Summary
Описан способ маркировки нейронов с флуоресцентными красителями в заданных функциональных микро-областей коры головного мозга. Во-первых, внутренний сигнал оптических изображений используется для получения функциональной карте. Тогда двухфотонной микроскопии используется для обозначения и изображения нейронов в микро-область на карте.
Abstract
В первичной зрительной коры не-грызунов млекопитающие, нейроны группируются в соответствии с их предпочтениями стимулом для функций, таких как ориентация 1-4, 5-7 направления, глазного доминирования 8,9 и бинокулярное несоответствие 9. Ориентация селективности является наиболее широко изучаются функции и непрерывное отображение с квази-периодические макет для преимущественной ориентации присутствует по всей первичной зрительной коры 10,11. Интеграция синаптических, сотовой сети и взносы, которые приводят к стимулы избирательный ответы на эти функциональные карты требуется гибридизации методов визуализации, которые охватывают суб-микрона до миллиметра пространственных масштабах. С обычной внутренней сигнала оптических изображений, общая компоновка функциональных карт по всей поверхности зрительной коры может быть определено 12. Развитие в естественных условиях двухфотонной микроскопии с использованием кальция чувствительных красителей позволяет определить synaptIC входе прибывающих в отдельных дендритных шипов 13 или записи активности одновременно из сотен отдельных тела нейронов 6,14. Следовательно, сочетание внутренней визуализации сигнала с субмикронной пространственное разрешение двухфотонных микроскопия дает возможность определить, какие именно дендритные клетки сегменты и вклад в микро-домен любой функциональной карты в коре головного мозга. Здесь мы показываем, высокодоходный метод для быстрого получения корковых ориентации карты и ориентации конкретных микро-домен в этой функциональной карты для маркировки нейронов с флуоресцентными красителями в не-грызун млекопитающее. С той же микроскоп используется для двух-фотонного изображений, мы сначала создать ориентации карты с помощью внутренней сигнала оптического изображения. Затем мы покажем, как настроить таргетинг на микро-области интереса помощью микропипетки загружается с красителем либо этикетку населения тела нейронов или этикетку одного нейрона, что дендриты и аксоны шипы видны вестественных условиях. Наши уточнений по сравнению с предыдущими методами облегчения рассмотрения нейронов структурно-функциональных отношений с субклеточном резолюции в рамках коры головного мозга функциональной архитектуры.
Protocol
1. Хирургическая подготовка
- Анестезии и постоянно контролировать частоту сердечных сокращений, в конечном приливной CO 2, ЭЭГ, и температура. Все процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Медицинского университета Южной Каролины и были основаны на тех, кого мы ранее опубликованные 9,15.
- Expose спинной поверхности черепа, разрезав кожу лезвие скальпеля. Проанализируйте соединительной ткани, прилежащие кости с помощью кюретки Brudon. Очистите кости с помощью хлопка наконечником аппликаторы и хлопка марли. Применение костного воска (при необходимости) к черепу, чтобы остановить кровотечение через случайные мелкие вены эмиссара.
- Прикрепить титана или нержавеющей стали голове черепа (по области интересов, где краниотомии будет осуществляться) с помощью стоматологического цемента смешивается с черной краской (см. материалы). Прямоугольное отверстие в центре головы пластина обеспечивает доступ к трепанации черепа и оптических изображений. Прикрепите металлическую камеру на верхнюю часть головы пластину. Эта камера будет служить резервуаром для жидкости изображения с объективом погружением в воду.
- Закрепите голову пластину этапе ху использованием металлических штифтов.
- Тонкие большой площади кость в прямоугольное отверстие в headplate с помощью бормашины. Области, чтобы разбавлять должны распространяться далеко за пределы запланированного трепанации черепа. Толстый череп не-млекопитающих грызуны должны быть разбавлены, если изображения с высоким разрешением должны быть получены из коры головного мозга, потому что на месте трепанации черепа, толщина костей будет определять толщину агарозном между покровного стекла, и поверхность коры головного мозга (см. ниже) .
- Просверлите 2 х 2 мм квадратный контур в кости для трепанации черепа. Промойте камеры периодически со свежей искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF), чтобы удалить осколки кости и свести к минимуму рассеивание тепла к основной коры головного мозга. Применение костного воска по мере необходимости, чтобы остановить случайным кровотечением.
