Summary
En hurtig og enkel måde at generere humane cellelinier med inducerbare og reversibel cDNA overekspression eller shRNA-medieret knock-down af genet af interesse. Denne metode gør det muligt for forskerne at pålideligt og meget reproducerbart manipulere cellelinier, som er vanskeligt at ændre ved transient transfektion metoder eller konventionelle knockdown / knockout strategier.
Abstract
En vigtig metode inden for pattedyrcelle biologi er manipulering af ekspressionen af gener af interesse i udvalgte cellelinier, med henblik på at afsløre en eller flere af genets funktion (er) under anvendelse af overspændinger / stabil overekspression eller knockdown af genet af interesse. Desværre for forskellige celle-biologiske undersøgelser denne fremgangsmåde er uegnet, når manipulationer af genekspression resulterer i cellevækst / proliferation defekter eller uønsket celledifferentiering. Derfor har forskere tilpasset tetracyclin repressorproteinet (Tetr), taget fra E. coli tetracyclinresistens-operonet 1, til at generere meget effektive og stramme regulerende systemer til at udtrykke cDNA'er i pattedyrceller 2,3. Kort sagt har Tetr blevet modificeret til enten (1) blok initiering af transkription ved binding til den Tet-operatoren (TO) i promotorregionen ved tilsætning af tetracyclin (betegnet Tet-off system) eller (2) binder til i tHan fravær af tetracyclin (betegnet Tet-on system) (fig. 1). I betragtning af den ulempe, at Tet-off system kræver en konstant tilstedeværelse af tetracyclin (som har en halveringstid på omkring 24 timer i væv celledyrkningsmedium) Tet-on er blevet mere ekstensivt optimeret, hvilket resulterer i udvikling af meget stramme og effektive vektorsystemer til cDNA-ekspression som anvendt her.
Kort efter indførelse af RNA-interferens (RNAi) for genet knockdown i pattedyrceller 4, vektorer, der udtrykker short-hairpin RNA (shRNAs) blev beskrevet som fungerer meget lig siRNAs 5-11. Disse shRNA-medierede knockdown metoder har den samme begrænsning som konventionelle knockout strategier, idet stabil depletering ikke er muligt, når genmål er afgørende for cellulær overlevelse. For at overvinde denne begrænsning, van de Wetering et al. 12 modificeret shRNA ekspressionsvektoren pSUPER 5
Her beskriver vi en fremgangsmåde til effektivt at generere stabile human Tet-på cellelinjer, som pålideligt driver enten inducerbar overekspression eller nedbrydning af genet af interesse. Med denne metode har vi med succes skabt Tet-on cellelinier, som væsentligt lettede analyse af MST / hMOB / NDR kaskade i centrosome 13,14 og apoptose signalering 15,16. I denne rapport beskriver vi vore vektorer af valg, ud over at beskrive de to på hinanden følgende manipulation trin, der er nødvendige for effektivt at generere human Tet-on cellelinier (figur 2). Desuden foruden skitserer en protokol til generering af humane Tet-on cellelinjer, vil vi diskutere kritiske aspekter vedrørende de tekniske procedurer og karakterisering af Tet-on celler.
Protocol
1. Kloning af pcDNA6_TetR_IRES_blast
- Som illustreret i figur 3, udføres en delvis fordøjelse af pcDNA6/TR plasmid (V1025-20, Invitrogen) med restriktionsenzymerne Xba I og Nco I til fjernelse af tetR-genet og promotoren for blasticidin resistens (BlastR) genet. Isoler 4,6 kb vektorfragment.
- At fjerne polyadenyleringssekvensen fra tetR-genet, indføres ved hjælp af PCR et Xhol-site umiddelbart efter stopkodonen i Tetr cDNA samtidig opretholde den Xba I-sitet ved 5'-enden af cDNA'et. Subklone det resulterende fragment i pMigR1 17 ved hjælp af restriktionsenzymerne XbaI og XhoI for at generere pMigR1_TetR plasmid.
