई लेबलिंग के लिए लक्ष्य के रूप में चुना है. धराशायी आयत चित्रा 3B में दिखाया क्षेत्र से मेल खाती है. 500 (ए) में स्केल और बारम्यू, एम.

चित्रा 3
चित्रा 3. फ्लोरोसेंट रंगों के साथ न्यूरॉन्स लोड करने के लिए विंदुक स्थान अनुकूलन (ए) योजनाबद्ध रिकॉर्डिंग कक्ष की ओर देखने से पता चलता है कि डाई लोड साइट दृश्य प्रांतस्था (लाल और सफेद सांड की आंख) में लक्षित करने के लिए cortical के नीचे ~ 200 सुक्ष्ममापी सतह. लक्ष्य के xy समन्वय एक अभिविन्यास pinwheel व्यक्तित्व के आंतरिक संकेत इमेजिंग से निर्धारित स्थान से मेल खाती है. विंदुक एक 30 डिग्री कोण पर प्रांतस्था में प्रवेश करेंगे. Cortical सतह XY मंच सतह के समानांतर है, पिपेट टिप laterally pinwheel अपूर्वता तक पहुँचने से पहले लगभग 350 सुक्ष्ममापी कदम होगा. (बी) रिकॉर्डिंग चैम्बर के शीर्ष दृश्य cortical सतह vasculature और विंदुक प्रविष्टि स्थिति वें (लाल सितारा) से पता चलता हैपर pinwheel अपूर्वता से 350 मीटर है. (सी) xy स्थिति चरण में निकाला जाता है कि विंदुक प्रविष्टि स्थिति 20x या 40x उद्देश्य (3.3-3.5 मिमी WD) के तहत केंद्रित है. (D) उद्देश्य ~ 2 मिमी उठाया है. (ई) विंदुक craniotomy पर लाया जाता है और इसकी टिप cortical सतह पर प्रवेश की स्थिति में हरे रंग का प्रकाश महामारी फ्लोरोसेंट का उपयोग सीधे ऊपर तैनात है. (एफ) विंदुक और उद्देश्य समवर्ती उज्ज्वल मैदान रोशनी का उपयोग कम कर रहे हैं जब तक cortical सतह रक्त वाहिकाओं ध्यान में आते हैं. (G) उद्देश्य और ACSF हटा रहे हैं और 3% agarose की एक बूंद craniotomy पर लागू किया जाता है. (एच) एक 40x उद्देश्य (एनए 0.8, 3.3 मिमी WD) के साथ दो photon दृश्य विंदुक नीचे का पालन चुना cortical गहराई और डाई इंजेक्षन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. और z-श्रृंखला डेटा है कि न्यूरॉन्स सफलतापूर्वक NA 20x उद्देश्य (1.0 एनए, 2.0 मिमी WD) फ्लोरोसेंट रंजक, आम तौर पर, एक उच्च के साथ लेबल की पुष्टि के बाद दो photon लेने के लिए इस्तेमाल किया जाता है. ढांच के रूप में एक में दिखाया गया है, CH पैमाने पर करने के लिए तैयार नहीं कर रहे हैं.

चित्रा 4
चित्रा 4. दो photon और आंतरिक संकेत इमेजिंग कार्यात्मक नक्शे में उन्मुखीकरण वरीयता के पत्राचार (ए) दो photon imaged सेल निकायों OGB-1 के साथ लेबल दिखाने क्षेत्र AM दृश्य प्रांतस्था परत 2/3 में. (बी) व्यक्ति एक ही साइट से neuronal सेल निकायों की ओरिएंटेशन वरीयता (ए) में दिखाया गया है. Pinwheel अपूर्वता कि imaged क्षेत्र में केंद्रित था वरीय प्रोत्साहन उन्मुखीकरण के एक संगठित नक्शे के आसपास है. (सी) अभिविन्यास नक्शा आंतरिक संकेत इमेजिंग के साथ प्राप्त की. काले वर्ग (बी) में दिखाया गया है क्षेत्र के लिए मेल खाती है. इन आंकड़ों 2A सी और 3B आंकड़े में दिखाया प्रयोग से प्राप्त किया गया. (एबी) 100 सुक्ष्ममापी और (सी) 500 सुक्ष्ममापी में स्केल बार.