- Lifт костный лоскут с № 3 щипцов.
- Удалите все, кроме нижнего слоя оболочки с помощью тонкого пинцета (# 5CO) и ножницы Vannas весной. Оболочки, не связанных с грызунами млекопитающих толстым и непрозрачным, но может быть удален в разных слоях. Кровотечение бывает редко, но может быть остановлен с Gelfoam и любые остатки крови должны быть аккуратно удалены от остальных слой твердой мозговой оболочки с помощью пинцета и полоскания с ACSF. Последний слой твердой мозговой оболочки является прозрачной и мягкой мозговой оболочки сосудов должны быть ясно видны через него. Оставляя этот последний слой твердой мозговой оболочки неповрежденными во время внутренней визуализации сигнала будет увеличиваться вероятность успеха массовой загрузки флуоресцентных индикаторов кальция для последующего двухфотонного изображения этапе эксперимента (см. Обсуждение).
- Нанесите каплю теплого 2% агарозном (растворенного в ACSF) и сразу же разместить покровного стекла по трепанации черепа. Проверьте трепанацию черепа, чтобы дыхательной и сердечно-сосудистой пульсации являются минимальными с помощью хирургического рассечения микроскопа или окуляры двух-фотонного микроскопа в светлое поле режиме.
2. Внутренняя сигнала оптических изображений
- Добавить Гель-пена пропитанной ACSF вокруг внешней стороны покровного стекла, чтобы предотвратить агарозном от высыхания во внутренней визуализации сигнала.
- Прикрепите внутренний сигнал изображения CCD камеры к стандартному C-креплением порт на верхней из двух-фотонного микроскопа (рис. 1). Поместите освещающего источника света на воздух таблице возле сцены ху (рис. 1А). Положение и обеспечить световодов по трепанации черепа и headplate / камеры (рис. 1б). Уберите первичной дихроичным зеркалом и ниже C-креплением порт так, чтобы отраженный красный свет необходимых для внутреннего сигналы будут проходить непосредственно от трепанации черепа с ПЗС-камерой (рис. 1С-D). Использование 4x цель воздухе (0,13 NA, 17 мм WD), 2 х 2 мм поле зрения доступно для внутренней визуализации сигнала.
- Вставьте тепла фильтра в лРАВО путь, чтобы предотвратить коры от отопления. Используйте фильтр, который проходит зеленым светом (546 нм центр λ) и записывать цифровое изображение ссылкой корковых сосудов поверхности.
- Переместить фокус г до 500 мкм ниже поверхности коры. Используйте красный фильтр (630 нм центр λ), чтобы осветить коры для измерения внутренних сигналов. Установите световодов таким образом, что поверхности коры равномерно освещен. Щит трепанация черепа от света производится путем визуального отображения стимул. Представить последовательность зрительных стимулов и запись изображений отражения данных. Для создания ориентации карты в течение 10 мин, собирать данные, соответствующие 4 повторения последовательности из 8 раздражители (4 ориентаций и двух направлениях для каждой ориентации).
- Анализ внутренних данных сигнала для генерации ложных ориентации карты цвета. Выбор потенциальных целевых регионах в течение двух-фотонного маркировки нейронов, например, ориентация вертушки особенности - точки на карте, гдеВсе предпочтительной ориентации сходятся (рис. 2A). Перекрытие ориентации карты и изображения корковых сосудистой поверхности (рис. 2В-C). Используйте расположение функциональных областей и расположения крупных надводных кораблей для выбора цели, избегая мест с крупными кровеносными сосудами и артериол 15.
3. Массовая загрузка флуоресцентных индикаторов кальция
- Приготовить раствор из 20% Pluronic / DMSO, добавляя 1 г Pluronic в 5 мкл ДМСО. Смесь нагревают при 60 ° С в течение 10 мин до полного растворения Pluronic. Дайте смеси остыть до комнатной температуры. Добавить 4 мкл Pluronic / ДМСО смесь до 50 мкг флакон флуоресцентного индикатора кальция Орегон Зеленый 488 ВАРТА-1 AM (OGB-1 AM). Затем добавить 1 мкл красного красителя (Alexa Fluor 594, 2 мМ маточного раствора) и 35 мкл раствора пипеткой (см. материалы) для конечной концентрации 1 мМ OGB-1 утра. Разрушать ультразвуком решение для ½ часа вохлажденной водяной бане, а затем центрифуги с 0,45 мкм фильтр для удаления примесей.
