Riktad Märkning av nervceller i specifika funktionella Micro-domän neocortex genom att kombinera Intrinsic Signal och två-photon Imaging

Summary

Ett förfarande beskrivs för märkning neuroner med fluorescerande färgämnen i förutbestämda funktionella mikro-domäner av neocortex. Först, är inneboende signalen optisk avbildning används för att erhålla en funktionell karta. Sedan två-foton-mikroskopi används för att märka och neuroner bild inom en mikro-domänen i kartan.

Abstract

I den primära syncentrum av icke-gnagare däggdjur är nervceller grupperas enligt deras preferens för stimulans funktioner som orientering ^1-4, riktning ^5-7, okulär dominans ^8,9 och kikare skillnad ^9. Orientering selektivitet är den mest studerade funktion och en kontinuerlig karta med en kvasi-periodisk layout för föredragen orientering finns över hela primära syncentrum ^10,11. Att integrera de synaptiska, cellulära och nätverk insatser som leder till stimulans selektiva svar i dessa funktionella kartor kräver hybridisering av avbildningstekniker som spänner submikrona till millimeter rumsliga skalor. Med konventionell inneboende signal optisk avbildning, kan den övergripande utformningen av funktionella kartor över hela ytan av syncentrum bestämmas ^12. Utvecklingen av in vivo två-foton-mikroskopi med användning kalciumkänsliga färger möjliggör att man kan bestämma synaptic-ingång anländer till enskilda Dendritutskotten ¹³ eller spela aktivitet samtidigt från hundratals enskilda neuronala cellkroppar ^6,14. Följaktligen kombinerar inneboende signal avbildning med sub-mikron rumsliga upplösningen i två-foton-mikroskopi ger möjlighet att bestämma exakt vilka dendritiska segment och celler bidrar till mikro-domänen av varje funktionell karta i hjärnbarken. Här visar vi en hög avkastning metod för att snabbt få en kortikal orientering karta och inriktad på ett specifikt mikro-domän i denna funktionella karta för märkning nervceller med fluorescerande färgämnen i ett icke-gnagare däggdjur. Med samma mikroskop som används för två-photon avbildning skapar vi först en orientering kartan med hjälp inneboende signal optisk avbildning. Sedan visar vi hur du kan rikta en mikro-domän av intresse med en mikropipett lastad med färg till antingen etikett en population av neuronala celler organ eller etikett en enda neuron så att dendriter, ryggar och axoner syns ivivo. Våra förbättringar jämfört med tidigare metoder underlättar en undersökning av neuronala struktur-funktionssamband med sub-cellulära upplösning inom ramen för hjärnbarkens funktionella arkitektur.