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एक अभिविन्यास pinwheel अपूर्वता पर एक न्यूरॉन के vivo morphology में 5 चित्रा. (ए) और सेल शरीर में एक न्यूरॉन dendrites अभिविन्यास नक्शे के साथ ही दृश्य cortical साइट से मढ़ा. न्यूरॉन Alexa Fluor 594 के साथ दो photon मार्गदर्शन के तहत electroporated किया गया था, एक z-ढेर vivo में एकत्र किया गया था, और वृक्ष के समान प्रक्रियाओं ऑफ़लाइन पता लगाया Neurolucida सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रहे थे. अभिविन्यास नक्शा एकल कोशिका electroporation से पहले आंतरिक संकेत इमेजिंग का उपयोग कर प्राप्त किया गया था. (बी) के औसत तीव्रता cortical परत 1 से 10 सुक्ष्ममापी-z प्रक्षेपण शिखर dendrites से पता चलता है. (सीडी) औसत तीव्रता 10 सुक्ष्ममापी z-अनुमानों cortical परत 2/3 दिखाएँ बेसल dendrites और axons से. लाल तीर dendrites और सफेद तीर व्यक्ति axons इंगित साथ spines दिखाते हैं. (ई.) 100 सुक्ष्ममापी में स्केल सलाखों.

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Discussion

Neuronal सेल निकायों (या dendrites और axons) पूर्व निर्धारित neocortex के कार्यात्मक सूक्ष्म डोमेन में लेबलिंग को लक्षित करने के लिए एक तरीका मौजूद है. दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ आंतरिक संकेत ऑप्टिकल इमेजिंग विलय का निर्धारण करने की संभावना है जो synapses और कोशिकाओं को किसी भी कार्य नक्शे के डोमेन सूक्ष्म योगदान प्रदान करता है, चाहे एक कार्यात्मक नक्शे में न्यूरॉन के स्थान, और neuronal सर्किट के साथ neuronal चयनात्मकता संबद्ध घटक दृश्य 7 अनुभव या चिकित्सकीय चिकित्सकीय 18 दवाओं के आवेदन के साथ कि परिवर्तन.

प्रोत्साहन अभिविन्यास, दिशा, आंख का प्रभुत्व, या द्विनेत्री असमानता के लिए कोई नक्शे वयस्क जंगली प्रकार 6,19-21 कृन्तकों के दृश्य प्रांतस्था में सूचित किया गया है. हालांकि, फ्लोरोसेंट रंगों के साथ न्यूरॉन्स लोड हो रहा है और इमेजिंग स्थिरता प्राप्त करने, शक्तिशाली आनुवंशिक चूहों के लिए उपलब्ध उपकरणों के साथ एक साथ आसानी अध्ययन के विशाल बहुमत में बदल गया हैका उपयोग कर मस्तिष्क के बजाय कृन्तकों ferrets, बिल्लियों, और बंदरों में प्रदर्शन किया जा रहा है प्रांतस्था के दो photon इमेजिंग.

उच्च संकल्प गैर कृंतक स्तनधारियों में न्यूरॉन्स की दो photon इमेजिंग बहुत ही चुनौतीपूर्ण लंबी सर्जरी बार, मोटा हड्डी और ड्यूरा, और अतिरिक्त एक न्यूनतम 15 मस्तिष्क के श्वसन और हृदय मध्यस्थता pulsations रखने के लिए आवश्यक कदम की वजह से हो सकता है. सर्जरी से आंतरिक संकेत इमेजिंग और दो photon इमेजिंग आंतरिक बदलाव करने के लिए कुशल हो, अभिकर्मकों, रंजक, और सूक्ष्म शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के निष्पादन की समय पर तैयारी की आवश्यकता की जरूरत है. आंतरिक संकेत इमेजिंग के लिए प्रयोग दो photon माइक्रोस्कोप पारंपरिक आंतरिक संकेत ऑप्टिकल इमेजिंग 22 रिसाव में इस्तेमाल और बाद इमेजिंग दो photon आंतरिक इमेजिंग और संक्रमण की स्थापना के लिए आवश्यक समय कम कर देता है उपकरणों के लिए बहुत जरूरत obviates.

हमारा दृष्टिकोण विशेष रूप से उच्च संकल्प दो फोटो उपलब्ध कराने के लिए बनाया गया हैपूर्व निर्धारित कार्यात्मक डोमेन टन इमेजिंग. यह neuronal सेल निकायों, और व्यक्तिगत वृक्ष के समान spines और axons के बीच कार्यात्मक संकेतों के कम से कम पार बात vivo में हल किया जा सकता है प्रदान करता है. एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (NA 1.0 =) उद्देश्य का उपयोग और बीम विस्तार प्रकाशिकी (पूरक छवि देखते हैं 20 शेन एट अल. में., 15 2012) के साथ के उद्देश्य से वापस एपर्चर भरने उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं. XY और / या Z में इमेजिंग की गति पर निर्भर करता है, श्वसन और हृदय pulsations प्रभावी संकल्प इमेजिंग चाहे कितना अच्छा एनए और ऑप्टिकल प्रकाश पथ को कम कर सकते हैं. 2 x 2 मिमी गैर कृन्तकों में craniotomy आकार सीमित, coverglass साथ agarose के अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता का उपयोग करते हुए, और एक वातिलवक्ष और काठ का निलंबन प्रदर्शन जब आवश्यक 15, मस्तिष्क pulsations 1-2 सुक्ष्ममापी करने के लिए सीमित कर रहे हैं. थोक के दौरान 1-2 सुक्ष्ममापी neocortex की श्वसन और हृदय प्रेरित pulsations न्यूनतमकैल्शियम संकेतकों की लोडिंग भी सुनिश्चित करता है कि प्रांतस्था डाला विंदुक के चारों ओर एक तंग सील रूपों और कोई डाई विंदुक cortical सतह जूते के तल्ले का मध्य भाग के साथ पटरियों कि. डाई इंजेक्शन और इमेजिंग साइटों का चयन बड़ी arterioles से दूर भी उच्च गुणवत्ता कार्यात्मक इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि अपेक्षाकृत तेजी संवेदी पैदा hyperemia कलाकृतियों (hemodynamic) 15 बाहर रखा जाएगा.