- Fordøje pMigR1_TetR vektor med restriktionsenzymerne Xba I og Nco I til at frigive TetR_IRES fragment. Isoler 1,25 kb insert fragment.
- Ligere det 4,6 kb pcDNA6/TR og 1,25 kb TetR_IRES fragmenter. Transform ligeringsproduktet ind i kompetent E. coli og identificere den ønskede pcDNA6_TetR_IRES_blast konstruktet ved anvendelse af standard molekylærbiologiske teknikker.
2. Generation af cellelinier stabilt udtrykker Tetr
- På dag 1 Seed 1x10 6 celler pr 10 cm vævskulturplade med din standard dyrkningsmedium (fx DMEM suppleret med 10% FCS). Seed to plader, en for transfektion med pcDNA6_TetR_IRES_blast og den anden som negativ kontrol for blasticidin selection. Sikre at anvende det lavest mulige muligt, og den anbefalede vækstmedium.
- På dag 2. Transficere en plade med 2 ug pcDNA6_TetR_IRES_blast hjælp af Fugene 6 (E2691, Promega) ifølge producentens instruktioner Ikke transficere den anden plade.
- På dag 3, tilføres vækstmedium indeholdende 5 ug / ml blasticidin til begge plader. Bemærk, at det optimale valg koncentration kan variere for en given cellelinie og might nBehov, der skal fastlægges på forhånd.
- På dag 4, opdele cellerne ved 1/5, 1/25, 1/50 og 1/100 under anvendelse af 10-cm plader og standard vækstmedium indeholdende 5 mg / ml blasticidin. Sørg for at korrekt mærkning plader indeholdende utransficerede eller transficerede celler. Forbered to plader pr fortynding skridt.
- Tjek celler dagligt, sikre, at alle celler i de transficerede plader er døde i den første uge. Skift valg medier hver 2-3 dage.
- Efter 1-2 uger, bør blasticidin-resistente kolonier begynde at dukke op. Vælg plader indeholdende 5-50 kolonier for at sikre, at enkelte kolonier kan opsamles.
- Når kolonier har nået en diameter på cirka 5 mm (eller større), isolere mindst 12 uafhængige kloner under anvendelse af kloningscylindre at vælge enkeltkolonier. Overfør hver klon i en separat brønd i en 24-brønds vævskulturplade. Når sammenflydende, opdele cellerne fra hver brønd i en enkelt brønd i en 6-brønds vævskulturplade.
- Fortsæt til kultur cldem i selektionsmedium. Når konfluente, opdelte celler fra hver brønd i to enkelte brønde i en 6-brønds vævskulturplade.
- For hver klon, der skal testes, fryse en brønd af konfluente celler og høst celler i den anden og til efterfølgende testning ved immunoblotting.
- Detektere Tetr ved Western blotting under anvendelse af monoklonalt anti-TET02 antistof (MoBiTec GmbH). Huske at medtage et lysat af den parentale cellelinie som en negativ kontrol.
- Vælg 3 kloner med den højeste Tetr udtryk og udvide hver klonal kultur. Frys lagre af hver lovende klon så hurtigt som muligt. Endelig undersøge de molekylære og cellebiologiske parametre af interesse ved at sammenligne de parentale cellelinier med Tetr-udtrykkende kloner. Vælg 'bedste' klon med den højeste Tetr udtryk, der ikke viser nogen ændringer i de molekylære og cellebiologiske parametre af interesse.
3. Pilot Test af PTER og pT-Rex DEST30 Vektorer ExpressING shRNA eller cDNA'er, Henholdsvis
- Generere PTER plasmid med shRNA inserter som beskrevet 12. Construct pT-Rex DEST30 vektoren (12301-016, Invitrogen) indeholdende cDNA af interesse ved anvendelse Gateway-teknologi (Invitrogen). I tilfælde af cDNA-ekspression, vil tilsætning af et mærke til cDNA'et senere letter påvisning af eksogent udtrykte protein.