Protocol

1. Kirurgisk beredning

1. Inducera anestesi och kontinuerligt övervaka hjärtfrekvens, avslutar tidvatten CO _2, EEG, och temperatur. Alla förfaranden har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén för medicinska universitetet i South Carolina och baserades på de som vi tidigare publicerat ^9,15.
2. Exponera den dorsala ytan av skallen genom att skära huden med ett skalpellblad. Dissekera bindväv överliggande benet med hjälp av en Brudon kyrett. Rengör benet med bomull tippas applikatorer och gasväv. Applicera benvax (efter behov) till skallen, för att stoppa enstaka blödning genom små sändebud vener.
3. Bifoga en titan eller rostfritt stål huvudplattan till skallen (över området av intresse där kraniotomi kommer att utföras) genom att använda dentala cement blandat med svart färg (se material). En rektangulär öppning i mitten av huvudplattan ger tillträde för kraniotomi och optisk avbildning. Fäst en metall kammare på toppen av huvudet plattan. Denna kammare kommer att fungera som en vätskereservoar för avbildning med nedsänkning i vatten objektivlinsen.
4. Fäst huvudplattan till en xy steg med metall inlägg.
5. Tunna ett stort område av benet inom den rektangulära öppningen av huvudplattan med hjälp av en tandläkarborr. Det område som ska gallras måste sträcka sig långt utanför gränserna för den planerade kraniotomi. Den tjocka skalle av icke-gnagare däggdjur skall förtunnas om högupplösta bilder som kan förvärvas från hjärnbarken eftersom i kraniotomi plats kommer tjockleken av ben diktera tjocklek agarosen mellan täckglas och hjärnbarkens yta (se nedan) .
6. Borra ett 2 x 2 mm kvadratisk kontur i benet för kraniotomi. Skölj kammaren periodiskt med färsk artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) för att avlägsna ben skärvor och minimera värmeavledning till underliggande cortex. Applicera benvax som behövs, för att stoppa enstaka blödning.
7. Lift benklaffen med en # 3 pincett.
8. Ta bort alla men bottenlagret av dura hjälp av en fin tång (# 5co) och Vännäs sax våren. Dura i icke-gnagare däggdjur är tjock och opak men kan avlägsnas i distinkta skikt. Blödning är ovanligt men kan stoppas med Gelfoam och något blod rester avlägsnas varsamt från den återstående lagret av dura använda pincett och sköljning med ACSF. Det slutliga skiktet av dura är transparent och pial fartyg bör vara väl synlig genom den. Lämnar denna sista lagret av dura intakt under inneboende signal avbildning ökar andelen framgångsrika bulk laddning av fluorescerande kalcium indikatorer för den efterföljande två-photon avbildning fas av försöket (se diskussion).
9. Applicera en droppe varm 2% agaros (löst i ACSF) och omedelbart placera en täckglas över kraniotomi. Kontrollera kraniotomi att respiratoriska och kardiovaskulära pulsationer är minimala genom en kirurgisk dissektionsmikroskop eller okularen i två-foton mikroskop i ljusa fält läge.

2. Inneboende Signal optisk avbildning

1. Lägg gel-skum indränkt med ACSF runt utsidan av täckglas för att förhindra att agarosen från torkning under inneboende signaler avbildning.
2. Fäst den inneboende signalen avbildning CCD-kamera till standard C-fäste port på toppen av två-photon mikroskop (Figur 1). Placera belysande ljuskällan på luftbordet nära xy stadiet (figur 1A). Placera och säkra ljusledare över kraniotomi och huvudplattan / kammare (Figur 1B). Dra in den primära dikroiska och spegeln under C-fäste port så att det reflekterade rött ljus som behövs för inneboende signaler passerar direkt från kraniotomi till CCD-kamera (Figur 1C-D). Använda 4x luft målet (0,13 NA, 17 mm WD), en 2 x 2 mm synfält finns för inneboende signaler avbildning.
3. Sätt en värme filter i Light väg att förhindra cortex från uppvärmning. Använd ett filter som passerar grönt ljus (546 nm centrum λ) och spela in en digital referens bild av kortikala ytfartyg blod.
4. Flytta z fokus till 500 um under den kortikala ytan. Använd ett rött filter (630 nm centrum λ) för att belysa cortex för att mäta inre signaler. Placera ljusledarna så att den kortikala ytan likformigt belyses. Skydda kraniotomi från ljuset som produceras av den visuella stimuli visas. Presentera en sekvens av visuella stimuli och spela reflektans bilder data. För att generera en orientering karta inom 10 minuter, samla in data motsvarande 4 upprepningar av en sekvens av 8 stimuli (4 riktlinjer och två riktningar för varje orientering).
5. Analysera de inneboende signal för att generera en falsk karta färg orientering. Välj potentiella målregioner för två-photon märkning av neuroner, t.ex. orientering lyckohjul singulariteter - punkter i kartan däralla föredragna orienteringar konvergerar (figur 2A). Överlagra orientering kartan och bilden av den kortikala ytan vaskulaturen (Figur 2B-C). Använd layouten av funktionella domäner och platsen för stora ytfartyg att välja ett mål, undviker platser med stora blodkärl och arterioler ^15.

