Rotulagem alvo de neurônios em um específico domínio funcional de Micro-do neocórtex por Combinando sinal intrínseco e dois fótons de imagem

Summary

É descrito um método para a marcação de neurónios com corantes fluorescentes funcionais pré-determinados micro-domínios do neocórtex. Primeiro, a imagem do sinal óptico intrínseco é usado para obter um mapa funcional. Em seguida, dois fotões microscopia é utilizado para marcar e neurónios de imagem dentro de um domínio de micro-do mapa.

Abstract

No córtex visual primário de mamíferos não roedora, os neurônios são agrupados de acordo com sua preferência por características de estímulo, tais como orientação ^1-4, direção de dominância, ^5-7 ocular ^8,9 e ⁹ disparidade binocular. Seletividade orientação é a característica mais amplamente estudada e um mapa contínuo com um layout quase-periódica para orientação preferencial está presente em toda a córtex visual primário ^10,11. Integrando as contribuições sinápticas, celular e rede que levam a respostas de estímulo seletivos nestes mapas funcionais requer a hibridização de técnicas de imagem que abrangem sub-mícron de milímetro escalas espaciais. Com imagem do sinal óptico intrínseco convencional, o layout geral dos mapas funcionais por toda a superfície do córtex visual pode ser determinado ^12. O desenvolvimento de microscopia in vivo de dois fotões usando corantes de cálcio sensíveis permite que se determine a SYNAPTentrada IC chegar espinhas dendríticas individuais ¹³ ou registro de atividade simultaneamente a partir de centenas de corpos individuais de células neuronais ^6,14. Consequentemente, a combinação de imagem do sinal intrínseco, com a resolução espacial sub-micron de dois fotões microscopia oferece a possibilidade de determinar exactamente quais os segmentos dendríticas e células contribuem para o domínio de qualquer micro-mapa funcional no neocórtex. Aqui demonstramos um método de alto rendimento para a rápida obtenção de um mapa de orientação cortical e visando um domínio específico de micro-neste mapa funcional para rotular neurônios com corantes fluorescentes em um mamífero não roedora. Com o mesmo microscópio usado para dois fótons de imagem, primeiro gerar um mapa de orientação usando imagens de sinal óptico intrínseco. Então, vamos mostrar como alvo um domínio de micro-de interesse usando uma micropipeta carregado com corante para qualquer rótulo de uma população de corpos celulares neuronais ou etiqueta de um único neurônio de tal forma que os dendritos e axônios, espinhas são visíveis novivo. Nossos refinamentos mais métodos anteriores facilitar um exame da neuronais relações estrutura-função com sub-celular resolução no âmbito da neocorticais arquitecturas funcionais.