Craniotomy साइट ड्यूरा की अंतिम परत आंतरिक संकेत इमेजिंग और फ्लोरोसेंट डाई तैयारी चरणों में बरकरार छोड़ने - इस प्रकार यह डाई लोड करने के लिए प्रांतस्था में विंदुक प्रविष्टि से पहले हटाने निम्नलिखित में सफलता दर और neuronal लेबलिंग के गुणवत्ता बढ़ जाती है तरीके: (1) cortical सतह रहता स्वच्छ और / या रोकता है dural ऊतक regrowth कि विंदुक टिप कम करने के लिए रुकावट पैदा हो जाने की संभावना है और ऊतकों की पारदर्शिता बनाए रखा है, (2) agarose आंतरिक इमेजिंग स्पर्श के लिए इस्तेमाल होने से बचा जाता है कॉर्टराजनैतिक सतह रक्त वाहिकाओं जो क्षतिग्रस्त हो सकती है जब agarose निकाल दिया जाता है, (3) agarose craniotomy के किनारों के आसपास खोपड़ी के नीचे ड्यूरा और प्रांतस्था के बीच में प्रवेश करने से आंतरिक इमेजिंग के दौरान इस्तेमाल किया रोकता है. Agarose coverglass और cortical सतह जो अधिक मुश्किल विंदुक की प्रविष्टि बनाता के बीच दूरी बढ़ाने के लिए इन क्षेत्रों में, cortical ऊतक के संपीड़न के लिए होता है और इमेजिंग के लिए पारदर्शिता को कम कर देता है.

जब की तैयारी थोक लोड करने के लिए फ्लोरोसेंट रंजक AM, 20% Pluronic / DMSO मिश्रण 1 सप्ताह से परे अपनी प्रारंभिक तैयारी से इस्तेमाल कभी नहीं किया जाना चाहिए - पुराने Pluronic / DMSO प्रतिदीप्ति quenches. कई एक कार्यात्मक सूचक, उदाहरण के लिए, OGB-1 के साथ सटे सेल निकायों की इष्टतम थोक लोड करने के लिए, डाई मिश्रण बर्फ पर संग्रहीत किया जाता है, विंदुक में लोड के रूप में की जरूरत है, लेकिन हमेशा इसकी तैयारी के 2 घंटे के भीतर दिमाग में इंजेक्शन.

थोक लदान के चरण के दौरानप्रयोग की अनुमति देता है, 1 1 मिनट के दबाव की एक सतत इंजेक्शन के बजाय सेकंड दालों दोहराया चलने का के लिए इंजेक्शन मापदंडों का अंशांकन है, जो यह सुनिश्चित करता है कि अत्यधिक डाई या दबाव नहीं लागू किया जाता है. एकाधिक विंदुक सम्मिलन और इस तरह के कई इंजेक्शन की एक श्रृंखला से Pluronic / DMSO की बड़ी मात्रा में से संभावित विषाक्तता के ऊतकों के बहुत बड़े क्षेत्रों लेबल के लिए जरूरत से संभावित ऊतकों को नुकसान के कारण, हम एक 300-600 सुक्ष्ममापी 2 2 x प्रति डाई इंजेक्शन साइट पसंद करते हैं मिमी craniotomy. अंधा 14 इंजेक्शन, रक्त वाहिकाओं, neuronal सेल निकायों के नकारात्मक विपरीत का उपयोग करने के लिए लामिना की स्थिति को निर्धारित करने और कोशिकाओं है कि हो जाएगा की मात्रा का एक सूचकांक के रूप में दबाव इंजेक्शन पर डाई प्रसार gauging के आसपास दो photon नेत्रहीन निर्देशित नेविगेशन की तुलना में OGB-1 के साथ लेबल, गैर कृंतक तैयारी में डाई लोड हो रहा है की गुणवत्ता में सुधार.