3. Bulkutlastning av fluorescerande Calcium indikatorer

1. Bered en lösning av 20% Pluronic / DMSO genom att tillsätta 1 g Pluronic i 5 pl DMSO. Värm blandningen vid 60 ° C under 10 minuter för fullständig upplösning av Pluronic. Låt blandningen svalna till rumstemperatur. Tillsätt 4 | il av Pluronic / DMSO blandningen till en 50 | ig flaska av fluorescerande kalcium indikatorn Oregon Grön 488 BAPTA-1 AM (OGB-1 AM). Tillsätt sedan 1 ^ il av ett rött färgämne (Alexa Fluor 594, 2 mM stamlösning) och 35 pl av pipett-lösning (se Material) för en slutlig koncentration av 1 mM OGB-1 AM. Sonikera lösningen för ½ timme ien kylt vattenbad och centrifugera sedan med ett 0,45 pm filter för att avlägsna föroreningar.
2. Dra en lång kona pipett med en yttre spets diameter på 2,0-2,5 um. Fyll 5 pl av färgämnet blandningen in i pipetten.
3. Ta bort den sista lagret av dura att underlätta pipett insättning och få högsta kvalitet två-photon bilder.
4. Bestämma den exakta platsen på den kortikala ytan att pipetten måste placeras för att nå sitt mål i kortikal lager 2/3. Vår förutbestämda kortikal mål är en vindsnurra singularitet i orienteringen kartan (fig. 2). Pipetten skall drivas in i hjärnbarken vid en 30 ° vinkel för att passera mellan kammarväggen och målet. Således, för att märka målregionen 200 um under den kortikala ytan, kommer pipetten posten position på den kortikala ytan vara cirka 350 um laterala till målpositionen (figur 3 AB).
5. Flytta xy-stadiet (där djuret och pipette mikromanipulator placeras) för att centrera den kortikala ytan posten läge under målet (figur 3C). Använd en 20x eller 40x objektiv med ett arbetsavstånd (WD) av minst 3 mm (se Material) för att säkerställa att pipetten lätt kommer in cortex utan att vidröra målet eller benet längs väggen av kraniotomi. När posten position centrerad under målet, höja Z-position av målet med 2 mm (figur 3D). Med den gröna epi-fluorescens ljus aktiverat i pipetten visualisera röda Alexa färg, använd diagonala axel mikromanipulator att flytta pipetten tills dess spets är centrerad (och fokuserad) under målet direkt ovanför den kortikala ytan posten läge ( Figur 3E).
6. Sänk pipetten vertikalt (längs z-axeln) tills pipetten når den kortikala ytan (figur 3F), under kontinuerlig tittar pipettspetsen genom OCUlars av mikroskopet. Använda ljust fält belysning, den kortikala ytan blodkärlen och resterande meningeal membran (Pia och spindelvävshinnan) är väl synlig som pipetten närmar sig kortikala ytan. Om pipetten inte når önskad post position höjer pipetten och kalibrera inriktning bygger på vaskulära landmärken på den kortikala ytan.
7. Ta bort målet, Wick överskott cerebrospinalvätska från kraniotomi och torka den intilliggande ben med luddfria absorption spjut. Applicera en droppe varm 3% agaros (upplöst i ACSF) för att stabilisera cortex som är synlig genom kraniotomi (figur 3G). I icke-gnagare, är 3% agaros nödvändig för att dämpa svängningar för framgångsrik upptag av fluorescerande färgämnen av neuroner. För inneboende signal optisk avbildning endast 2% agaros behövs eftersom kombinationen av 2% agaros och täckglas ger den nödvändiga stabiliteten. Här är ingen täckglas används för färg-lastning steg så 3% agarosnödvändigt. Efter att agarosen har stelnat, sätt en 40x objektiv (0,8 NA, 3,3 mm WD) och åter fylla kammaren med ACSF.
8. Växla från ljus-fältet till två-photon visning och leta pipettspetsen. Använda diagonala axeln hos mikromanipulator, flytta pipetten tills dess spets når det önskade djupet i cortex (figur 3H). Enstaka tryck utkastningskrafterna puffar av färgblandningen (några psi, varje puls 0,1 sek) hjälper till att förhindra pipettspetsen från igensättning. Eftersom OGB-1 är bara syns på att ange celler är röda Alexa färgämnet kritisk för visualisering av pipettspetsen inuti hjärnbarken.
9. Innan försöker ladda neuroner i kortikal lager 2/3 med full dos av färgämne, åter fokusera målet på den kortikala ytan för att bekräfta djupet av pipettspetsen och säkerställa att spetsen är i målläget baserad på layouten för yta blodkärl. Om pipetten är i lager 2/3, bör små puffar av färgämnet blandningen belysaextracellulära rummet och avslöjar en tät montering av runda cellkroppar som mörka skuggor.
10. För lastning neuronala cellkroppar i en sfär av cortex 300-600 nm diameter injicera färgämne blandningen i det extracellulära utrymmet med 30-90 pulser, varje puls 1,0 sek, 2-10 psi. Pulserna av tryck bör inte vara så stark att vävnaden rör sig. Efter injektionen är klar, vänta några minuter, ta sedan bort pipetten och mål. Vänta på 1 timme för att låta OGB-1 AM för att vara helt tas upp av nervceller.
11. Avlägsna agaros användes för färgämnet lastning och skölj inspelningen kammaren. Lägg en liten droppe 2-3% agaros på ytan och snabbt placera en täckglas över kraniotomi. Eftersom de fluorescerande färgämnen är ljuskänslig, undvika att överexponera cortex till ljus-fält eller epi-lysrör. Sätt i ett högt NA (1,0) 20x mål i målet hållaren och centrera den märkta kortikala regionen under målet med xy scenen. Skydda kraniotomi från extraneous ljuskällor, t.ex. visuell stimulans display, med flera lager av blackout material.