- Потяните длинный конус пипетки с наружным диаметром кончика 2.0-2.5 мкм. Загрузите 5 мкл красителя смесь в пипетку.
- Удалить последний слой твердой мозговой оболочки для облегчения введения пипетки и получить высокое качество двухфотонного изображений.
- Определите точное место на поверхности коры, что пипетки должны быть помещены для того, чтобы достичь своей цели в корковом слое 2/3. Наши заданной корковых цель вертушки особенность в ориентации карты (рис. 2). Пипетки должны быть загнаны в коре на 30 градусов, чтобы пройти между стенкой камеры и объектива. Таким образом, для обозначения целевой области 200 мкм ниже поверхности коры, положение пипетки въезд на поверхности коры составит примерно 350 мкм боковой на целевую позицию (рис. 3 AB).
- Переместить этапе ху (на которой животное и рipette микроманипулятора помещаются) в центре коры позиции ввода поверхности под цели (рис. 3). Используйте 20x или 40x объективом с рабочим расстоянием (WD) не менее 3 мм (см. материалы) для того, чтобы пипетка будет легко войти в коре, не касаясь цели или кости вдоль стенки черепа. После вступления позицию по центру под цели, повысить Z положение цели на 2 мм (рис. 3D). С помощью зеленой флуоресценции свет включен, чтобы визуализировать красный Alexa красителя в пипетку, использовать диагональные оси микроманипулятора для перемещения пипетки, пока его кончик центру (и сосредоточился) под цели прямо над корковой позиции ввода поверхности ( Рисунок 3E).
- Опустите пипетку вертикально (вдоль оси), пока пипетку достигает поверхности коры (рис. 3F), в то время непрерывного просмотра пипетки через OCUЛарс микроскопа. Использование ярких поле освещения, поверхности коры кровеносных сосудов и остальные менингеальных оболочек (мягкой и паутинной) хорошо видны как пипетка подходит к поверхности коры. Если пипетка не достигают желаемой позиции ввода, повышение пипетки и калибровку таргетинг на основе сосудистые ориентиры на поверхности коры.
- Удалить цель, фитиль избыток спинномозговой жидкости из трепанация черепа и высушить соседние кости с помощью безворсовой копья поглощения. Нанесите каплю теплого 3% агарозы (растворяется в ACSF) для стабилизации коры, которая видна через трепанацию черепа (рис. 3G). В не-грызунов, 3% агарозном необходимо смочить пульсаций для успешного поглощения флуоресцентных красителей нейронами. Для внутренних сигналов оптических изображений только 2% агарозном необходимо, потому что сочетание 2% агарозном и покровного стекла обеспечивает необходимую стабильность. Здесь нет покровного стекла используется для красителя загрузки шаг, чтобы 3% агарозунеобходимо. После агарозном укрепил, вставить 40x объектив (0,8 Н.А., 3,3 мм WD) и повторно заполнить камеру с ACSF.
- Переход от светлого поля до двух фотонов просмотра и поиска пипетки. Используя диагональную ось микроманипулятора, переместите пипетку до его кончика достигает нужной глубине в коре головного мозга (рис. 3H). Иногда давление выброса клубы красителя смеси (несколько фунтов на квадратный дюйм, каждый импульс 0,1 сек) поможет предотвратить пипетки от засорения. Потому что OGB-1 я только становится видимым при входе в клетках, красный Alexa краситель имеет решающее значение для визуализации пипетки внутри коры головного мозга.
- Прежде чем приступить к загрузке нейронов в корковом слое 2/3 с полной дозы красителя, переориентировать цели на поверхности коры, чтобы подтвердить глубину кончика пипетки и убедитесь, что наконечник в целевом расположении на основе макета надводных кораблей крови. Если пипетка находится в слое 2/3, небольшие клубы красителя смесь должна горетьвнеклеточного пространства и выявить плотной сборки круговой тела клетки, как темные тени.