Protocol

1. Preparação cirúrgico

1. Induzir a anestesia e continuamente monitorar a freqüência cardíaca, acabam de CO ₂ das marés, EEG, e temperatura. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso da Universidade Médica da Carolina do Sul e foram baseados naqueles que anteriormente publicado ^9,15.
2. Expor a superfície dorsal do crânio através do corte na pele com uma lâmina de bisturi. Dissecar os tecidos conjuntivos que recobrem o osso usando uma cureta Brudon. Limpe o osso através de aplicadores de algodão e gaze de algodão ponta. Aplicar a cera óssea (quando necessário) ao crânio, para parar o sangramento ocasional através de pequenas veias emissário.
3. Anexar uma placa de titânio ou de aço inoxidável para a cabeça do crânio (sobre a região de interesse, onde a craniotomia será executada) usando cimento dental misturada com tinta preta (ver Materiais). Uma abertura rectangular no centro da placa frontal proporciona acesso para a craniotomia e imagiologia óptica. Anexar uma câmara metálica no topo da placa frontal. Esta câmara serve como um reservatório de fluido para geração de imagens com a lente objectiva de imersão em água.
4. Fixe a placa de cabeça para um estágio xy usando postes de metal.
5. Diluir uma grande área do osso dentro da abertura rectangular da headplate usando uma broca de dentista. A área a ser diluído deve estender-se para além dos limites da craniotomia planeada. A cabeça dura não roedora mamíferos devem ser diluídos, se imagens de alta resolução estão a ser adquiridos a partir do neocortex, porque no local da craniotomia, a espessura do osso vai ditar a espessura da lamela de agarose entre a superfície e neocortical (ver abaixo) .
6. Perfurar um 2 x 2 esboço mm quadrados no osso para a craniotomia. Enxaguar a câmara periodicamente com fresco fluido cerebrospinal artificial (ACSF), para remover fragmentos ósseos e minimizar a dissipação de calor ao córtex subjacente. Aplique cera de osso, conforme necessário, para parar o sangramento ocasional.
7. Lift do retalho ósseo com pinça # 3.
8. Remover todos, mas a camada inferior de duração usando uma pinça fina (# 5CO) e tesoura primavera Vannas. A dura-máter em mamíferos não roedora é espesso e opaco, mas pode ser removido em camadas distintas. A hemorragia é rara, mas pode ser interrompido com Gelfoam e qualquer resíduo de sangue deve ser cuidadosamente removido da camada restante de dura usando uma pinça e enxaguamento com ACSF. A camada final de dura é transparente e vasos Pial deve ser claramente visível através dele. Deixando esta camada final de dura intacta durante o exame sinal intrínseco irá aumentar a taxa de sucesso de carregamento a granel de indicadores de cálcio fluorescentes para a fase posterior de imagens de dois fótons do experimento (ver discussão).
9. Aplique uma gota de agarose morna 2% (dissolvido em ACSF) e coloque imediatamente uma lamela sobre a craniotomia. Verifique a craniotomia para assegurar que as pulsações respiratórias e cardiovasculares são mínimos, utilizando um microscópio de dissecção cirúrgica ou as oculares do dois-fóton em microscópio de campo claro modo.

2. Intrínseca sinal óptico de imagem

1. Adicionar gel de espuma embebidas com ACSF em torno do exterior da lamela para evitar a secagem de agarose durante o exame do sinal intrínseco.
2. Anexar o intrínseco sinal de imagem da câmara CCD para a porta de montagem C padrão em cima do microscópio de dois fotões (Figura 1). Coloque a fonte de luz de iluminação sobre a mesa de ar perto do palco xy (Figura 1A). Posição e manter as guias de luz sobre a craniotomia e headplate / câmara (Figura 1B). Retrair o dicróico primário e do espelho inferior da porta C-montagem de modo que a luz reflectida vermelho necessário para sinais intrínsecos irá passar directamente a partir da craniotomia para a câmara CCD (Figura 1C-D). Usando o objectivo ar 4x (0,13 NA, 17 mm DI), um campo de 2 x 2 mm de exibição está disponível para a imagem do sinal intrínseco.
3. Inserir um filtro de calor na light caminho para evitar que a partir de córtex de aquecimento. Use um filtro que passa luz verde (546 nm centro λ) e gravar uma imagem de referência digital dos vasos sanguíneos superficiais corticais.
4. Mover o foco para z 500 mm abaixo da superfície cortical. Usar um filtro vermelho (630 nm centro λ) para iluminar o córtex para medir sinais intrínsecos. Posicionar as guias de luz de tal forma que a superfície cortical é uniformemente iluminado. Proteger a craniotomia da luz produzida pelo mostrador estímulo visual. Apresentar uma seqüência de estímulos visuais e gravar imagens de dados de refletância. Para gerar um mapa de orientação dentro de 10 min, coletar dados correspondentes a quatro repetições de uma sequência de oito estímulos (4 orientações e duas indicações para cada orientação).
5. Analisar os dados de sinal intrínsecas para gerar um mapa de orientação falsa cor. Selecione regiões-alvo em potencial para dois fótons de rotulagem de neurônios, por exemplo, as singularidades de orientação pinwheel - pontos no mapa ondetodas as orientações preferidas convergem (Figura 2A). Sobrepor a orientação do mapa e a imagem da vasculatura superfície cortical (Figura 2B-C). Use o esquema de domínios funcionais e localização de embarcações de grande superfície para selecionar um alvo, evitando locais com grandes vasos sanguíneos e arteríolas ^15.

