Summary
Een werkwijze wordt beschreven voor het labelen neuronen met fluorescente kleurstoffen in voorafbepaalde functionele micro-domeinen van de neocortex. Eerst wordt intrinsieke optisch imaging gebruikt om een functionele kaart te verkrijgen. Dan twee-foton microscopie wordt gebruikt om het etiket en beeld neuronen binnen een micro-domein van de kaart.
Abstract
In de primaire visuele cortex van de niet-knaagdier zoogdieren, worden neuronen geclusterd op basis van hun voorkeur voor stimuli functies zoals oriëntatie 1-4, richting 5-7, oculaire dominantie 8,9 en binoculaire dispariteit 9. Oriëntatie selectiviteit is de meest bestudeerde functie en een doorlopende kaart met een quasi-periodieke lay-out voor de gewenste oriëntatie aanwezig is in de gehele primaire visuele cortex 10,11. Integratie van de synaptische, cellulaire en netwerk bijdragen die leiden tot stimulans selectieve reacties in deze functionele kaarten vereist de hybridisatie van beeldvormende technieken die sub-micron overspannen millimeter ruimtelijke schalen. Bij conventionele intrinsieke signaal optische, kan de algemene indeling van functionele kaarten over het gehele oppervlak van de visuele cortex bepaald 12. De ontwikkeling van in vivo twee-foton microscopie met calcium gevoelige kleurstoffen laat toe bepalen synaptic-ingang te komen tot individuele dendritische spines 13 of een recordaantal activiteiten tegelijkertijd uit honderden individuele neuronale cellichamen 6,14. Bijgevolg combineert intrinsieke signaal beeldvorming met de sub-micron ruimtelijke resolutie van twee-foton microscopie biedt de mogelijkheid om een precies welke dendritische cellen segmenten en bijdragen aan de micro-domein van elke functionele kaart in de neocortex. Hier laten we zien een hoge opbrengst methode voor het snel verkrijgen van een corticale oriëntatie kaart en tot een specifieke micro-domein in deze functionele kaart voor het labelen neuronen met fluorescente kleurstoffen in een niet-knaagdier zoogdier. Met dezelfde microscoop gebruikt voor twee-foton beeldvorming, maken we eerst een oriëntatie kaart met behulp van intrinsieke signaal optische beeldvorming. Vervolgens laten we zien hoe je een micro-domein van belang het gebruik van een micropipet geladen met kleurstof om ofwel label richten op een bevolking van neuronale cellichamen of label van een enkel neuron zodanig dat dendrieten, stekels en axonen zijn zichtbaar invivo. Onze verfijningen ten opzichte van eerdere methoden vergemakkelijken onderzoek van neuronale structuur-functie relaties met subcellulaire resolutie in het kader van neocorticale functionele architecturen.
Protocol
1. Chirurgische Voorbereiding
- Laten anesthesie en permanent toezicht op de hartslag, eindigen getijden CO 2, EEG, en de temperatuur. Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Medische Universiteit van South Carolina en waren gebaseerd op die we eerder gepubliceerde 9,15.
- Maak de dorsale oppervlak van de schedel door het snijden van de huid met een scalpel. Prepareer het bindweefsel bovenop het bot met behulp van een Brudon curette. Reinig het bot met behulp van katoen getipt applicators en een gaasje. Breng bot was (indien nodig) naar de schedel, af en toe bloeden te stoppen door kleine afgezant aderen.
- Bevestig een titanium of roestvrij staal kopplaat de schedel (over het gebied waar de craniotomie worden uitgevoerd) met tandheelkundig cement gemengd met zwarte verf (zie Materialen). Een rechthoekige opening in het midden van de kopplaat geeft toegang tot de craniotomie en optische. Bevestig een metalen kamer bovenop de kopplaat. Deze kamer dient als vloeistofreservoir voor beeldvorming met water immersie objectief.
- Bevestig de kopplaat op een xy tafel met metalen palen.
- Dunnen een groot deel van het bot in de rechthoekige opening van de kopplaat door een tandartsboor. Het gebied dat moet worden uitgedund moet zich uitstrekken tot ver buiten de grenzen van de geplande craniotomie. De dikke schedel van knaagdieren zoogdieren moet verdund als hoge-resolutie beelden worden verkregen van de neocortex omdat bij de craniotomie site, de dikte van bot zal de dikte van de agarose bepalen tussen het dekglaasje en neocorticale oppervlak (zie hieronder) .