4. Encelliga Elektroporering av fluorescerande färgämnen

1. För att studera dendritiska morfologi, preparera en lösning av 100 M Alexa Fluor 594 (01:20 utspädning i ACSF av 2 mM Alexa Fluor 594 lager). För funktionell avbildning av dendriter en OGB salt kan användas ^16,17.
2. Dra en lång avsmalnande pipett med en spets storlek av 1 um och ladda 5 il färgämne in i pipetten. Alla andra steg av att en funktionell domän är identiska med den bulkutlastning metoden (figur 1-3). För att placera pipettspetsen intill en neuronal cell kropp membran, övervaka den ökade elektrodimpedansen och utöva påtryckningar puffar färg för att belysa det extracellulära utrymmet och se cellkroppar som skuggor under två-photon avbildning.
3. När pipettspetsen är intill en neuronal cellkroppen membran, använd Axoporator 800A att tillämpa1-3 pulser (-8 till -10 V, 10 msek puls). Den omedelbara fyllning av neuron med färgämnet är lätt visualiseras med två-foton-mikroskopi. Ta pipetten och samla högupplösta bilder av dendriter och axoner in vivo.

Representative Results

För att illustrera precisionen i våra färgämne märkningsmetoder, riktade vi den minsta mikro-domänen av någon känd funktionell karta i den icke-gnagare neocortex. Glest inrutat hela orienteringen kartan i den primära syncentrum är singulariteter. Dessa uppträder vid punkter där alla föredragna orienteringar konvergerar så att felaktiga färger kartor över föredragen orientering, regionerna kring singularitet ser ut "vindsnurror" (Figur 2A-B). En lyckohjul per kraniotomi är valt för färg märkning (grön cirkel i figur 2C), var noga med att undvika stora fartyg och arterioler i synnerhet ^15. Med bulk-lastning av OGB-1 AM, avslöjar spåra ändringar i neuronala kalcium indikator fluorescens till en sekvens av orienterade galler visuella stimuli encelliga upplösning funktionella kartor runt lyckohjul singulariteter (Figur 4). Med encelliga elektroporering, den rumsliga organisationen av dendriter och axoner från såIngle neuron placerad vid en vindsnurra singularitet bestäms in vivo (figur 5).