- Forbigående transficere den parentale målcellen linje med PTER eller pT-Rex DEST30 plasmider (som udtrykker enten shRNAs eller cDNA'er af interesse) ved hjælp af transfektionsreagens af valg. Til testning af shRNA ekspressionsplasmider, sikre høje transfektionseffektiviteter kan opnås.
- Høst transficerede celler og en fremgangsmåde til immunoblotting under anvendelse af de passende antistoffer, forventer at detektere en udtynding eller overekspression af Deres gen af interesse.
4. Generering af stabile cellelinjer med tetracyklin-inducerbare (Tet-on) Ekspression af shRNAs eller cDNA'er under anvendelse PTER eller pT-Rex DEST30 Vektorer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på den første karakterisering af RPE-1 cellelinjer stabilt udtrykker Tetr er vist i figur 4. Bemærk, at alle RPE-1-kloner udtrykker varierende niveauer af Tetr (sammenlign bane 2 og 5), mens den parentale cellelinie (der tjener som negativ kontrol) ikke udtrykker det eksogene Tetr protein (Figur 4, bane 1). Denne variation i Tetr ekspression blandt RPE-1 Tet-on cellekloner forventes, idet ekspressionen af Tetr udtrykker plasmider er meget afhængig af plasmidet integration site.
Karakteriseringen af stabile RPE-1 Tet-on cellekloner der udtrykker shRNAs rettet mod MST3 kinase viser, at adskillige kloner skal testes for at definere cellelinierne med den mest effektive udtømning af genet af interesse (fig. 5). I det viste tilfælde (fig. 5) cellekloner # 1, # 2 og # 3 blev udvalgt til yderligere analyse. Variationen in depletion effektivitet forventes, idet ekspressionen af shRNA ekspression er meget afhængig af plasmidet integration site.
Figur 1. Forskellene mellem Tet-off og Tet-on ekspressionssystemer er vist. The tetracyclin (tet) repressorprotein (Tetr) er blevet modificeret til enten (1) blok initiering af transkription ved binding til den Tet-operatoren (TO) i promotoren region ved tilsætning af tetracyclin (betegnet Tet-off system) eller (2) binder til AT i fravær af tetracyclin (betegnet Tet-on system).
Figur 2. Beskrivelse af de to på hinanden følgende manipulation nødvendige skridt til at generere human Tet-on cellelinier med inducerbar ekspression af shRNA eller cDNA'et af interesse. (f.eks serumudsultning reaktion, celleproliferation satser, eller ekspressionen af markørproteiner), er den "bedste" Tetr-positive klon udvidet og gemt. Trin 2: Frembringelse af Tet-on cellelinier med inducerbar shRNA / cDNA-ekspression. Den 'bedste' Tetr-positive celler transficeres med PTER 12 til shRNA udtryk eller med pT-Rex DEST30 (12.301-016, Invitrogen) til cDNA-ekspression, og Blast / Zeocin eller Blast/G418 resistente kloner er valgt hhv. Adskillige individuelle cellekloner plukkes, ekspanderet og screenet ved immunblotting for tetracyklin-inducerbare knockdown eller ekspression af genet af interesse. Endelig kloner af interesseudvides, re-testet og gemt.
Figur 3. Generering af pcDNA6_TetR_IRES_blast vektoren. Den nyligt genererede pMigR1_TetR plasmid blev fordøjet med Xba I og Nco I, og det frigivne 1.25kb fragment indeholdende tetR og IRES (internal ribosome entry site) sekvenser blev klonet ind i den viste Xba I og NcoI-sites i pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen). Den resulterende pcDNA_TetR_IRES_blast vektor udtrykker Tetr og blasticidin resistensgen (BlastR) under anvendelse af samme CMV-promotor, hvorved det sikres, at alle blasticidin resistente celler også udtrykker Tetr.
Figur 4. Analyse af RPE-1-cellekloner stabilt transficeret med pcDNA / TetR_IRES_blast.Parental RPE-1-celler sammenlignet med RPE-1-celler stabilt udtrykker Tetr ved immunoblotting under anvendelse af anti-tetr (toppanel) og anti-a-tubulin-antistoffer (nederste panel).