3. Carregando em massa de Indicadores de cálcio fluorescentes

1. Prepara-se uma solução de 20% de Pluronic / DMSO, adicionando 1 g de Pluronic em 5 ul de DMSO. Aquecer a mistura a 60 ° C durante 10 minutos para dissolver completamente o Pluronic. Deixar a mistura arrefecer até à temperatura ambiente. Adicionar 4 ul da mistura de Pluronic / DMSO para um frasco de 50 ug do indicador de cálcio fluorescente verde Oregon 488 BAPTA-1 AM (OGB-1 AM). Em seguida, adicionar 1 ml de um corante vermelho (Alexa Fluor 594, 2 mM de solução stock) e 35 uL de solução de pipeta (ver Materiais) para uma concentração final de 1 mM OGB-1 AM. Sonicate a solução para ½ h emum banho de água gelada e em seguida, centrifuga com um filtro de 0,45 um para remover as impurezas.
2. Puxar uma pipeta de conicidade de comprimento com um diâmetro exterior da ponta de 2,0-2,5 | im. Carregar 5 uL da mistura de corantes para a pipeta.
3. Remover a camada final de dura-máter para facilitar a inserção de uma pipeta e obter a melhor qualidade de imagens de dois fotões.
4. Determinar a localização exacta da superfície cortical que a pipeta tem de ser colocado de modo a atingir o seu alvo na camada cortical 2/3. O nosso alvo predeterminado cortical é uma singularidade pinwheel na orientação do mapa (Figura 2). A pipeta tem de ser conduzido para o córtex no ângulo de 30 º para passar entre a parede da câmara e do objectivo. Assim, para identificar a região de destino 200 um abaixo da superfície cortical, a posição de entrada da pipeta na superfície cortical será de aproximadamente 350 um lateralmente à posição do alvo (figura 3-B).
5. Mover a fase xy (em que o animal e o pmicromanipulador ipette são colocados) para centrar a posição de entrada da superfície cortical no âmbito do objectivo (Figura 3C). Utilize uma objectiva de 20x ou 40x, com uma distância de trabalho (DT) de pelo menos 3 mm (ver Materiais) para garantir que a pipeta irá entrar facilmente no córtex sem tocar o objectivo ou o osso ao longo da parede da craniotomia. Uma vez que a posição de entrada está centrado no âmbito do objectivo, aumentar a posição Z do objectivo de 2 mm (Figura 3D). Com a luz verde epi-fluorescência ligada a visualizar o corante vermelho Alexa na pipeta, use o eixo diagonal do micromanipulador para mover a pipeta até a sua ponta é centrado (concentrado e), sob a objectiva directamente acima da superfície cortical entrada ( Figura 3E).
6. Baixar a pipeta na vertical (ao longo do eixo z), até que a pipeta atinge a superfície cortical (Figura 3F), enquanto continuamente visualizar a ponta da pipeta com a oculars do microscópio. Usando brilhante-campo de iluminação, os vasos sanguíneos superficiais corticais e demais membranas das meninges (pia e aracnóide) são facilmente visíveis como a pipeta se aproxima da superfície cortical. Se a pipeta não atinge a posição de entrada desejado, aumentar a pipeta e recalibrar alvo com base nos pontos de referência vasculares na superfície cortical.
7. Retire o objetivo, pavio líquido cefalorraquidiano excesso da craniotomia e secar o osso adjacente usando lanças sem fiapos de absorção. Aplicar uma gota de quente de agarose a 3% (dissolvido em ACSF) para estabilizar o córtex que é visível através da craniotomia (Figura 3G). Em animais não roedores, agarose a 3% é necessário para amortecer pulsações para uma implantação bem sucedida de corantes fluorescentes pelos neurónios. Para imagiologia sinal óptico intrínseco somente 2% de agarose é necessária porque a combinação de agarose a 2% e a lamela fornece a estabilidade necessária. Aqui, não lamela é usado para o passo de corante de carregamento de modo agarose 3%necessário. Após a agarose solidificou, insira uma objetiva de 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) e re-encher a câmara com ACSF.
8. Mudar de campo brilhante para dois fótons de visualização e localizar a ponta da pipeta. Usando o eixo diagonal do micromanipulador, mover a pipeta até a sua ponta atinge a profundidade desejada, no córtex (Figura 3H). Puffs pressão ocasionais de ejeção da mistura de corante (a psi poucos, cada pulso de 0,1 seg) irá ajudar a evitar a ponta da pipeta de entupimento. Porque OGB-01:00 só se torna visível após entrar nas células, o corante vermelho Alexa é crítica para a visualização da ponta da pipeta dentro do córtex.
9. Antes de tentar carregar neurônios na camada cortical 2/3 com a dose completa do corante, re-centrar o objectivo da superfície cortical para confirmar a profundidade da ponta da pipeta e garantir que a ponta está no local de destino com base na disposição de vasos sanguíneos superficiais. Se a pipeta está na camada de 2/3, puffs pequenas da mistura de corantes deve iluminar oespaço extracelular e revelar um conjunto denso de corpos celulares circulares como sombras escuras.
10. Para carregar os corpos celulares neuronais em uma esfera de córtex 300-600 um de diâmetro, injectar a mistura de corantes para o espaço extracelular com 30-90 pulsos, cada pulso de 1,0 seg, 2-10 psi. Os impulsos de pressão não deve ser tão forte que o tecido se move. Após a injeção é completo, espere alguns minutos, retire a pipeta e objetiva. Aguarde 1 hora para permitir que a OGB-01:00 para ser totalmente absorvido pelas neurônios.
11. Remover a agarose utilizada para a carga de corante e lavar a câmara de gravação. Coloque uma pequena gota de agarose de 2-3% na superfície e rapidamente colocar uma lamela sobre a craniotomia. Porque os corantes fluorescentes são sensíveis à luz, evitar uma exposição excessiva do córtex a brilhante-campo ou epi-fluorescente luz. Insira um alto NA (1,0) 20x objetivo no suporte objetivo e re-centro a região cortical rotulado sob o objetivo utilizar o estágio xy. Proteger a craniotomia de extraneous fontes de luz, por exemplo, exibição de estímulo visual, usando várias camadas de material de apagão.