- Boor een 2 x 2 mm vierkante omtrek in het bot de craniotomie. Periodiek Spoel de kamer met verse kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) aan het bot scherven te verwijderen en het minimaliseren van de warmteafvoer van de onderliggende cortex. Breng bot was als nodig is, om af en toe bloeden te stoppen.
- Lift het bot flap met een # 3 tang.
- Verwijder alles behalve de onderste laag van dura met een fijn pincet (# 5CO) en Vannas lente schaar. De dura in knaagdieren zoogdieren dik en ondoorzichtig maar kan worden verwijderd in verschillende lagen. Bloeden is zeldzaam, maar kan worden gestopt met Gelfoam en eventuele bloedresten moet voorzichtig worden verwijderd van de overblijvende laag dura behulp van een tang en spoelen met ACSF. De laatste laag dura is transparant en pial vaartuigen duidelijk zichtbaar doorheen. Het verlaten van deze laatste laag van dura intact tijdens een intrinsiek signaal beeldvorming zal de slaagkans van laden van bulkgoederen fluorescerende calcium indicatoren voor de daaropvolgende twee-foton beeldvorming fase van het experiment (zie Discussie).
- Breng een druppel van warme 2% agarose (opgelost in ACSF) en onmiddellijk een dekglaasje plaats over de craniotomie. Controleer de craniotomie opdat respiratoire en cardiovasculaire pulsaties minimaal zijn middels een chirurgische dissectiemicroscoop of de lenzen van de twee-foton microscoop in bright-field-modus.
2. Intrinsieke Signal Optical Imaging
- Voeg gel-schuim doordrenkt met ACSF rond de buitenkant van de coverglass de agarose uitdroogt tijdens intrinsieke signaal imaging.
- Bevestig de intrinsieke signaal imaging CCD camera de standaard C-mount poort aan de bovenzijde van de twee-foton microscoop (Figuur 1). Plaats de belichtingslichtbron de lucht tafel bij de kruistafel (Figuur 1A). Positioneer en bevestig de lichtgeleiders over de craniotomie en gitaarkop plaat / kamer (Figuur 1B). Zodat Schuif de primaire dichroïsche spiegel en onder de C-mount poort die gereflecteerd rood licht nodig voor intrinsieke signalen rechtstreeks overgaan van de craniotomie de CCD camera (figuur 1C-D). Met behulp van de 4x lucht doelstelling (0,13 NA, 17 mm WD), een 2 x 2 mm gezichtsveld is beschikbaar voor intrinsieke signaal beeldvorming.
- Plaats een warmte filter in de light pad naar de cortex voorkomen verwarming. Gebruik een filter dat groen licht (546 nm centrum λ) en neem een digitale referentiebeeld van de corticale oppervlak bloedvaten passeert.
- Verplaats de aandacht z tot 500 urn onder het corticale oppervlakte. Een rood filter (630 nm center λ) de cortex verlichten meten intrinsieke signalen. Plaats de lichtgeleiders zodanig dat de corticale oppervlak gelijkmatig verlicht. Scherm de craniotomie van het licht geproduceerd door de visuele stimulus display. Presenteer een opeenvolging van visuele stimuli en opnemen reflectie gegevens beelden. Een oriëntatie kaart binnen 10 min genereren verzamelen overeenkomend met 4 herhalingen van een sequentie van 8 stimuli (4 oriëntaties en twee richtingen voor elke oriëntatie).
- Analyseer de intrinsieke signaal gegevens naar een valse kleuren oriëntatie kaart te genereren. Selecteer potentieel doelwit regio's voor twee-foton etikettering van neuronen, bijvoorbeeld oriëntatie pinwheel singulariteiten - punten in de kaart waaralle preferente oriëntaties convergeren (Figuur 2A). Overlay de oriëntatie kaart en het beeld van de corticale oppervlak vaatstelsel (Figuur 2B-C). Gebruik de indeling van functionele domeinen en de locatie van grote oppervlakteschepen selecteren van een doel, het vermijden plaatsen met grote bloedvaten en arteriolen 15.