Figur 1. Inneboende signalen optisk avbildning inställning. (A) Djuret placeras på xy scenen och inneboende signal avbildning utförs via en CCD-kamera monterad på två-foton-mikroskop. Ljuskällan och dator används för att styra avbildning session förs över till inställningarna för inneboende avbildning och flyttade bort innan två-photon avbildning fas av försöket börjar. (B) Närbild vy av 4x målet och 630 nm belysning genom flytande ljusledare. Antingen två ljusledare bifogas metall inlägg (vänster), eller en enda upplysande ring fäst direkt målet (höger) kan användas. Blackout material som används för skydda målet från externa ljuskällor, är t.ex. visuell stimulans displayen under optisk avbildning sessioner visas inte. (C) Skiss över mikroskop och ljusstrålen i den konventionella två-photon avbildning konfiguration. Se Kompletterande Bild. 20 i Shen et al. 2012 ¹⁵ för en beskrivning av den fullständiga två-foton ljusbana. Den indragbara spegeln är placerad för att avleda ljus från lasern genom den dikroiska och på hjärnbarken. Den primära dikroiska, som passerar laserstrålen och reflekterar det emitterade ljuset från hjärnbarken till PMT, förflyttas in i ljusbanan genom att vrida revolverhuvudet filtret. (D) För inneboende avbildning spegeln dras tillbaka och filtret tornet vrids för att flytta den primära dikroiska ur vägen, så att en direkt Ijusväg från hjärnbarken till CCD-kameran. Klicka här för att se större bild .

nt "FO: keep-together.within-page =" alltid ">

Figur 2. Använda funktionella kartor som erhålls med inneboende signal avbildning för att välja en mikro-domän för märkning nervceller med fluorescerande färgämnen. (A) Orientering karta från katt primära syncentrum förvärvade genom inneboende signal optisk avbildning. Färgen på varje pixel representerar den föredragna orienteringen vid detta ställe. Potentiella orientering Pinwheel singulariteter lämpliga för märkning neuroner med fluorescerande färgämnen visas inom svarta cirklar. (B) karta av kortikala ytfartyg blod överlagras med orienteringen kartan. (C) Pinwheels inom röda cirklar är nära stora blodkärl eller arterioler och så lyckohjul plats inom den gröna cirkeln väljs som mål för färg märkning. Den streckade rektangeln motsvarar den region som visas i figur 3B. Skala bar i (A) 500 &mu, m.

Figur 3. Optimera pipetten placering för lastning nervceller med fluorescerande färgämnen. (A) Schematisk sidovy av inspelningen kammaren visar att färgämnet lastning webbplatsen riktas i syncentrum (röd-vit prick) är ~ 200 nm under den kortikala yta. Xy koordinat målet motsvarar platsen för en orientering VINDSNURRA singularitet bestäms från inre signaler avbildning. Pipetten kommer in cortex vid en 30 ° vinkel. Om den kortikala ytan är parallell med xy-steg yta, kommer pipettspetsen röra sig i sidled ungefär 350 um innan de når vindsnurra singularitet. (B) ovanifrån inspelning kammare visar den kortikala ytan kärlsystemet och pipetten posten läge (röd stjärna) epå är 350 um från lyckohjul singularitet. (C) xy steget läge justeras så att pipetten posten position centrerad under 20x eller 40x objektiv (3,3-3,5 mm WD). (D) Målet höjs ~ 2 mm. (E) Pipetten bringas över kraniotomi och dess spets är belägen direkt ovanför posten position på den kortikala ytan med grön epi-fluorescerande ljus. (F) pipett och mål sänks samtidigt med ljust fält belysning tills kortikala ytan blodkärlen kommit i fokus. (G) Målet och ACSF avlägsnas och en droppe av 3% agaros anbringas över kraniotomi. (H) två-foton-visualisering med en 40x (0,8 NA 3,3 mm WD) målet användes för att följa pipetten nedåt till den valda kortikala djup och injicera färgämnet. Efter bekräftelse på att neuroner framgångsrikt märkta med fluorescerande färgämne, typiskt en högre NA 20x objektiv (1,0 NA, 2,0 mm WD) används för att samla upp två-foton t - och z-serien uppgifter. Schematisk ar visat i A, CH inte skalenliga.