4. De uma única célula de electroporação de corantes fluorescentes

1. Para estudar a morfologia dendrítica, preparar uma solução de 100 uM de Alexa Fluor 594 (diluição 1:20 em ACSF de 2 mM estoque Alexa Fluor 594). Para imagiologia funcional de um sal de OGB dendrites podem ser utilizados ^16,17.
2. Puxar uma pipeta de cone longo com um bico de 1 fim e carregar 5 ul de corante para a pipeta. Todos os outros passos de direccionamento um domínio funcional é idêntico ao método de carregamento a granel (Figuras 1-3). Para posicionar a ponta da pipeta adjacente a uma membrana neuronal de células do corpo, monitorizar o aumento da impedância do eléctrodo e aplicar pressão baforadas de corante para iluminar o espaço extracelular e ver corpos celulares como sombras durante dois fótons de imagem.
3. Quando a ponta da pipeta é adjacente a uma membrana de célula neuronal corpo, use o 800A Axoporator aplicarPulsos 1-3 (-8 a -10 V, 10 ms de pulso). O preenchimento imediato do neurônio com corante é facilmente visualizado com dois fótons de microscopia. Remova a pipeta e recolher imagens de alta resolução de dendrites e axónios in vivo.

Representative Results

Para ilustrar a precisão dos nossos métodos de marcação de corantes, que alvo menor do domínio de qualquer micro-mapa funcional conhecida no neocórtex não roedor. Esparsamente pontuado em todo o mapa de orientação do córtex visual primário são singularidades. Estes ocorrem nos pontos em que todas as orientações preferidas convergem de tal modo que, em mapas de cor falsas da orientação preferida, as regiões de todo o olhar como singularidade "pinwheels" (Figura 2A-B). Um cata-vento por craniotomia é selecionado para corante rotulagem (círculo verde na Figura 2C), sendo certo, para evitar grandes vasos e arteríolas em ¹⁵ particular. Com maior carga de OGB-1 AM, o controle de alterações na fluorescência de cálcio neuronal indicador para uma sequência de estímulos visuais ralar orientadas mapas revela uma única célula de resolução de cerca de singularidades pinwheel funcionais (Figura 4). Com uma única célula eletroporação, a organização espacial dos dendritos e axônios de tãoingle neurónios localizados numa singularidade pinwheel é determinado in vivo (Figura 5).