3. Bulk Laden van TL-Calcium-indicatoren
- Bereid een oplossing van 20% Pluronic / DMSO door 1 g Pluronic in 5 pi DMSO. Verwarm het mengsel op 60 ° C gedurende 10 min om volledig op te lossen Pluronic. Laat het mengsel afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg 4 pi van het Pluronic / DMSO mengsel in een 50 ug flesje met fluorescente calcium indicator Oregon Green 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). Voeg 1 pl van een rode kleurstof (Alexa Fluor 594, 2 mM stock-oplossing) en 35 pi pipetoplossing (zie Materialen) voor een eindconcentratie van 1 mM OGB-1 uur. Sonificeer de oplossing voor ½ uur ineen waterbad gekoeld en centrifugeer met een 0,45 urn filter om onzuiverheden te verwijderen.
- Trek een lange taps pipet met een buitendiameter tip diameter van 2,0-2,5 micrometer. Plaats 5 pl van het kleurstofmengsel in de pipet.
- Verwijder de laatste laag aan dura pipet insertie en het verkrijgen van de hoogste kwaliteit beelden twee-foton.
- Bepaal de identificatie op de corticale oppervlak dat de pipet worden geplaatst om zijn doel in corticale laag 2/3. De vooraf bepaalde corticale doel een pinwheel singulariteit in de richting kaart (Figuur 2). De pipet wordt gedreven in de cortex op een hoek van 30 ° te geven tussen de kamerwand en het doel. Dus de doelregio 200 urn onder het corticale oppervlak label, wordt de pipet invoerpositie aan de corticale oppervlak ongeveer 350 urn dwars op de beoogde positie (Figuur 3 AB).
- Verplaats de kruistafel (waarop het dier en de pipette micromanipulator worden geplaatst) om naar het midden van de corticale oppervlak invoerpositie onder de doelstelling (figuur 3C). Gebruik een 20x of 40x objectief met een werkafstand (WD) van ten minste 3 mm (zie materialen), zodat de pipet gemakkelijk de cortex voeren zonder het doel of het been langs de wand van de craniotomie. Zodra de invoerpositie wordt gecentreerd onder de doelstelling, verhogen de Z-positie van het doel met 2 mm (figuur 3D). Met de groene epi-fluorescentie ingeschakeld om de rode Alexa kleurstof zichtbaar in de pipet, met de diagonale as van de micromanipulator de pipet bewegen totdat de punt is gericht (en gericht) onder het objectief direct boven de corticale oppervlak invoerpositie ( figuur 3E).
- Laat de pipet verticaal (langs de z-as) tot de pipet bereikt het corticale oppervlak (figuur 3F), terwijl continu het bekijken van de pipetpunt via de OCUlars van de microscoop. Met behulp van bright-field verlichting, de corticale oppervlak bloedvaten en de resterende meningeale membranen (pia en arachnoidea) zijn goed zichtbaar als de pipet het corticale oppervlak benadert. Als de pipet niet bereikt het gewenste item positie, breng de pipet en opnieuw te kalibreren richten op basis van de vasculaire monumenten op het corticale oppervlak.
- Verwijder de doelstelling, lont overmatig hersenvocht uit de craniotomie en droog de aangrenzende bot met behulp van niet-pluizend absorptie speren. Breng een druppel warm 3% agarose (opgelost in ACSF) de cortex dat zichtbaar is door de craniotomie (Figuur 3G) stabiliseren. In niet-knaagdieren, 3% agarose moet pulsaties temperen voor succesvolle opname van fluorescerende kleurstoffen door neuronen. Voor intrinsieke optisch imaging slechts 2% agarose is nodig omdat de combinatie van 2% agarose en de coverglass de noodzakelijke stabiliteit. Hier wordt geen coverglass gebruikt voor het kleurstof-beladingsstap zodat 3% agarosenodig. Nadat de agarose is gestold, plaatst u een 40x objectief (0,8 NA, 3,3 mm WD) en opnieuw te vullen de kamer met ACSF.
- Overschakelen van de bright-field tot twee-foton bekijken en zoek de pipetpunt. Met de diagonale as van de micromanipulator, verplaatst de pipet totdat de punt op de gewenste diepte in de cortex (Figuur 3H). Af en toe druk uitwerpen rookwolken van de kleurstof mengsel (een paar psi, elke puls 0,1 sec) zal helpen voorkomen dat de pipetpunt verstopt raakt. Omdat OGB-1 uur alleen zichtbaar bij binnenkomst cellen, de rode Alexa kleurstof is essentieel voor visualisatie van de pipetpunt in de cortex.
