Summary
Uma maneira rápida e simples para gerar linhas de células humanas com sobre-expressão de cDNA induzido e reversível ou shRNA mediada knock-down do gene de interesse. Este método permite aos investigadores linhas celulares de modo fiável e altamente reprodutível manipular que são difíceis de alterar pelos métodos de transfecção transiente ou convencionais knockdown / knockout estratégias.
Abstract
Uma abordagem importante no campo da biologia celular de mamífero é a manipulação da expressão de genes de interesse em linhas de células seleccionadas, com o objectivo de revelar uma ou várias das funções do gene (s), utilizando sobreexpressão transiente / estável ou knockdown do gene de interesse. Infelizmente, para investigações biológicas de células diferentes esta abordagem não é apropriada quando as manipulações de resultado da expressão do gene em células de crescimento / proliferação defeitos ou diferenciação celular indesejada. Por isso, os investigadores têm adaptado a proteína do repressor de tetraciclina (TetR), a partir da E. coli de resistência à tetraciclina do operão 1, para gerar muito eficientes e apertado sistemas reguladores para expressar cDNAs em células de mamíferos 2,3. Em suma, TetR foi modificado para a iniciação ou bloco (1) de transcrição ligando-se ao operador de Tet-(TO) na região promotora com a adição de tetraciclina (Tet-off denominado sistema) ou (2) se ligam ao A em tele ausência de tetraciclina (Tet-on denominado sistema) (Figura 1). Dado o inconveniente de que o sistema Tet-off é necessária a presença contínua de tetraciclina (que tem uma semi-vida de cerca de 24 h em meio de cultura de tecido de células) o Tet-on sistema tem sido mais extensivamente optimizada, resultando no desenvolvimento de muito apertado e sistemas de vectores para a expressão de cDNA eficientes como usado aqui.
Pouco tempo após o estabelecimento de interferência de RNA (RNAi) para knockdown do gene em células de mamíferos, quatro vectores que expressam hairpin RNAs curto (shRNAs) foram descritas em que a função muito semelhante ao siRNAs 5-11. No entanto, estas abordagens shRNA mediadas knockdown têm a mesma limitação quanto knockout estratégias convencionais, uma vez que a depleção estável não é exequível quando genes alvos são essenciais para a sobrevivência celular. Para superar essa limitação, van Wetering de et al. 12 modificou a expressão shRNA vetor pSUPER 5
Aqui, nós descrevemos um método para gerar eficientemente estável humano Tet-on linhas celulares que conduzem fiável ou sobre-expressão induzível ou depleção do gene de interesse. Usando este método, têm gerado com êxito Tet-em linhas de células que facilitou significativamente a análise da cascata de MST / hMOB / NDR centrossoma em 13,14 e 15,16 sinalização da apoptose. Neste relatório, descreve-nossos vectores de escolha, para além de descrever as duas etapas consecutivas de manipulação que são necessários para gerar de forma eficiente humano-Tet em linhas de células (Figura 2). Além disso, além de traçar um protocolo para a geração de Tet-humana em linhas de células, vamos discutir os aspectos críticos sobre os procedimentos técnicos e caracterização de Tet-nas células.
Protocol
1. Clonagem de pcDNA6_TetR_IRES_blast
- Como ilustrado na Figura 3, realizar uma digestão parcial do plasmídeo pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen) com as enzimas de restrição Xba I e Nco I para remover o gene TetR e o promotor da resistência blasticidina (BlastR) gene. Isolar o fragmento de 4,6 kb do vetor.
- Para remover a sequência de poliadenilação do gene TetR, introduzir por PCR um local Xhol imediatamente a seguir ao codão de paragem do ADNc de TetR enquanto conservam o local Xbal na extremidade 5 'do ADNc. Subclonar o fragmento resultante no pMigR1 17, usando as enzimas de restrição Xba I e Xho I para gerar o plasmídeo pMigR1_TetR.