- Для загрузки тела нейронов в области коры 300-600 мкм в диаметре, вводят смесь красителя во внеклеточное пространство, используя 30-90 импульсов, каждый импульс 1,0 сек, 2-10 атм. Импульсы давления, не должно быть настолько сильным, что ткань двигается. После инъекции завершен, подождите несколько минут, затем удалите пипеткой и объективным. Подождите в течение 1 часа, чтобы позволить OGB-1 утра до полностью приняты меры по нейронам.
- Снимите агарозном используется для загрузки красителей и промыть записи камеры. Нанесите небольшое падение на 2-3% агарозном на поверхность и быстро разместить покровного стекла по трепанации черепа. Потому что флуоресцентные красители являются светочувствительными, избегать чрезмерной подвергая кору до ярко-поле или эпи-флуоресцентного света. Вставьте высокой NA (1,0) 20x цели в цель владельца и повторно-центра помечены зоны коры головного мозга под цели использования этапе ху. Щит трепанация черепа от бывшихпосторонним источникам света, например, визуального отображения стимула, с использованием нескольких слоев материала затемнение.
4. Single-клетки Electroporation флуоресцентных красителей
- Для изучения дендритной морфологии, приготовить раствор из 100 мкМ Alexa Fluor 594 (разведение 1:20 в ACSF 2 мМ Alexa Fluor 594 акций). Для функциональной визуализации дендритов соль OGB может быть использовано 16,17.
- Потяните длинный конус пипетки с наконечником размером 1 мкм и загрузить 5 мкл красителя в пипетку. Все остальные шаги таргетинг функциональной области идентичны основной метод загрузки (рис. 1-3). Чтобы разместить пипетки, прилегающих к нейрональной мембраны клеток организма, следить за увеличением импеданса электрода и оказать давление клубы краситель для освещения межклеточное пространство и увидеть клеточных тел, как тени в течение двух-фотонной обработки изображений.
- Когда кончик пипетки находится рядом с нейронной мембраны клеток организма, используйте Axoporator 800A применять1-3 импульсов (-8 до -10 В, 10 мс импульс). Непосредственное наполнение нейрона с красителем легко визуализированы с двухфотонной микроскопии. Удалите пипетки и собирать изображения с высоким разрешением дендритов и аксонов в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для иллюстрации точности наших красителей методами маркировки, мы нацелены на наименьшее микро-домен любой известной функциональной карты в не-грызунов коры головного мозга. Редким перемежается всей ориентации карты в первичной коры являются визуальные особенности. Они возникают в точках, где все привилегированные ориентаций сходятся так, что в ложных карт цвет предпочтительной ориентации, регионов вокруг сингулярности выглядят как "флюгеры" (рис. 2A-B). Один за вертушки трепанация черепа выбран для красителем маркировку (зеленый кружок на рис 2C), будучи уверенным, чтобы избежать больших сосудов и артериол, в частности, 15. С неполным загрузки OGB-1 AM, отслеживание изменений в нейронных флуоресценции индикатора кальция последовательность ориентированных решетки зрительных стимулов показывает, одноклеточные резолюции функциональные карты вокруг вертушки особенностей (рис. 4). С одной ячейке электропорации, пространственной организации дендритов и аксонов, как отИнгл нейронов расположены в особенности вертушки определяется в естественных условиях (рис. 5).