- Alvorens tot neuronen in corticale Layer 2/3 geladen met de volledige dosis van kleurstof, opnieuw richten van de doelstelling op de corticale oppervlakte om de diepte van de pipetpunt bevestigen en de tip in de doellocatie op basis van de indeling van waarborgen oppervlak bloedvaten. Als de pipet in laag 2/3, moeten kleine pufjes van het kleurstofmengsel verlichten deextracellulaire ruimte en onthullen een dichte montage van ronde cellichamen als donkere schaduwen.
- Voor het laden van neuronale cellichamen in een sfeer van cortex 3-600 micrometer diameter, injecteren de kleurstof mengsel in de extracellulaire ruimte met 30 tot 90 pulsen, elke puls 1,0 sec, 2-10 psi. De pulsen van druk niet zo groot zijn dat het weefsel beweegt. Na de injectie is voltooid, een paar minuten wachten, en verwijder de pipet en objectief. Wacht 1 uur om de OGB-1 uur tot volledig overgenomen-up door neuronen.
- Verwijder de agarose voor de kleurstof laden en spoel de opname kamer. Doe een kleine druppel van 2-3% agarose op het oppervlak wordt snel een dekglaasje over de craniotomie. Omdat de fluorescente kleurstoffen zijn lichtgevoelig, voorkomen overbelicht de cortex bright-field of epi-fluorescent licht. Plaats een hoge NA (1,0) 20x objectief in de objectieve houder en opnieuw centreren de gelabelde corticale regio onder de doelstelling met behulp van de xy tafel. Scherm de craniotomie van extraneous lichtbronnen, bijvoorbeeld visuele stimulus display, met behulp van meerdere lagen van black-out materiaal.
4. Eencellige Elektroporatie van fluorescerende kleurstoffen
- Voor het bestuderen van dendritische morfologie, een oplossing van 100 uM Alexa Fluor 594 (1:20 verdunning in ACSF van 2 mM Alexa Fluor 594 voorraad). Voor functionele beeldvorming van dendrieten een OGB zout kan worden gebruikt 16,17.
- Trek een long taper pipet met een tip grootte van 1 pm en laden 5 pi kleurstof in de pipet. Alle andere stappen van het richten een functioneel domein identiek zijn met de bulk laadmethode (figuren 1-3). Om de pipetpunt naast een neuronale cellichaam membraan positioneren, toezicht op de toename van de impedantie van de elektrode en oefen druk pufjes van de kleurstof naar de extracellulaire ruimte te verlichten en te zien cellichamen als schaduwen in de loop van twee-foton beeldvorming.
- Wanneer de pipetpunt grenst aan een neuronale cel lichaam membraan met de Axoporator 800A toepassing1 tot 3 pulsen (-8 t -10 V, 10 msec puls). De onmiddellijke vullen van de neuron met kleurstof gemakkelijk gevisualiseerd met twee-foton microscopie. Haal de pipet en het verzamelen van beelden met hoge resolutie van dendrieten en axonen in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de precisie van onze dye labeling methoden illustreren, gericht op de kleinste micro-domein van elke bekende functionele kaart in de knaagdieren neocortex. Dun doorspekt het hele oriëntatie kaart in de primaire visuele cortex zijn singulariteiten. Deze komen op de plaatsen waar alle gewenste richtingen samenkomen, zodanig dat in valse kleuren kaarten van voorkeursrichting, de regio's rond de singulariteit eruit "pinwheels" (Figuur 2A-B). Een pinwheel per craniotomie is geselecteerd voor kleurstof etikettering (groene cirkel in figuur 2C), en zorg ervoor dat grote schepen en arteriolen vermijdt in het bijzonder 15. Met bulk-loading van OGB-1 AM, het bijhouden van veranderingen in neuronale calcium indicator fluorescentie om een reeks van gerichte rooster visuele stimuli onthult eencellige resolutie functionele kaarten rond pinwheel singulariteiten (figuur 4). Met eencellige elektroporatie, de ruimtelijke organisatie van dendrieten en axonen van zoingle neuron gelegen op een pinwheel singulariteit wordt bepaald in vivo (figuur 5).