- Digerir o vector pMigR1_TetR com as enzimas de restrição Xba I e Nco I para libertar o fragmento TetR_IRES. Isolar o fragmento de 1,25 kb inserção.
- Ligar o 4,6 kb pcDNA6/TR e os fragmentos de 1,25 kb TetR_IRES. Transform o produto de ligação em E. coli competentes e identificar a construção pcDNA6_TetR_IRES_blast desejado utilizando técnicas padrão de biologia molecular.
2. A geração de linhas celulares que expressem estavelmente TetR
- No dia 1, Semente 1x10 6 células por 10 cm de placa de cultura de tecido usando o seu meio de crescimento normal (por exemplo, DMEM suplementado com FCS a 10%). Semente de duas placas, uma para a transfecção com pcDNA6_TetR_IRES_blast, eo outro como controlo negativo para a selecção blasticidina. Certifique-se de utilizar o menor possível, e a passagem do meio de crescimento recomendado.
- No dia 2, transfectar uma placa com 2 ug de pcDNA6_TetR_IRES_blast usando Fugene 6 (E2691, Promega), seguindo as instruções do fabricante. Não transfectar a segunda placa.
- No dia 3, adicionar meio de crescimento normal contendo 5 blasticidina ug / ml de ambas as placas. Por favor, note que a concentração seleção ideal pode variar de uma linha determinada célula e força need a ser determinado de antemão.
- No dia 4, dividir as células em 1/5, 1/25, 1/50 e 1/100 usando placas de 10 cm e o meio de crescimento normal contendo 5 mg / ml de blasticidina. Certifique-se de rotular adequadamente placas contendo células não transfectadas ou transfectadas. Preparar duas placas por diluição.
- Verificar as células diária, assegurando que todas as células não transfectadas nas placas tenham morrido na primeira semana. Alterar meios de selecção a cada 2-3 dias.
- Após 1-2 semanas, as colónias resistentes blasticidina devem começar a aparecer. Seleccionar placas contendo 5-50 colónias para garantir que as colónias individuais podem ser colhidos.
- Quando as colónias atingiram um diâmetro de aproximadamente 5 mm (ou maior), o isolado de pelo menos 12 clones independentes utilizando cilindros de clonagem para escolher colónias únicas. Transferir cada clone a um poço separado de uma placa de cultura de tecidos de 24 cavidades. Quando confluentes, dividir as células de cada poço para um único poço de uma placa de cultura de tecidos de 6 poços.
- Continue a cl culturaos de meios de selecção. Quando confluentes, células divididas de cada poço em dois poços individuais de uma placa de cultura de 6 poços tecido.
- Para cada clone a ser testado, congelar um poço de células confluentes de células e colheita no outro poço de teste subsequente por immunoblotting.
- Detectar TetR por Western blotting usando o anticorpo anti-rato monoclonal TET02 (MoBiTec GmbH). Recorde incluir um lisado da linha celular parental, como um controlo negativo.
- Selecione três clones com a mais alta expressão TetR e expandir cada cultura clonal. Congele as existências de cada clone promissor o mais rapidamente possível. Finalmente, examinar os parâmetros biológicos moleculares e celulares de interesse, comparando as linhas celulares parentais com os clones que expressam TetR. Selecione o 'melhor' clone com a mais alta expressão TetR que não apresentar quaisquer alterações nos parâmetros moleculares e celulares biológicos de interesse.
3. Teste piloto do PTER e PT-Rex DEST30 Vetores Expresseing shRNA ou cDNAs, Respectivamente
- Gerar pter plasmídeo com as inserções de Lentivirus como descrito 12. Construir pT-Rex DEST30 vector (12301-016, Invitrogen) contendo o ADNc de interesse, utilizando tecnologia de Gateway (Invitrogen). No caso de expressão de cDNA, a adição de uma etiqueta com o cDNA será posteriormente facilitar a detecção da proteína expressa de forma exógena.