Рисунок 1. Внутренняя установка оптического сигнала изображения. (A) животное находится на стадии ху и внутренней визуализации сигнала осуществляется с помощью ПЗС-камеры установлены на двух-фотонного микроскопа. В качестве источника света и компьютер используется для управления изображениями сессии выведены на установку для внутренней обработки изображений и отошел, прежде чем двухфотонного изображения этапе эксперимента начинается. (B) Крупным планом вид на 4-кратным объективом и 630 нм освещением через жидкость световодов. Либо двумя направляющими свет крепятся к металлическим сообщений (слева), или одно кольцо освещает непосредственно прикреплен к цели (справа) могут быть использованы. Blackout материал, используемый для защитить объект от внешних источников освещения, например, визуального отображения стимулов, во время сессий оптических изображений, не показано. (C) Схема микроскопа и путь света в обычных двухфотонного изображений конфигурации. См. Дополнительный Рис. 20 в Shen и соавт. 2012 15 для описания полного двухфотонного света путь. Выдвижная зеркало расположено, чтобы отвлечь свет от лазера через дихроичный и на коре. Основной дихроичным, который проходит лазерный луч и отражает излучаемый свет от коры головного мозга к PMT, является переехала в пути света, поворачивая фильтр башни. (D) для внутренней визуализации зеркало убирается и фильтр башни включен для перемещения первичных дихроичным в сторону, позволяя прямой путь света от коры головного мозга к ПЗС-камеры. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 2. Использование функциональных карт, полученных с внутренней визуализации сигнал для выбора микро-домена для маркировки нейронов с флуоресцентными красителями. (А) Ориентация карты от кошки первичной зрительной коры приобретенных через внутренний сигнал оптического изображения. Цвет каждого пикселя представляет предпочтительную ориентацию в этом месте. Потенциальные ориентации вертушки особенности подходит для маркировки нейронов с флуоресцентными красителями показано в черные круги. (B) карты корковых сосудов поверхность накладывается с ориентацией карте. (C) Pinwheels в красные круги находятся вблизи крупных кровеносных сосудов или артериолы и таким вертушки сайт в зеленый круг выбран в качестве мишени для красителя маркировки. Пунктирный прямоугольник соответствует области показано на рисунке 3b. Шкала бар () 500 иму, т.
Рисунок 3. Оптимизация пипетки размещения для загрузки нейронов с флуоресцентными красителями. (А) Схематическое вид сбоку записи камеры показывает, что краситель загрузки сайта, чтобы быть направлены в зрительной коре (глаза красно-белых быков) составляет ~ 200 мкм ниже коры поверхность. Ху координат целевой соответствует расположение особенность ориентации вертушки определяется из внутренней визуализации сигнала. Пипетки войдет в коре на 30 ° угол. Если поверхности коры параллельно поверхности этапе ху, кончиком пипетки будет двигаться в сторону примерно 350 мкм до достижения вертушки особенность. (B) Вид сверху запись камеры показывает корковых сосудистой поверхности и положение пипетки запись (Красная звезда)-гона в 350 мкм от вертушки особенность. (C) положение ху этап регулируется таким образом, что положение пипетки ввода по центру под 20x или 40x цели (3.3-3.5 мм WD). (D) цель поднял ~ 2 мм. (E) пипетки выведен на трепанацию черепа и его конец находится непосредственно над входом положение на поверхности коры использованием зеленого эпи-флуоресцентного света. (F) пипетки и объективные снижаются одновременно с использованием светлого поля освещенности до корковых сосудов поверхности в центре внимания. (G) объективного и ACSF удаляются, а капли 3% агарозном наносится на трепанацию черепа. (H) Двухфотонные визуализации с 40x (0,8 Н.А., 3,3 мм WD) цели используется следовать пипетку до выбранного корковых глубину и вводят краситель. Убедившись, что нейроны успешно помечены флуоресцентным красителем, как правило, выше 20x NA Цель (1,0 Н.А., 2,0 мм WD) используется для сбора двухфотонного Т - и Z-серии данных. Схематический ы показано в, CH не в масштабе.
Рисунок 4. Переписка ориентации предпочтение в два фотона и внутренних сигналов изображения функциональных карт. (A) Двухфотонные отображаемого района с указанием клеточных тел помечены OGB-1 утра в зрительной коре слоя 2/3. (B) Ориентация предпочтение отдельным тела нейронов с того же сайта показано на рисунке (A). Вокруг вертушки особенность, которая была сосредоточена в отображаемой области организованной карте преимущественной ориентации стимула. (C) ориентация карты, полученные с внутренней визуализации сигнала. Черный квадрат соответствует области показано на рисунке (B). Эти данные были получены из того же эксперимента представлены на рис 2A-C и 3B. Шкала бар (AB) 100 мкм и (C) 500 мкм.