Figuur 1. Intrinsieke optisch imaging setup. (A) Het dier wordt op de kruistafel en intrinsieke signalen beeldvorming wordt uitgevoerd via een CCD camera gemonteerd op de twee-foton microscoop. De lichtbron en de computer gebruikt om de opnamesessie controle worden gebracht naar de setup voor intrinsieke beeldvorming en bewogen weg voordat de twee-foton beeldvorming fase van het experiment begint. (B) Close-up van de 4x doelstelling en de 630 nm verlichting door middel van vloeibare lichtgeleiders. Hetzij twee lichtgeleiders aan metalen palen (links) of een lichtdoorlatende ring bevestigd direct de doelstelling (rechts) worden gebruikt. Blackout materiaal waaruit beschermen doel van externe bronnen van verlichting, wordt bijvoorbeeld visuele stimuli display, bij optische beeldvorming sessies, niet getoond. (C) Schematische voorstelling van de microscoop en het licht weg in de conventionele twee-foton beeldvorming configuratie. Zie Aanvullende Fig. 20 in Shen et al.. 2012 15 voor een beschrijving van het volledige twee-foton lichtweg. De intrekbare spiegel geplaatst om het licht van de laser afbuigen door de dichroïsche en op de cortex. De primaire dichroitische, waarbij de laserbundel en weerspiegelt het uitgezonden licht van de cortex van de PMT's wordt bewogen in de lichtweg door het filter turret. (D) Voor intrinsieke beeldvorming van de spiegel wordt ingetrokken en het filter torentje wordt gedraaid naar de primaire dichroic te verplaatsen uit de weg, waardoor een direct licht pad van de cortex naar de CCD-camera. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Met functionele kaarten verkrijgbaar intrinsieke signaal imaging een micro-domein voor het labelen neuronen met fluorescerende kleurstoffen te selecteren. (A) Oriëntatie kaart van cat primaire visuele cortex verkregen via intrinsieke optisch imaging. De kleur van elke pixel vertegenwoordigt de voorkeursoriëntatie op die locatie. Potentiële oriëntatie pinwheel singulariteiten geschikt voor het labelen van neuronen met fluorescente kleurstoffen worden weergegeven in zwarte cirkels. (B) De kaart van corticale oppervlak bloedvaten bedekt met de oriëntatie kaart. (C) Pinwheels binnen rode cirkels zijn de buurt van grote bloedvaten of arteriolen en dus de pinwheel site binnen de groene cirkel wordt gekozen als de doelstelling voor kleurstof etikettering. De gestippelde rechthoek correspondeert met de, figuur 3B. Scale bar in (A) 500 μ m.
Figuur 3. Het optimaliseren van de pipet plaatsing voor laden neuronen met fluorescerende kleurstoffen. (A) Schematische zijaanzicht van de opname kamer blijkt dat de kleurstof laadplaats worden gericht in visuele cortex (rood-wit bull's eye) is ~ 200 urn onder de corticale oppervlak. De XY-coördinaten van het doel overeenkomt met de locatie van een oriëntatie pinwheel singulariteit bepaald door intrinsieke signaal imaging. De pipet zal in de cortex in een hoek van 30 °. Als de corticale oppervlak evenwijdig aan het xy fase oppervlak, de pipetpunt lateraal bewegen ongeveer 350 pm alvorens de pinwheel singulariteit. (B) Bovenaanzicht van de opname kamer toont de corticale oppervlak vaatstelsel en de pipet invoer positie (rode ster) ebij is 350 pm uit de pinwheel singulariteit. (C) De kruistafel positie ingesteld dat de pipet invoerpositie wordt gecentreerd onder de 20x of 40x objectief (3,3 tot 3,5 mm WD). (D) Het doel wordt verhoogd ~ 2 mm. (E) De pipet wordt gebracht over de craniotomie en de tip is gepositioneerd direct boven de ingang positie op de corticale oppervlak met behulp van groene epi-TL-licht. (F) De pipet en objectieve gelijktijdig worden verlaagd met behulp van bright-field verlichting tot aan de corticale oppervlak bloedvaten komen in beeld. (G) De doelstelling en ACSF worden verwijderd en een druppel van 3% agarose wordt over de craniotomie. (H) Twee-foton visualisatie met een 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) doelstelling wordt gebruikt om de pipet volgen tot de gekozen corticale diepte en de kleurstof injecteren. Na bevestiging die met succes neuronen zijn gelabeld met fluorescerende kleurstof, gewoonlijk een hogere NA 20x objectief (1,0 NA, 2,0 mm WD) wordt gebruikt om twee-foton t verzamelen - en z-series data. Schematisch s getoond in A, CH niet op schaal getekend.