- Transitoriamente transfectar a linha celular parental de destino com DEST30 plasmídeos PTER ou pT-Rex (expressando tanto shRNAs ou cDNAs de interesse) utilizando o reagente de transfecção de escolha. Para os testes de plasmídeos de expressão de shRNA, garantir eficiências de transfecção elevadas podem ser alcançadas.
- Colheita de células transfectadas e processo para imunotransf erência utilizando os anticorpos adequados, esperando detectar uma diminuição ou a superexpressão do seu gene de interesse.
4. A geração de linhagens de células estáveis com tetraciclina induzível (Tet-on) Expressão de shRNAs ou ADNc utilizando PTER ou pT-Rex DEST30 Vetores
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Representative Results
Um exemplo para a caracterização inicial de EPR-1 linhas celulares que expressem estavelmente TetR é mostrado na Figura 4. Note-se que todos os clones de EPR-1 expressar níveis variáveis de TetR (comparar pistas 2 e 5), enquanto que a linha celular parental (que serve como controlo negativo) não exprime a proteína exógena TetR (Figura 4, pista 1). Esta variação na expressão entre TetR EPR-1-Tet em clones de células é esperado, uma vez que a expressão de plasmídeos expressando a TetR é altamente dependente do local de integração do plasmídeo.
A caracterização da estabilidade EPR-1-Tet em clones de células que exprimem shRNAs dirigidos contra a quinase MST3 mostra que vários clones têm de ser testados, a fim de definir as linhas de células com o esgotamento mais eficiente do gene de interesse (Figura 5). No caso ilustrado clones (Figura 5) de células # 1, # 2 e # 3 foram escolhidos para posterior análise. A variação in eficiência depleção é esperado, uma vez que a expressão de shRNA expressão é altamente dependente do local de integração do plasmídeo.
Figura 1. As diferenças entre Tet-off e sistemas de expressão de Tet-on são mostrados. Tetraciclina A proteína (Tet) repressor (TetR) foi modificado para a iniciação ou bloco (1) de transcrição ligando-se ao operador de Tet-(TO) no promotor região com a adição de tetraciclina (denominado sistema Tet-off) ou (2) se ligam ao A, na ausência de tetraciclina (Tet-on denominado sistema).
Figura 2. Descrição das duas etapas consecutivas de manipulação necessárias para gerar Tet-humano em linhas de células com expressão induzível da shRNA ou ADNc de interesse. ex. soro, as taxas de proliferação celular, ou a expressão de proteínas marcadoras), o "melhor" clone TetR positivo é expandido e armazenadas. Passo 2: Geração de Tet-em linhas de células com shRNA induzível / expressão de cDNA. Os "melhores" TetR células positivas são transfectadas com PTER 12 para a expressão shRNA ou com a PT-Rex DEST30 (12301-016, Invitrogen) para a expressão de cDNA, e Blast / zeocina ou Blast/G418 clones resistentes são selecionados, respectivamente. Vários clones de células individuais são colhidas, expandidas e testadas por imunotransferência por tetraciclina induzível knockdown ou a expressão do gene de interesse. Finalmente, os clones de interessesão expandidos, re-testados e armazenados.
Figura 3. Geração do vector pcDNA6_TetR_IRES_blast. PMigR1_TetR O recém-gerado do plasmídeo foi digerido com Xba I e Nco I e o fragmento contendo o libertado 1.25kb TetR e IRES (local interno de entrada do ribossoma) sequências foi clonado no exibido Xba I e os locais Nco I de pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen). O vector resultante pcDNA_TetR_IRES_blast expressa a TetR e o gene de resistência à blasticidina (BlastR) usando o mesmo promotor de CMV, assegurando deste modo que todas as células resistentes blasticidina também expressa TetR.
Figura 4. Análise de EPR-1 Os clones de células transfectadas de forma estável com pcDNA / TetR_IRES_blast.RPE-1 parental células foram comparadas com EPR-1 de células que expressam estavelmente TetR por imunotransf erência utilizando anti-TetR (painel superior) e anti-alfa-tubulina de anticorpos (painel inferior).