Figur 4. Korrespondens av orientering preferens i två-photon och inneboende funktionella signal avbildning kartor. (A) två-photon avbildade området visar cellkroppar märkta med OGB-1 AM i syncentrum lager 2/3. (B) Inriktning föredrar individuella neuronala cellkroppar från samma plats som visas i (A). Runt lyckohjul singularitet som centrerad i avbildade regionen är en organiserad karta över föredragna stimulans orientering. (C) orientering karta erhållen med inneboende signal avbildning. Den svarta fyrkanten motsvarar den region som visas i (B). Dessa data erhölls från samma experiment som visas i figurerna 2A-C och 3B. Skala bar i (AB) 100 ^ m och (C) 500 | im.

d/50025/50025fig5.jpg "/>
Figur 5. In vivo morfologi av en enda neuron vid en orientering VINDSNURRA singularitet. (A) dendriter och cellkroppen av en enda neuron överlagras med orienteringen karta från samma visuella kortikala plats. Neuron elektroporerades med Alexa Fluor 594 under två-foton vägledning har en z-stapel samlats in vivo och dendritiska processer spårades offline med Neurolucida programvara. Orientering karta erhölls med inneboende signal avbildning före encelliga elektroporering. (B) Genomsnittlig intensitet 10-um-z-projektion från kortikal lager 1 visar apikala dendriter. (CD) medelintensitet 10-um-Z-prognoser från kortikal lager 2/3 visar basala dendriter och axoner. Röda pilar visar ryggar längs dendriter och vita pilar pekar på enskilda axoner. Skala barer i (AD) 100 nm.

Discussion

Vi presenterar en metod för att rikta märkningen av neuronala celler organ (eller dendriter och axoner) i förutbestämda funktionella mikro-domäner av neocortex. Sammanfoga inneboende signal optisk avbildning med två-foton-mikroskopi erbjuder möjligheten att bestämma vilka synapser och celler bidrar till mikro-domänen av varje funktionell karta, oavsett neuronala selektivitet korrelerar med placeringen av neuron i en funktionell karta, och det neuronala kretskomponenterna denna förändring med visuell upplevelse ⁷ eller tillämpning av kliniskt terapeutiska läkemedel ^18.

Inga kartor för stimulans orientering, riktning, okulär dominans eller binokulär skillnad har rapporterats i syncentrum av vuxna vildtyp gnagare ^6,19-21. Emellertid har enkel lastning neuroner med fluorescerande färgämnen och uppnå stabilitet avbildning, tillsammans med de kraftfulla genetiska verktyg för möss resulterade i de allra flesta studiermed hjälp av två-foton-avbildning av hjärnbarken utförs i gnagare istället för illrar, katter och apor.

Högupplöst två-photon avbildning av nervceller i icke-gnagare däggdjur kan vara mycket utmanande på grund av långa kirurgi gånger, tjockare ben och dura och extra steg behövs för att hålla andnings-och hjärt-medierade pulsationer i hjärnan till ett minimum ^15. Övergångar från operation till inneboende signal bildbehandling och inneboende två-photon avbildning måste vara effektiva, vilket kräver tid förbereda reagenser, färgämnen och genomförandet av mikro-kirurgiska ingrepp. Använda två-photon mikroskop för inneboende signal avbildning undanröjer behovet för mycket av den utrustning som används i konventionella inneboende signal optisk avbildning riggar ²² och minskar den tid som krävs för att installera inneboende bildbehandling och övergång till efterföljande två-photon avbildning.