Figuur 4. Correspondentie van oriëntatie voorkeur in twee-foton en de intrinsieke signaal beeldvorming functionele kaarten. (A) van twee-foton belichte gebied met cellichamen gelabeld met OGB-1 uur in visuele cortex laag 2/3. (B) Oriëntatie voorkeur van individuele neuronale cellichamen van dezelfde plaats weergegeven in (A). Rond de pinwheel singulariteit die werd in het midden van de belichte regio is een georganiseerde kaart van geprefereerde stimulus oriëntatie. (C) De oriëntatie kaart verkregen met intrinsieke signaal beeldvorming. Het zwarte vierkant komt overeen met het gebied getoond in (B). Deze gegevens werden verkregen van hetzelfde experiment getoond in Figuren 2A-C en 3B. Schaalbalk in (AB) 100 pm en (C) 500 um.
d/50025/50025fig5.jpg "/>
Figuur 5. In vivo morfologie van een neuron in een oriëntatie pinwheel singulariteit. (A) De dendrieten en cellichaam van een neuron bedekt met een oriëntatie kaart van dezelfde visuele corticale site. De neuron werd geëlektroporeerd met Alexa Fluor 594 onder twee-foton leiding werd een z-stack verzameld in vivo en dendritische uitlopers werden getraceerd offline met Neurolucida software. De oriëntatie kaart werd verkregen met behulp van intrinsieke signaal beeldvorming voor eencellige elektroporatie. (B) Gemiddelde intensiteit 10-um-z-projectie van corticale laag 1 toont apicale dendrieten. (CD) Gemiddelde intensiteit 10-um-z-projecties van corticale laag 2/3 laten zien basale dendrieten en axonen. Rode pijlen geven stekels langs dendrieten en witte pijlen wijzen naar individuele axonen. Scale bars in (AD) 100 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We een methode om de labeling van neuronale cellichamen (of dendrieten en axonen) in vooraf bepaalde functionele micro-domeinen van de neocortex richten. Fuserende intrinsieke optisch beeldvorming met twee-foton microscopie biedt de mogelijkheid te bepalen welke cellen bij synapsen en de micro-domein van elke functionele kaart, of neuronale selectiviteit correleert met de locatie van de neuron in een functionele kaart en de neuronale circuitcomponenten die veranderen met visuele ervaring 7 of de toepassing van klinisch therapeutische geneesmiddelen 18.
Geen kaarten voor stimulus oriëntatie, richting, oculaire dominantie of binoculaire dispariteit zijn gemeld in de visuele cortex van de volwassen wild-type knaagdieren 6,19-21. Echter het gemak van het laden neuronen met fluorescente kleurstoffen en het bereiken imaging stabiliteit, samen met de krachtige genetische technieken voor muizen resulteerde in de meeste studiesmet behulp van twee-foton beeldvorming van de cerebrale cortex wordt uitgevoerd bij knaagdieren in plaats van fretten, katten en apen.
Hoge resolutie twee-foton beeldvorming van neuronen in knaagdieren zoogdieren kan zeer uitdagend omdat de lange operatie malen dikker bot en dura en extra stappen om respiratoire en cardiovasculaire gemedieerde pulsaties van de hersenen tot een minimum 15. Overgangen van een operatie aan intrinsieke signaal beeldvorming en inherent zijn aan twee-foton beeldvorming moeten efficiënt en vereist tijdige voorbereiding van reagentia, kleurstoffen en de uitvoering van micro-chirurgische procedures. De twee-foton microscoop voor intrinsieke signaal imaging ondervangt de noodzaak voor veel van de apparatuur gebruikt in conventionele intrinsieke optisch imaging tuig 22 en minder tijd nodig om intrinsieke beeldvorming en instellen overgang op volgende twee-foton imaging.