Figura 5. . Análise de EPR-1-positivos TetR clones estavelmente transfectadas com pTER_shMST3 Para identificar as células com tetraciclina induzível por expressão de segmentação shRNAs MST3, os clones foram cultivados na ausência (-) ou na presença (+) de tetraciclina (Tet) durante 72 horas, antes do processamento por imunotransf erência utilizando anticorpos anti-MST3 (painel superior) e anti-alfa-tubulina (painel inferior).
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Discussion
Cremos que os sistemas de Tet-on facilitar grandemente a análise da função dos genes, em particular em sistemas de células que são difíceis de manipular e / ou quando o gene manipulado é essencial para a sobrevivência da célula. Além disso, a capacidade de controlar a expressão de genes específicos por altamente Tet-em sistemas oferece a oportunidade de estudar funções de genes em estágios diferentes (por exemplo, durante a progressão do ciclo celular ou processos bem definidos de diferenciação). O método aqui apresentado irá permitir aos investigadores para gerar o desejado estável Tet-em linhas de células dentro de um período de tempo razoável (normalmente 3-6 meses, em grande parte, dependendo da extensão da caracterização molecular e celular biológico que é necessária para a caracterização de TetR-positiva linhas de células). A geração bem sucedida e aplicação de Tet-on linhas celulares, no entanto, é criticamente dependente de vários factores.
Em primeiro lugar, a selecção de células com expressão suficientemente elevado de TetRé necessária para assegurar a repressão rigorosa da transcrição na ausência da tetraciclina. Igualmente importante, a caracterização inicial das células alvo que expressam a TetR deve abranger todos os possíveis moleculares e celulares parâmetros biológicos que serão estudados no longo prazo. Em nossa experiência, uma linhagem de células bem caracterizada TetR-positivo é um bom ponto de partida para inúmeros projectos de investigação.
Em segundo lugar, é necessário manter a concentração de tetraciclina mais baixo possível para evitar possíveis efeitos pleiotrópicos no ensaio e análise de Tet-on clones para shRNA / expressão de cDNA. Se possível, a concentração de tetraciclina não deve ser superior a 2 ng / ml (preferencialmente inferior a 2 ug / ml). Além disso, uma vez que a tetraciclina não tem uma meia-vida de cerca de 24 h em meio de cultura de tecido celular, as experiências que duram vários dias, deve considerar ciclos adicionais de adição de tetraciclina. Doxiciclina, tetraciclina uma alternativa sintética, Também pode ser considerado quando os níveis citotóxicos de tetraciclina são motivo de preocupação.
Terceiro, os testes devem ser aplicadas de forma diferente para a expressão de cDNA e shRNA. Enquanto Tet-em células que expressam cDNAs facilmente produzir quantidades detectáveis de proteínas dentro de 24 horas, o esgotamento de fatores endógenos por shRNA mediada knockdown pode levar muito mais tempo. Geralmente, recomendamos testar clones expressando shRNAs apenas 96 horas após a adição de tetraciclina, o que levará a diminuição dos níveis de seu gene de interesse, mesmo que a meia-vida de seu alvo é de 24 horas. O exemplo mostrado na Figura 5 representa um resultado de rastreio "ideal" para shRNA mediada por esgotamento, e modificações no protocolo de ensaio pode ser necessária para definir a batida óptima baixo as condições. Por último, mas não menos importante, gostaria de salientar o fato de que as ferramentas de rastreio bem estabelecido (qRT-PCR sondas, anticorpos) vai facilitar muito a identificação de seus clones de células desejadas. </ P>
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos a todos os membros de nosso laboratório para discussões úteis. Agradecemos Joanna Lisztwan e Christina Gewinner para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado pela concessão BBSRC BB/I021248/1 e do Wellcome Trust concessão 090090/Z/09/ZAH é um Wellcome Research Trust companheiro de Desenvolvimento de Carreira no Câncer UCL Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
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