Figura 1. Intrínseca sinal de configuração de imagem óptica. (A) O animal é colocado sobre o palco xy e imagiologia sinal intrínseco é realizada através de uma câmara CCD montada no microscópio de dois fotões. A fonte de luz e um computador usado para controlar a sessão de imagiologia são trazidos para a configuração da imagem intrínseca e afastado antes que a fase de imagens de dois fotões da experiência se inicia. (B) Feche acima da vista o objetivo de 4x ea iluminação 630 nm através de guias de luz líquida. Qualquer um dos dois guias de luz ligado a postes metálicos (à esquerda), ou um anel de iluminação directamente ligado ao único objectivo a (à direita) podem ser usados. O material utilizado para Blackout proteger o objectivo de fontes externas de iluminação, por exemplo, exposição do estímulo visual, durante as sessões de imagem óptica, não é mostrado. (C) Esquema do microscópio e percurso da luz na configuração de imagem convencional de dois fotões. Ver Fig. Suplementar. 20 em Shen et al. 2012 ¹⁵ para uma descrição do percurso da luz total de dois fotões. O espelho retráctil está posicionado para desviar a luz do laser através do dicróico e sobre o córtex. O dicróico primário, que passa o feixe de laser e reflecte a luz emitida a partir do córtex à da PMT, é movido para o caminho da luz, rodando o revólver de filtro. (D) Para imagem intrínseca do espelho é retraída e a torre do filtro é ligado para mover a dicróico primário fora do caminho, o que permite um percurso directo de luz a partir do córtex para a câmara CCD. para ver figura maior .

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Figura 2. Usando mapas funcionais obtidos com a imagem sinal intrínseco para selecionar um domínio de micro-para rotular neurônios com corantes fluorescentes. (A) mapa de orientação de gato córtex visual primário adquirido através de imagens de sinal óptico intrínseco. A cor de cada pixel representa a orientação preferida, nessa localização. Singularidades orientação potenciais pinwheel adequadas para a rotulagem de neurônios com corantes fluorescentes são mostrados dentro de círculos pretos. (B) O mapa de vasos sanguíneos superficiais corticais sobrepostas com a orientação do mapa. (C) Pinwheels dentro de círculos vermelhos são perto de grandes vasos sanguíneos ou arteríolas e por isso o site pinwheel dentro do círculo verde é escolhida como alvo para a rotulagem corante. O rectângulo a tracejado corresponde à região mostrada na Figura 3B. Barra de escala em (A) 500 μ m.

Figura 3. Otimizando a colocação da pipeta para carregar neurônios com corantes fluorescentes. (A) Esquema de visão lateral da câmara de gravação mostra que o site corante ser alvo de córtex visual (olho de boi vermelho-e-branco) é de aproximadamente 200 mM abaixo da cortical superfície. A coordenada xy do alvo corresponde ao local de uma singularidade pinwheel orientação determinada a partir do sinal de imagem intrínseca. A pipeta entrará no córtex em um ângulo de 30 °. Se a superfície cortical é paralelo à superfície da fase xy, a ponta da pipeta irá mover-se lateralmente de aproximadamente 350 um antes de atingir a singularidade cata-vento. (B) Vista superior da câmara de gravação mostra a vasculatura superfície cortical ea posição de entrada pipeta (estrela vermelha) ªem 350 um é da singularidade cata-vento. (C) A posição xy fase é ajustada de tal modo que a posição de entrada da pipeta está centrada sob a 20x ou 40x objectivo (3,3-3,5 milímetros WD). (D) O objectivo é levantada ~ 2 mm. (E) A pipeta é trazida sobre a craniotomia e a sua ponta é posicionada directamente por cima da posição de entrada na superfície cortical utilizando luz verde epi-fluorescente. (F) O objectivo da pipeta e são reduzidos concorrentemente com a iluminação de campo brilhante até que os vasos sanguíneos da superfície cortical entrar em foco. (G) O objectivo e ACSF são removidos e uma gota de agarose a 3% é aplicado sobre a craniotomia. (H) a visualização de dois fotões com uma objectiva (0,8 NA, 3,3 mm DI) 40x é utilizado para seguir a pipeta até a profundidade escolhida cortical e injectar o corante. Depois de confirmar que os neurónios são rotulados com sucesso com o corante fluorescente, geralmente, uma maior NA 20x objectivo (1,0 NA, 2,0 mm WD) é utilizado para a recolha de dois fotões t - e z-séries de dados. Esquemático s mostrado em A, CH não estão em escala.