Onze aanpak is speciaal ontworpen om hoge-resolutie twee-pho biedenton imaging in vooraf bepaalde functionele domeinen. Dit zorgt voor minimale interferentie van functionele signalen tussen neuronale cellichamen, en individuele dendritische spines en axonen kunnen worden opgelost in vivo. Met behulp van een hoge numerieke apertuur (NA = 1,0) doel en het vullen van de achterkant diafragma van het objectief met balk expansie optica (zie aanvullende Fig. 20 in Shen et al.., 2012 15) zijn van cruciaal belang voor hoge-resolutie imaging. Afhankelijk van de snelheid van de beeldvorming in XY en / of Z, kan de luchtwegen en hart-en pulsaties verminderd effectief beeldvorming resolutie niet uit hoe goed de NA en optische lichtpad zijn. Door de beperking van de omvang craniotomie in niet-knaagdieren 2 x 2 mm, waarbij de relatief hogere concentratie agarose met een dekglaasje en het uitvoeren van een pneumothorax en lumbale suspensie indien noodzakelijk 15, hersenen pulsaties beperkt tot 1-2 pm. Het minimaliseren van respiratoire en cardiovasculaire geïnduceerde pulsaties van de neocortex tot 1-2 micrometer tijdens bulkladen van calcium indicatoren zorgt ook dat de cortex een goede afdichting rond het ingevoegde pipet vormt en dat geen kleurstof volgt langs de schacht van pipet aan de corticale oppervlakte. Selecteren kleurstof injectie en imaging plaatsen uit de buurt van grote arteriolen is ook van cruciaal belang voor een hoge kwaliteit functionele beeldvorming, omdat relatief snel sensorische-evoked hyperemie (hemodynamische) artefacten worden uitgesloten 15.
Bij de craniotomie site, waarbij de laatste laag van dura intact gehele intrinsieke signaal imaging en fluorescerende kleurstof voorbereidingsfasen - dus verwijderen net voor de pipet insteken in de cortex van kleurstof loading - verhoogt het rendement en de kwaliteit van neuronale labeling in de volgende manieren: (1) houdt de corticale oppervlak schoon en / of voorkomt durale weefsel hergroei zodat de pipetpunt minder snel verstopt raken en de transparantie van het weefsel wordt gehandhaafd, (2) voorkomt dat de agarose voor intrinsieke imaging druk de cortical oppervlak bloedvaten worden beschadigd wanneer de agarose wordt verwijderd, (3) voorkomt de agarose tijdens intrinsieke imaging binnendringen tussen de dura en cortex onder de schedel rond de randen van de craniotomie. Agarose in deze regio's de afstand tussen het dekglaasje en het corticale oppervlak dat het inbrengen van de pipet bemoeilijkt, leidt tot compressie van de corticale weefsel en vermindert de transparantie voor beeldvorming.
Bij de voorbereiding van de AM-fluorescente kleurstoffen voor bulk laden, de 20% Pluronic / DMSO mengsel mag nooit worden gebruikt na 1 week van haar eerste voorbereidingen - oude Pluronic / DMSO lest fluorescentie. Voor optimale bulkverlading vele aangrenzende cellichamen met een functionele indicator, bijvoorbeeld OGB-1 AM wordt de kleurstof werd opgeslagen op ijs geplaatst in de pipet maar indien nodig altijd geïnjecteerd in de hersenen binnen 2 uur na bereiding.
Tijdens het grootste deel oplaadfase vanhet experiment herhaald 1 sec pulsen druk dan een continue injectie van 1 min maakt iteratieve kalibratie van uitwerpen parameters die een te grote druk kleurstof of niet wordt toegepast. Vanwege de mogelijke weefselbeschadiging van meerdere pipet invoegingen nodig is om zeer grote gebieden van weefsel en mogelijke toxiciteit van grote hoeveelheden Pluronic / DMSO van een dergelijke reeks van vele injecties labelen we voorkeur een 300-600 urn kleurstof injectie per 2 x 2 mm craniotomie. Vergeleken met blind injecties 14, twee-foton visueel geleid surfen in bloedvaten, het gebruik van negatieve contrast van neuronale cellichamen om lamina te bepalen, en het meten van de verspreiding van de kleurstof van druk uitwerpen als een index van de hoeveelheid cellen die worden gelabeld met OGB-1 AM, verbetert de kwaliteit van kleurstof laden in niet-knaagdieren preparaten.