Vår strategi är speciellt utformad för att ge hög upplösning två-photon imaging i förutbestämda funktionella domäner. Detta ger minimal överhörning av funktionella signaler mellan neuronala cellkroppar och enskilda taggar dendritiska och axoner kan lösas in vivo. Med hjälp av en hög numerisk apertur (NA = 1,0) mål och fylla den bakre öppningen av målet med optik strålexpansion (se kompletterande Bild. 20 i Shen et al., 2012 ¹⁵⁾ är avgörande för högupplöst bildbehandling. Beroende på hur snabbt avbildning i XY och / eller Z kan respiratoriska och kardiovaskulära pulsationer minskar den effektiva avbildning upplösning oavsett hur bra NA och optiska Ijusväg är. Genom att begränsa kraniotomi storlek i icke-gnagare till 2 x 2 mm, med den relativt högre koncentration av agaros med täckglas, och utför en pneumothorax och ländrygg fjädring vid behov ^15, hjärnan pulsationer är begränsade till 1-2 pm. Minimera respiratoriska och kardiovaskulära inducerade pulsationer i neocortex till 1-2 um under bulklastning av kalcium indikatorer också säkerställer att cortex bildar en tät försegling runt den införda pipetten och att inget färgämne spårar upp längs skaftet av pipetten till den kortikala ytan. Välja färg injektion och platser avbildning från stora arterioler är också kritisk för hög kvalitet funktionell avbildning eftersom relativt snabba sensorisk-framkallade hyperemi (hemodynamisk) artefakter kommer att uteslutas ^15.

På kraniotomi webbplatsen, lämnar sista lagret av dura intakt hela inre signaler bildbehandling och fluorescerande färgämne faser förberedelse - och därmed ta bort den strax innan pipetten insättning i hjärnbarken för färgen lastning - ökar framgång och kvalitet neuronal märkning i följande sätt: (1) håller den kortikala ytan ren och / eller förhindrar dural vävnad återväxt så att pipettspetsen är mindre sannolikt att bli igensatta och insynen i vävnaden bibehålls, (2) undviker agarosen som används för inneboende avbildning vidrör Cortical yta blodkärl som kan skadas när agarosen avlägsnas, (3) förhindrar agaros används under inneboende avbildning från att komma in mellan dura och cortex under skallen runt kanterna på kraniotomi. Agaros i dessa regioner kommer att öka avståndet mellan täckglas och den kortikala ytan som gör införandet av pipetten svårare, leder till komprimering av den kortikala vävnaden och minskar insynen för avbildning.

Vid utarbetandet av AM fluorescerande färgämnen för bulklaster bör 20% Pluronic / DMSO blandning aldrig användas längre än 1 vecka från sin ursprungliga preparatet - gamla Pluronic / DMSO släcker fluorescens. För optimal bulkutlastning av många angränsande cellkroppar med en funktionell indikator, t.ex. OGB-1 AM är färgämnet blandningen förvaras på is, laddas in i pipetten som behövs men alltid injiceras i hjärnan inom 2 timmar för dess framställning.

Under huvuddelen laddningsfasen avexperimentet, upprepas 1 sek pulser av tryck snarare än en kontinuerlig injektion av 1 minut möjliggör iterativ kalibrering av utkastningskrafterna parametrar, som säkerställer att överdrivet färgämne eller tryck inte anbringas. På grund av den potentiella vävnadsskada från flera pipettspetsar insertioner som behövs för att märka mycket stora områden av vävnad och potentiell toxicitet från stora volymer av Pluronic / DMSO från en sådan serie av många injektioner, föredrar vi en 300-600 um färgämne injektionsstället per 2 x 2 mm kraniotomi. Jämfört med blinda injektioner ^14, två-foton visuellt styrd navigering kring blodkärl, användning av negativ kontrast av neuronala cellkroppar att bestämma lamina läge, och mäta spridningen av färgämnet vid trycket utstötning som ett index av volymen av celler som kommer att märkt med OGB-1 AM förbättrar kvaliteten på färgen belastning i icke-gnagare preparat.