Figura 4. Correspondência de preferência orientação em mapas de sinal de dois fótons e intrínseca de imagem funcional. (A) dois fótons área com imagens mostrando corpos de células marcadas com OGB-01:00 no visual córtex camada 2/3. (B) orientação de preferência corpos celulares neuronais individuais a partir do mesmo local mostrado em (A). Em torno da singularidade pinwheel que foi centrada na região de imagem é um mapa de orientação organizada estímulo preferido. (C) O mapa de orientação obtidas com imagiologia sinal intrínseco. O quadrado preto corresponde à região mostrado em (B). Estes dados foram obtidos a partir da mesma experiência mostra nas Figuras 2A-C e 3B. Barra de escala em (AB) e 100 um (C) de 500 um.

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Figura 5. Em morfologia in vivo de um único neurónio menos uma singularidade pinwheel orientação. (A) Os dendritos e do corpo celular de um neurónio único coberto com a orientação do mapa do site visuais mesma cortical. O neurônio foi eletroporadas com Alexa Fluor 594 sob orientação de dois fótons, um z-stack foram coletados in vivo, e processos dendríticos foram traçados offline usando software Neurolucida. A orientação do mapa foi obtido utilizando imagiologia sinal intrínseco antes de uma única célula de electroporação. (B) a intensidade média 10 mícrons-z-projeção da camada cortical 1 mostra dendritos apicais. (CD) de intensidade média 10 mícrons-z projeções de camada cortical dendritos 2/3 da mostra basais e axônios. As setas vermelhas mostram lombadas ao longo dendritos e setas brancas apontam axônios individuais. Barras de escala em (AD) de 100 um.

Discussion

Apresentamos um método para alvejar a rotulagem de corpos celulares neuronais (ou dendritos e axônios) na pré-determinados funcionais micro-domínios do neocórtex. A fusão de imagem do sinal óptico intrínseco com dois fotões microscopia oferece a possibilidade de determinar quais as sinapses e células contribuem para o domínio de qualquer micro-mapa funcional, quer correlaciona selectividade neuronal com a localização do neurónio em um mapa funcional e o circuito neuronal componentes que a mudança com uma experiência visual ⁷ ou a aplicação de clinicamente drogas terapêuticas ^18.

Não mapas para orientação do estímulo, a direcção, a dominância ocular, ou disparidade binocular foram relatados no córtex visual de adultos de tipo selvagem roedores ^6,19-21. No entanto, a facilitar a colocação de neurónios com corantes fluorescentes e alcançar a estabilidade de imagem, em conjunto com as ferramentas poderosas genéticos disponíveis para ratos resultou na grande maioria dos estudosutilizando dois fotões imagiologia do córtex cerebral que está sendo executada em roedores, em vez de furões, gatos e macacos.

Imagens de alta resolução de dois fótons de neurônios em mamíferos roedores não pode ser muito desafiador, porque de tempos cirúrgicos longos, mais espessa de osso e dura, e os passos adicionais necessários para manter respiratórias e cardiovasculares mediadas pulsações do cérebro para um mínimo de ^15. Transições de uma cirurgia para a imagem do sinal intrínseco e intrínseca a dois fótons de imagem precisam ser eficientes, exigindo preparação atempada de reagentes, corantes e execução de micro-cirúrgicos. Utilizando o microscópio de dois fotões para imagiologia sinal intrínseco obvia a necessidade de uma grande parte do equipamento utilizado em sondas convencionais intrínsecas de sinal de imagem óptica ²² e reduz o tempo necessário para configurar imaging intrínseca e transição para imagiologia de dois fotões subsequente.