d/50025/50025fig5.jpg "/>
Рисунок 5. В естественных условиях морфологии одного нейрона в особенности вертушки ориентации. (A) дендриты и тело клетки отдельного нейрона обложил ориентации карты из той же визуальной корковой сайта. Нейрона электропорации с Alexa Fluor 594 при двухфотонном руководства, Z-Stack была собрана в естественных условиях, и дендритные процессы были прослежены форума Neurolucida использованием программного обеспечения. Ориентация карты была получена с помощью внутренней визуализации сигнала до одноклеточных электропорации. (B) Средняя интенсивность 10-мкм-Z-проекции из коркового слоя 1 показывает апикальных дендритов. (CD) Средняя интенсивность 10-мкм-Z-проекции коркового уровня 2/3 показать базальных дендритов и аксонов. Красные стрелки показывают шипами вдоль дендритов и белые стрелки указывают на отдельные аксоны. Шкала баров (AD) 100 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представляем метод для целевой маркировки тела нейронов (или дендритов и аксонов) в заранее определенных функциональных микро-областей коры головного мозга. Слияние внутреннего сигнала оптического изображения с двух-фотонной микроскопии дает возможность определить, какие синапсы клеток и способствуют микро-домен любого функционального карте, будь нейронов коррелирует с селективностью расположения нейронов в функциональную карту, и нейронные цепи компонентов , которые меняются с визуального восприятия 7 или применение лекарственных препаратов клинически 18.
Нет карты для ориентации стимула, направление глазного доминирования, или бинокулярное несоответствие было зарегистрировано в зрительной коре взрослого дикого типа грызунов 6,19-21. Тем не менее, легкость погрузки нейронов с флуоресцентными красителями и достижения стабильности изображения вместе с мощным генетических инструментов, доступных для мышей привело в подавляющем большинстве исследованийс помощью двух-фотонной визуализации головного мозга выполняется на грызунах, а хорьков, кошек и обезьян.
Высокое разрешение двухфотонных изображений нейронов, не связанных с грызунами млекопитающих может быть очень сложным из-за длительного времени операции, толстые кости и твердой мозговой оболочки, и дополнительные шаги, необходимые для поддержания дыхательной и сердечно-сосудистой опосредованное пульсации мозга к минимуму 15. Переходы от операции по внутренней визуализации сигнала и присущие двухфотонного изображения должны быть эффективными, требуют своевременной подготовки реагентов, красителей и выполнение микро-хирургических процедур. Использование двух-фотонного микроскопа для визуализации внутренней сигнала устраняет необходимость в большей части оборудования, используемого в обычных внутренней установки оптического сигнала изображения 22 и сокращает время, необходимое, чтобы установить внутреннюю изображений и переходе на последующие два фотона изображений.
Наш подход специально разработаны для обеспечения высокого разрешения двух фотоновтонна изображения в заранее определенных функциональных областях. Это обеспечивает минимальные перекрестные помехи функциональных сигналов между тела нейронов, а отдельные шипы дендритных и аксоны могут быть решены в естественных условиях. Использование высокой числовой апертурой (NA = 1,0) цели и заполнение задней апертурой объектива с пучком расширения оптики (см. дополнительный рис. 20 в Shen и соавт., 2012 15) являются критическими для изображений с высоким разрешением. В зависимости от скорости визуализации в XY и / или Z, дыхательной и сердечно-сосудистой пульсации может привести к снижению эффективного разрешения изображения независимо от того, насколько хорошо НС и оптического пути света. Ограничивая трепанация черепа размером в не-грызунов до 2 х 2 мм, используя относительно высокие концентрации агарозы с покровного стекла, а также выполнение пневмоторакс и поясничного подвески при необходимости 15, пульсации мозга ограничено до 1-2 мкм. Минимизация дыхательной и сердечно-сосудистой индуцированных пульсации коры головного мозга до 1-2 мкм во время массовыхзагрузка кальция показатели также гарантирует, что кора образуется уплотнение вокруг вставленной пипеткой и что никаких красителей треков вдоль хвостовика пипеткой поверхности коры. Выбор красителя инъекций и обработки изображений участкам вдали от больших артериол также имеет важное значение для высокого качества функциональной визуализации, потому что относительно быстро сенсорно-вызванные гиперемия (гемодинамическая) артефакты будут исключены 15.