Figur 5. . Analyse af RPE-1 tetR-positive kloner stabilt transficeret med pTER_shMST3 For at identificere celler med tetracyklin-inducerbare ekspression af shRNAs rettet MST3 blev kloner dyrket i fravær (-) eller nærvær (+) af tetracyclin (tet) i 72 timer, før behandling til immunoblotting under anvendelse af anti-MST3 (toppanel) og anti-a-tubulin-antistoffer (nederste panel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi mener, at Tet-on systemer i høj grad lette analyse af genfunktion, især i cellesystemer, der er vanskelige at manipulere og / eller når den manipulerede gen er væsentlig for celleoverlevelse. Endvidere evnen til at kontrollere genekspression ved meget specifikke Tet-on systemer giver mulighed for at studere genfunktioner på forskellige stadier (f.eks under cellecyklusprogression eller veldefinerede differentieringsprocesser). Den metode præsenteres her, vil gøre det muligt for forskerne at generere den ønskede stabile Tet-on cellelinier inden for en rimelig tidshorisont (normalt 3-6 måneder, i vid udstrækning afhængigt af omfanget af molekylær-og cellebiologiske profilering, der er nødvendig for karakteriseringen af Tetr-positive cellelinier). Den vellykkede produktion og anvendelse af Tet-on cellelinier er imidlertid helt afhængig af flere faktorer.
Indledende udvælgelse af celler med tilstrækkelig høj ekspression af Tetrskal sikre stringent repression af transkription i fravær af tetracyclin. Lige så vigtigt, bør den første karakterisering af målcellerne udtrykker Tetr dække alle mulige molekylære og cellebiologiske parametre, der vil blive undersøgt på lang sigt. Det er vores erfaring, er en velkarakteriseret Tetr-positiv cellelinie et meget godt udgangspunkt for en lang række forskningsprojekter.
For det andet er det nødvendigt at holde tetracyclin koncentration så lav som muligt for at forhindre mulige pleiotropiske virkninger ved test og analyse Tet-on kloner for shRNA / cDNA-ekspression. Hvis det er muligt, bør tetracyclin koncentration ikke overstige 2 ug / ml (fortrinsvis mindre end 2 pg / ml). Da tetracyclin har en halveringstid på omkring 24 timer i væv celledyrkningsmedium, eksperimenter, som stadig er flere dage bør overveje yderligere runder af tetracyclin tilsætning. Doxycyclin, et syntetisk tetracyclin alternativ, Kan også overvejes, når cytotoksiske niveauer af tetracyclin er til bekymring.
For det tredje bør tests anvendes forskelligt for cDNA og shRNA udtryk. Mens Tet-on celler, der udtrykker cDNA'er vil nemt producere påviselige mængder af proteiner inden for 24 timer, kan udtømning af endogene faktorer ved shRNA-medieret knockdown tage meget længere tid. Generelt anbefaler vi at teste kloner udtrykker shRNAs kun 96 timer efter tetracyclin tilføjelse, som vil føre til nedsatte niveauer af din gen af interesse, selv om halveringstiden for dit mål er 24 timer. Et eksempel er vist i figur 5 repræsenterer en "ideel" screening resultat for shRNA-medieret depletion, og ændringer til prøvningsprotokol kan være behov for at definere den optimale knock down betingelser. Sidst, men ikke mindst, vil vi gerne understrege, at veletablerede screening-værktøjer (QRT-PCR-sonder, antistoffer) i høj grad vil lette identifikationen af de ønskede cellekloner. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer af vores laboratorium for personer diskussioner. Vi takker Joanna Lisztwan og Christina Gewinner for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af BBSRC tilskud BB/I021248/1 og Wellcome Trust tilskud 090090/Z/09/ZAH er et Wellcome Trust Research Career Development stipendiat ved UCL Cancer Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
- Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
- van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
- Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
- Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
- Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
- Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
- Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