Nossa abordagem é projetado especificamente para fornecer alta resolução de dois phoimagem tonelada em pré-determinados domínios funcionais. Isto proporciona diafonia mínima dos sinais funcionais entre os corpos celulares neuronais, e espinhos dendríticas individuais e axônios pode ser resolvido in vivo. Usando uma grande abertura numérica (NA = 1,0) Objectivo e enchendo a abertura traseira da objectiva com óptica de feixe de expansão (ver Fig. Complementar. 20 em Shen et al., 2012 ¹⁵⁾ são críticos para a imagem de alta resolução. Dependendo da velocidade da imagem em XY e / ou Z, pulsações respiratórias e cardiovasculares podem reduzir a resolução de imagem eficaz, não importa o quão boa a NA e caminho óptico de luz são. Ao limitar a dimensão craniotomia não roedores de 2 x 2 mm, utilizando a concentração relativamente mais elevada de agarose com uma lamela, e executando uma suspensão pneumotórax e lombar quando necessários ¹⁵ pulsações, cérebro estão limitados a 1-2 ^ m. Minimizando respiratórias e cardiovasculares induzidas pulsações do neocórtex de 1-2 uM durante a granelcarregamento dos indicadores de cálcio também garante que o córtex forma uma vedação estanque em torno da pipeta inserido e que nenhum corante rastreia-se ao longo da haste de pipeta para a superfície cortical. Seleção de injeção de contraste e sites de imagem longe de grandes arteríolas também é fundamental para imagens de alta qualidade funcional, pois relativamente rápidas sensório-evocados hiperemia (hemodinâmica) artefatos serão excluídos ^15.

No local da craniotomia, deixando a camada final de dura intacta todo o sinal de imagem intrínseca e fases de preparação de corantes fluorescentes - removendo assim que um pouco antes da inserção da pipeta para o córtex para carregamento de corante - aumenta a taxa de sucesso e qualidade de marcação neuronal no seguinte maneiras: (1) mantém a superfície cortical limpo e / ou impede a regeneração do tecido da dura-máter de modo a que a ponta da pipeta é menos provável de ser obstruído e a transparência do tecido é mantida, (2) evita a agarose utilizada para tocar a imagem intrínseca cortical vasos sanguíneos superficiais que podem ficar danificados quando a agarose é removida, (3) impede que a agarose usada durante a entrada de imagem intrínseca entre a dura e o córtex sob o crânio em volta das bordas da craniotomia. Agarose nessas regiões irá aumentar a distância entre a lamela e a superfície cortical o que torna a inserção da pipeta mais difícil, leva à compressão do tecido cortical e reduz a transparência para imagiologia.

Ao preparar a PM corantes fluorescentes para carregamento a granel, o Pluronic 20% / DMSO mistura nunca deve ser usado para além de 1 semana de sua preparação inicial - Pluronic velho / DMSO sacia fluorescência. Para o carregamento a granel óptima de muitos corpos celulares adjacentes com um indicador funcional, por exemplo, OGB-1 AM, a mistura de corantes é armazenada em gelo, carregado para a pipeta, conforme necessário, mas sempre injectado no cérebro dentro de 2 horas da sua preparação.

Durante a fase de carga a granel dea experiência, repetiu uma pulsos seg de pressão em vez de uma injecção contínua de 1 min permite iterativo de parâmetros de calibração de ejecção, o qual assegura que a pressão excessiva ou corante não é aplicado. Por causa do potencial de danos no tecido a partir de inserções de pipetas múltiplas necessárias para rotular regiões muito grandes de tecido e toxicidade potencial de grandes volumes de Pluronic / DMSO a partir de uma tal série de injecções de muitos, preferimos um local de injecção 300-600 uM corante por 2 x 2 craniotomia mm. Em comparação com as injecções cego ^14, de dois fotões navegação visualmente guiado em torno dos vasos sanguíneos, o uso de contraste negativo de corpos celulares neuronais para determinar a posição da lâmina, e a propagação de aferição do corante sobre a pressão de ejecção como um índice do volume de células que serão rotulado com OGB-1 AM, melhora a qualidade da carga de corante nas preparações não roedoras.