На сайте трепанация черепа, в результате чего последний слой твердой мозговой оболочки нетронутыми всей внутренней визуализации сигнала и флуоресцентного красителя фазы подготовки - таким образом удалив его перед пипетки вставки в коре для загрузки красителя - увеличивает скорость успех и качество маркировки нейронов в следующем способами: (1) сохраняет поверхности коры чистой и / или предотвращает дурального отрастания ткани так, чтобы кончик пипетки, менее вероятно, забиваются и прозрачность тканей сохраняется, (2) избавляет от агарозы используется для внутренней сенсорной изображений Cortческих поверхности кровеносных сосудов, которые могут быть повреждены при агарозном удаляется, (3) предотвращает агарозном использоваться во внутренней визуализации попадания между твердой мозговой оболочки и коры под черепом по краям черепа. Агарозы в этих регионах позволит увеличить расстояние между покровного стекла и поверхности коры мозга, что делает включение пипетки сложнее, приводит к сжатию корковой ткани и снижает прозрачность для изображений.
При подготовке сообщения флуоресцентных красителей для массовой загрузки, 20% Pluronic / ДМСО смесь никогда не должны использоваться за 1 неделю от своей первоначальной подготовки - старые Pluronic / ДМСО гасит флуоресценцию. Для оптимальной загрузки объемных многих соседних органов клетки с функциональным показателем, например, OGB-1 AM, краситель смесь хранили на льду, загруженные в пипетку по мере необходимости, но всегда вводили в мозг в течение 2 часов его подготовки.
В объемной фазы загрузкиэксперимент, повторять 1 сек импульсов давления, а не непрерывного введения 1 мин позволяет итерационным калибровку параметров выброса, который гарантирует, что чрезмерное красителей или давления не применяется. Из-за возможного повреждения тканей из нескольких вставок пипетки необходимы для обозначения очень больших регионов тканей и потенциальной токсичностью из больших объемов Pluronic / ДМСО из таких серий много инъекций, мы предпочитаем один 300-600 мкм красителя в местах инъекций 2 х 2 мм трепанации черепа. По сравнению с слепой инъекции 14, двухфотонное визуальной навигацией вокруг кровеносных сосудов, использование отрицательного контраста тела нейронов, чтобы определить положение пластинки, и замер распространения красителя от давления выброса в качестве показателя объема клетки, которые будут помечены OGB-1 AM, улучшает качество красителя нагрузки в не-грызун препаратов.
В протоколе описываются здесь приводит к успешному маркировки нейронов с флуоресцентными красителями в смолуgeted микро-доменов в каждом животном пытался. Для массовой загрузки с OGB-1 AM, мы последовательно получим зрительно-вызванных ответов в 75-100% от отображаемого одновременно нейронов 9,15 и техника чувствительна к обнаружению одного потенциалов действия в естественных 23,24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Национального института глаза R01EY017925 и R21EY020985 и финансирование из Dana & Whitehall основы для PK Мы также благодарим Мэтью Петрелья за помощь в хирургических процедурах, Грейс Dion для отслеживания дендритов показано на рисунке 5А и Pratik Chhatbar для замечания по рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||
| 1. Life support/experiment prep | |||||||||
| Isoflurane | Webster Vet | NDC 57319-474-05 | |||||||
| Isoflurane vaporizer | Midmark | VIP 3000 | |||||||
| Feedback regulated heating blanket | Harvard Apparatus | 50-7079F | |||||||
| ECG monitor | Digicare Biomedical | LifeWindow Lite | |||||||
| EEG amplifier | A-M Systems | 1800 | |||||||
| EEG display monitor | Hewlett Packard | 78304A | |||||||
| End tidal CO2 monitor | Respironics | Novametrix Capnoguard 1265 | Optimize ventilation | ||||||
| Carbide drill burrs for drilling bone | Henry Schein | fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip) | |||||||
| Cement for headplate/chamber | Dentsply | 675571, 675572 | |||||||
| Black Powder Tempera Paint | Sargent Art Inc. | 22-7185 | Add to cement to improve light shielding and reduce reflections | ||||||
| Agarose - Type III-A | Sigma | A9793 | For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging | ||||||
| Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness | World Precision Instruments | 502040, 502041 | For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed | ||||||
| Brudon curettes | George Tiemann | 105-715-0, 105-715-3 | Cleaning skull surface | ||||||
| Bone wax | Ethicon | W31G | Quickly stop bleeding | ||||||
| Cotton Tipped Applicator | Electron Microscopy Sciences | 72308-05 | Clean and dry bone surface | ||||||
| Dumont #5CO Forceps | Fine Science Tools | 11295-20 | Grab individual layers of dura or pia | ||||||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | Cut dura | ||||||
| Gelfoam | Pfizer | 09-0396-05 | To stop bleeding on the dura | ||||||
| Absorption spears | Fine Science Tools | 18105-01 | Ultra-fast and lint-free wicking of CSF | ||||||