Protokollet beskriver vi här leder till framgångsrik märkning av nervceller med fluorescerande färgämnen i tjärageted mikro-domäner i varje djur försökte. För bulkutlastning med OGB-1 AM, får vi konsekvent visuellt-evoked potential i 75-100% av samtidigt avbildas neuroner ^9,15 och tekniken är känslig för detektion av enstaka aktionspotentialer in vivo ^23,24.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. Life support/experiment prep
Isoflurane	Webster Vet	NDC 57319-474-05
Isoflurane vaporizer	Midmark	VIP 3000
Feedback regulated heating blanket	Harvard Apparatus	50-7079F
ECG monitor	Digicare Biomedical	LifeWindow Lite
EEG amplifier	A-M Systems	1800
EEG display monitor	Hewlett Packard	78304A
End tidal CO2 monitor	Respironics	Novametrix Capnoguard 1265	Optimize ventilation
Carbide drill burrs for drilling bone	Henry Schein	fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip)
Cement for headplate/chamber	Dentsply	675571, 675572
Black Powder Tempera Paint	Sargent Art Inc.	22-7185	Add to cement to improve light shielding and reduce reflections
Agarose - Type III-A	Sigma	A9793	For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging
Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness	World Precision Instruments	502040, 502041	For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed
Brudon curettes	George Tiemann	105-715-0, 105-715-3	Cleaning skull surface
Bone wax	Ethicon	W31G	Quickly stop bleeding
Cotton Tipped Applicator	Electron Microscopy Sciences	72308-05	Clean and dry bone surface
Dumont #5CO Forceps	Fine Science Tools	11295-20	Grab individual layers of dura or pia
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03	Cut dura
Gelfoam	Pfizer	09-0396-05	To stop bleeding on the dura
Absorption spears	Fine Science Tools	18105-01	Ultra-fast and lint-free wicking of CSF
Blackout material	Thorlabs	BK5	Shield craniotomy
2. Dye preparation / injection
Dimethyl Sulphoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Pluronic	Sigma	P2443
Oregon Green 488 Bapta-1 AM	Invitrogen	O6807	Calcium indicator
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A10438
Centrifugal filter (0.45 μm pore size)	Millipore	UFC30HV00	To remove impurities before injection
Glass pipette puller	Sutter Instruments	P97
Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter)	World Precision Instruments	1B150F-4	Dye ejection pipette
Microloader	Eppendorf	5242 956 003	For loading dye into pipette
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285	To position pipette
Pressure pulse controller	Parker Hannifin	PicoSpritzer III	For pressure injection of the dye
Single-cell electroporator	Molecular Devices	Axoporator 800A	For electroporation of the dye
3. Intrinsic imaging
4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD)	Olympus	UPLFLN4X
Intrinsic hardware / software	Optical Imaging Inc.	Imager 3001 / VDAQ	VDAQ software is used for episodic imaging
CCD Camera	Adimec	Adimec-1000
Light source power supply	KEPCO	ATE 15-15M
Light source	Optical Imaging Inc.	HAL 100	Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW
Green filter (for vascular image)	Optical Imaging Inc.	λ = 546 nm (bandpass 30 nm)	For reference image of surface vasculature
Red filter (for intrinsic signal)	Optical Imaging Inc.	λ = 630 nm (bandpass 30 nm)	To collect intrinsic signals
Heat filter	Optical Imaging Inc.	KG-1
4. Two-photon rig/imaging
Two-photon microscope and software	Prairie Technologies		See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power
Ti:Sapphire laser	Spectra-Physics	Mai Tai XF
20x (0.5 NA; 3.5 mm WD)	Olympus	UMPLFLN20X	0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging)
20x (1.0 NA; 2.0 mm WD)	Olympus	XLUMPLFLN20X
40x (0.8 NA; 3.3 mm WD)	Olympus	LUMPLFLN40X/IR
Air table	Newport	ST-200	Isolates preparation from external vibrations
xy stage	Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA)		Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage
Recipes Artificial Cerebro-Spinal Fluid NaCl (135 mM), KCl (5.4 mM), MgCl2 (1.0 mM), CaCl2 (1.8 mM), HEPES (5 mM), pH 7.4 Pipette Solution14 NaCl (150 mM), KCl (2.5 mM), HEPES (10 mM), pH 7.4