Het protocol beschrijven we hier leidt tot succesvolle etikettering van neuronen met fluorescerende kleurstoffen in teerrichte micro-domeinen in elk dier geprobeerd. Voor bulkverlading met OGB-1 AM, we consequent verkregen visueel opgewekte responsen in 75-100% van gelijktijdig afgebeeld neuronen 9,15 en de techniek is gevoelig voor de detectie van enkelvoudige actiepotentialen in vivo 23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Eye Institute R01EY017925 en R21EY020985 en financiering van de Dana & Whitehall Foundations naar PK We hebben ook Matthew Petrella bedanken voor hulp bij chirurgische procedures; Grace Dion voor het traceren van de dendrieten getoond in figuur 5A en Pratik Chhatbar voor commentaar op het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||
| 1. Life support/experiment prep | |||||||||
| Isoflurane | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | |||||||
| Isoflurane vaporizer | Midmark | VIP 3000 | |||||||
| Feedback regulated heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7079F | |||||||
| ECG monitor | Digicare Biomedical | LifeWindow Lite | |||||||
| EEG amplifier | A-M Systems | 1800 | |||||||
| EEG display monitor | Hewlett Packard | 78304A | |||||||
| End tidal CO2 monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Optimize ventilation | ||||||
| Carbide drill burrs for drilling bone | Henry Schein | fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip) | |||||||
| Cement for headplate/chamber | Dentsply | 675571, 675572 | |||||||
| Black Powder Tempera Paint | Sargent Art Inc. | 22-7185 | Add to cement to improve light shielding and reduce reflections | ||||||
| Agarose - Type III-A | Sigma | A9793 | For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging | ||||||
| Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness | World Precision Instruments | 502040, 502041 | For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed | ||||||
| Brudon curettes | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Cleaning skull surface | ||||||
| Bone wax | Ethicon | W31G | Quickly stop bleeding | ||||||
| Cotton Tipped Applicator | Electron Microscopy Sciences | 72308-05 | Clean and dry bone surface | ||||||
| Dumont #5CO Forceps | Fine Science Tools | 11295-20 | Grab individual layers of dura or pia | ||||||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | Cut dura | ||||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | To stop bleeding on the dura | ||||||
| Absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Ultra-fast and lint-free wicking of CSF | ||||||
| Blackout material | Thorlabs | BK5 | Shield craniotomy | ||||||
| 2. Dye preparation / injection | |||||||||
| Dimethyl Sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | |||||||
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | Calcium indicator | ||||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | |||||||
| Centrifugal filter (0.45 μm pore size) | Millipore | UFC30HV00 | To remove impurities before injection | ||||||
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P97 | |||||||
| Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Dye ejection pipette | ||||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | For loading dye into pipette | ||||||
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | To position pipette | ||||||
| Pressure pulse controller | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | For pressure injection of the dye | ||||||
| Single-cell electroporator | Molecular Devices | Axoporator 800A | For electroporation of the dye | ||||||
| 3. Intrinsic imaging | |||||||||
| 4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) | Olympus | UPLFLN4X | |||||||
| Intrinsic hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software is used for episodic imaging | ||||||
| CCD Camera | Adimec | Adimec-1000 | |||||||
| Light source power supply | KEPCO | ATE 15-15M | |||||||
| Light source | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW | ||||||
| Green filter (for vascular image) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (bandpass 30 nm) | For reference image of surface vasculature | ||||||
| Red filter (for intrinsic signal) | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm (bandpass 30 nm) | To collect intrinsic signals | ||||||
| Heat filter | Optical Imaging Inc. | KG-1 | |||||||
| 4. Two-photon rig/imaging | |||||||||
| Two-photon microscope and software | Prairie Technologies | See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power | |||||||
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | |||||||
| 20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) | Olympus | UMPLFLN20X | 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging) | ||||||
| 20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) | Olympus | XLUMPLFLN20X | |||||||
| 40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | |||||||
| Air table | Newport | ST-200 | Isolates preparation from external vibrations | ||||||
| xy stage | Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA) | Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage | |||||||
|
|||||||||
References
- Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
- Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
- Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns. Nature. 353, 429-431 (1991).
- Ohki, K., et al. Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels. Nature. 442, 925-928 (2006).
- Shmuel, A., Grinvald, A. Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18. J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).
- Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
- Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity. Nature. 456, 952-956 (2008).
- Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex. Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).
- Kara, P., Boyd, J. D. A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex. Nature. 458, 627-631 (2009).
- da Costa, N. M., Martin, K. A. Whose Cortical Column Would that Be. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16 (2010).
- Kaschube, M., et al. Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex. Science. 330, 1113-1116 (2010).
- Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex. Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).
- Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, 501-505 (2011).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).
- Nevian, T., Helmchen, F. Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation. Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).
- Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex. Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471, 177-182 (2011).
- Rochefort, N. L., et al. Development of direction selectivity in mouse cortical neurons. Neuron. 71, 425-432 (2011).
- Mrsic-Flogel, T. D., et al. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-972 (2007).
- Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. Brain mapping: The Methods. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).
- Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
- Hofer, S. B., et al. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).