O protocolo, descrevemos aqui leva a rotulagem de sucesso de neurônios com corantes fluorescentes em alcatrãogeted micro-domínios em cada animal tentada. Para o carregamento a granel com OGB-1 AM, que consistentemente se obter respostas visuais evocados em 75-100% dos neurônios simultaneamente imaged ^9,15 e a técnica é sensível para a detecção de potenciais de acção simples in vivo ^23,24.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Life support/experiment prep
Isoflurane	Webster Vet	NDC 57319-474-05
Isoflurane vaporizer	Midmark	VIP 3000
Feedback regulated heating blanket	Harvard Apparatus	50-7079F
ECG monitor	Digicare Biomedical	LifeWindow Lite
EEG amplifier	A-M Systems	1800
EEG display monitor	Hewlett Packard	78304A
End tidal CO2 monitor	Respironics	Novametrix Capnoguard 1265	Optimize ventilation
Carbide drill burrs for drilling bone	Henry Schein	fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip)
Cement for headplate/chamber	Dentsply	675571, 675572
Black Powder Tempera Paint	Sargent Art Inc.	22-7185	Add to cement to improve light shielding and reduce reflections
Agarose - Type III-A	Sigma	A9793	For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging
Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness	World Precision Instruments	502040, 502041	For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed
Brudon curettes	George Tiemann	105-715-0, 105-715-3	Cleaning skull surface
Bone wax	Ethicon	W31G	Quickly stop bleeding
Cotton Tipped Applicator	Electron Microscopy Sciences	72308-05	Clean and dry bone surface
Dumont #5CO Forceps	Fine Science Tools	11295-20	Grab individual layers of dura or pia
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03	Cut dura
Gelfoam	Pfizer	09-0396-05	To stop bleeding on the dura
Absorption spears	Fine Science Tools	18105-01	Ultra-fast and lint-free wicking of CSF
Blackout material	Thorlabs	BK5	Shield craniotomy
2. Dye preparation / injection
Dimethyl Sulphoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Pluronic	Sigma	P2443
Oregon Green 488 Bapta-1 AM	Invitrogen	O6807	Calcium indicator
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A10438
Centrifugal filter (0.45 μm pore size)	Millipore	UFC30HV00	To remove impurities before injection
Glass pipette puller	Sutter Instruments	P97
Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter)	World Precision Instruments	1B150F-4	Dye ejection pipette
Microloader	Eppendorf	5242 956 003	For loading dye into pipette
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285	To position pipette
Pressure pulse controller	Parker Hannifin	PicoSpritzer III	For pressure injection of the dye
Single-cell electroporator	Molecular Devices	Axoporator 800A	For electroporation of the dye
3. Intrinsic imaging
4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD)	Olympus	UPLFLN4X
Intrinsic hardware / software	Optical Imaging Inc.	Imager 3001 / VDAQ	VDAQ software is used for episodic imaging
CCD Camera	Adimec	Adimec-1000
Light source power supply	KEPCO	ATE 15-15M
Light source	Optical Imaging Inc.	HAL 100	Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW
Green filter (for vascular image)	Optical Imaging Inc.	λ = 546 nm (bandpass 30 nm)	For reference image of surface vasculature
Red filter (for intrinsic signal)	Optical Imaging Inc.	λ = 630 nm (bandpass 30 nm)	To collect intrinsic signals
Heat filter	Optical Imaging Inc.	KG-1
4. Two-photon rig/imaging
Two-photon microscope and software	Prairie Technologies		See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai XF
20x (0.5 NA; 3.5 mm WD)	Olympus	UMPLFLN20X	0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging)
20x (1.0 NA; 2.0 mm WD)	Olympus	XLUMPLFLN20X
40x (0.8 NA; 3.3 mm WD)	Olympus	LUMPLFLN40X/IR
Air table	Newport	ST-200	Isolates preparation from external vibrations
xy stage	Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA)		Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage
Recipes Artificial Cerebro-Spinal Fluid NaCl (135 mM), KCl (5.4 mM), MgCl2 (1.0 mM), CaCl2 (1.8 mM), HEPES (5 mM), pH 7.4 Pipette Solution14 NaCl (150 mM), KCl (2.5 mM), HEPES (10 mM), pH 7.4