| Blackout material | Thorlabs | BK5 | Shield craniotomy | ||||||
| 2. Dye preparation / injection | |||||||||
| Dimethyl Sulphoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |||||||
| Pluronic | Sigma | P2443 | |||||||
| Oregon Green 488 Bapta-1 AM | Invitrogen | O6807 | Calcium indicator | ||||||
| Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A10438 | |||||||
| Centrifugal filter (0.45 μm pore size) | Millipore | UFC30HV00 | To remove impurities before injection | ||||||
| Glass pipette puller | Sutter Instruments | P97 | |||||||
| Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) | World Precision Instruments | 1B150F-4 | Dye ejection pipette | ||||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956 003 | For loading dye into pipette | ||||||
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | To position pipette | ||||||
| Pressure pulse controller | Parker Hannifin | PicoSpritzer III | For pressure injection of the dye | ||||||
| Single-cell electroporator | Molecular Devices | Axoporator 800A | For electroporation of the dye | ||||||
| 3. Intrinsic imaging | |||||||||
| 4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) | Olympus | UPLFLN4X | |||||||
| Intrinsic hardware / software | Optical Imaging Inc. | Imager 3001 / VDAQ | VDAQ software is used for episodic imaging | ||||||
| CCD Camera | Adimec | Adimec-1000 | |||||||
| Light source power supply | KEPCO | ATE 15-15M | |||||||
| Light source | Optical Imaging Inc. | HAL 100 | Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW | ||||||
| Green filter (for vascular image) | Optical Imaging Inc. | λ = 546 nm (bandpass 30 nm) | For reference image of surface vasculature | ||||||
| Red filter (for intrinsic signal) | Optical Imaging Inc. | λ = 630 nm (bandpass 30 nm) | To collect intrinsic signals | ||||||
| Heat filter | Optical Imaging Inc. | KG-1 | |||||||
| 4. Two-photon rig/imaging | |||||||||
| Two-photon microscope and software | Prairie Technologies | See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power | |||||||
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai XF | |||||||
| 20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) | Olympus | UMPLFLN20X | 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging) | ||||||
| 20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) | Olympus | XLUMPLFLN20X | |||||||
| 40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) | Olympus | LUMPLFLN40X/IR | |||||||
| Air table | Newport | ST-200 | Isolates preparation from external vibrations | ||||||
| xy stage | Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA) | Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage | |||||||
|
|||||||||
References
- Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
- Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
- Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns. Nature. 353, 429-431 (1991).
- Ohki, K., et al. Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels. Nature. 442, 925-928 (2006).
- Shmuel, A., Grinvald, A. Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18. J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).
- Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
- Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity. Nature. 456, 952-956 (2008).
- Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex. Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).
- Kara, P., Boyd, J. D. A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex. Nature. 458, 627-631 (2009).
- da Costa, N. M., Martin, K. A. Whose Cortical Column Would that Be. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16 (2010).
- Kaschube, M., et al. Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex. Science. 330, 1113-1116 (2010).
- Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex. Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).
- Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, 501-505 (2011).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
- Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).
- Nevian, T., Helmchen, F. Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation. Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).
- Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).
- Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex. Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471, 177-182 (2011).
- Rochefort, N. L., et al. Development of direction selectivity in mouse cortical neurons. Neuron. 71, 425-432 (2011).
- Mrsic-Flogel, T. D., et al. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-972 (2007).
- Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. Brain mapping: The Methods. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).
- Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
- Hofer, S. B., et al. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).