प्रोटोकॉल हम यहाँ का वर्णन राल में फ्लोरोसेंट रंगों साथ न्यूरॉन्स के सफल लेबलिंग करने के लिए सुरागहर जानवर में geted सूक्ष्म डोमेन का प्रयास किया. AM OGB-1 के साथ थोक लदान के लिए, हम लगातार एक साथ imaged 9,15 न्यूरॉन्स के 75-100% में नेत्रहीन पैदा प्रतिसाद प्राप्त और तकनीक 23,24 vivo में एकल कार्रवाई की क्षमता का पता लगाने के लिए संवेदनशील है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

चित्रा 5A में दिखाया dendrites अनुरेखण के लिए अनुग्रह डायोन, यह काम राष्ट्रीय नेत्र संस्थान R01EY017925 और R21EY020985 और दाना और व्हाइटहॉल मूलाधार से पीके के लिए धन हम भी शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं के साथ सहायता के लिए धन्यवाद मैथ्यू Petrella से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया और प्रतीक के लिए Chhatbar पांडुलिपि पर टिप्पणी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Life support/experiment prep
Isoflurane Webster Vet NDC 57319-474-05
Isoflurane vaporizer Midmark VIP 3000
Feedback regulated heating blanket Harvard Apparatus 50-7079F
ECG monitor Digicare Biomedical LifeWindow Lite
EEG amplifier A-M Systems 1800
EEG display monitor Hewlett Packard 78304A
End tidal CO2 monitor Respironics Novametrix Capnoguard 1265 Optimize ventilation
Carbide drill burrs for drilling bone Henry Schein fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip)
Cement for headplate/chamber Dentsply 675571, 675572
Black Powder Tempera Paint Sargent Art Inc. 22-7185 Add to cement to improve light shielding and reduce reflections
Agarose - Type III-A Sigma A9793 For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging
Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness World Precision Instruments 502040, 502041 For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed
Brudon curettes George Tiemann 105-715-0, 105-715-3 Cleaning skull surface
Bone wax Ethicon W31G Quickly stop bleeding
Cotton Tipped Applicator Electron Microscopy Sciences 72308-05 Clean and dry bone surface
Dumont #5CO Forceps Fine Science Tools 11295-20 Grab individual layers of dura or pia
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03 Cut dura
Gelfoam Pfizer 09-0396-05 To stop bleeding on the dura
Absorption spears Fine Science Tools 18105-01 Ultra-fast and lint-free wicking of CSF
Blackout material Thorlabs BK5 Shield craniotomy
2. Dye preparation / injection
Dimethyl Sulphoxide (DMSO) Sigma D2650
Pluronic Sigma P2443
Oregon Green 488 Bapta-1 AM Invitrogen O6807 Calcium indicator
Alexa Fluor 594 Invitrogen A10438
Centrifugal filter (0.45 μm pore size) Millipore UFC30HV00 To remove impurities before injection
Glass pipette puller Sutter Instruments P97
Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) World Precision Instruments 1B150F-4 Dye ejection pipette
Microloader Eppendorf 5242 956 003 For loading dye into pipette
Micromanipulator Sutter Instruments MP-285 To position pipette
Pressure pulse controller Parker Hannifin PicoSpritzer III For pressure injection of the dye
Single-cell electroporator Molecular Devices Axoporator 800A For electroporation of the dye
3. Intrinsic imaging
4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) Olympus UPLFLN4X
Intrinsic hardware / software Optical Imaging Inc. Imager 3001 / VDAQ VDAQ software is used for episodic imaging
CCD Camera Adimec Adimec-1000
Light source power supply KEPCO ATE 15-15M
Light source Optical Imaging Inc. HAL 100 Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW
Green filter (for vascular image) Optical Imaging Inc. λ = 546 nm (bandpass 30 nm) For reference image of surface vasculature
Red filter (for intrinsic signal) Optical Imaging Inc. λ = 630 nm (bandpass 30 nm) To collect intrinsic signals
Heat filter Optical Imaging Inc. KG-1
4. Two-photon rig/imaging
Two-photon microscope and software Prairie Technologies See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power
Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai XF
20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) Olympus UMPLFLN20X 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging)
20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) Olympus XLUMPLFLN20X
40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) Olympus LUMPLFLN40X/IR
Air table Newport ST-200 Isolates preparation from external vibrations
xy stage Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA) Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage
Recipes
Artificial Cerebro-Spinal Fluid NaCl (135 mM), KCl (5.4 mM), MgCl2 (1.0 mM), CaCl2 (1.8 mM), HEPES (5 mM), pH 7.4
Pipette Solution14 NaCl (150 mM), KCl (2.5 mM), HEPES (10 mM), pH 7.4

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References

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O'Herron, P., Shen, Z., Lu, Z., Schramm, A. E., Levy, M., Kara, P. Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging. J. Vis. Exp. (70), e50025, doi:10.3791/50025 (2012).

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