Summary
דרך מהירה ופשוטה ליצירת שורות תאים אנושיות עם מושרה וביטוי יתר הפיך cDNA או shRNA בתיווך עקום למטה של הגן של עניין. שיטה זו מאפשרת לחוקרי שורות תאים ואמינים ביותר reproducibly מניפולציות שקשה לשנות בשיטות transfection חולפות או אסטרטגיות קונבנציונליות מציאה / נוקאאוט.
Abstract
גישה מרכזית בתחום הביולוגיה של תא יונקת היא המניפולציה של הביטוי של גנים של עניין שורות תאים נבחרות, במטרה לחשוף את אחד או כמה מתפקודו של הגן (ות) באמצעות ביטוי יתר או מציאה חולף / יציב של הגן של עניין. למרבה הצער, לחקירות ביולוגיות תאים שונות גישה זו אינה מתאימה כאשר תוצאת מניפולציות של ביטוי גנים בתאי פגמי צמיחה / שגשוג או התמיינות תאים לא רצויה. לכן, חוקרים התאימו את החלבון המדכא טטרציקלין (TetR), נלקח מE. coli התנגדות טטרציקלין 1 אופרון, לייצר מערכות ויסות יעילות מאוד וחזקות להביע cDNAs בתאי יונקי 2,3. בקיצור, TetR שונתה כדי או (1) ייזום בלוק של שעתוק באמצעות קשירה למפעיל ט (TO) באזור המקדם על תוספת של טטרציקלין (שמכונה מערכה ט הכבוי) או (2) לאגד ל לאהוא היעדר טטרציקלין (מכונה ט במערכת) (איור 1). בהתחשב באי הנוחות שהמערכה ט הפעמי דורשת נוכחות הרציפה של טטרציקלין (שבו יש זמן מחצית חיים של כ 24 שעות במדיום תרבית תאי רקמה) ט במערכת כבר מותאם באופן נרחב יותר, וכתוצאה מכך להתפתחות מאוד הדוק ומערכות וקטור יעילות לביטוי cDNA משמשות כאן.
זמן קצר לאחר הקמתה של התערבות RNA (RNAi) למציאת גנים בתאי יונקים 4, וקטורים המבטאים RNAs-מכבנה קצרה (shRNAs) תוארה שפונקציה דומה מאוד לsiRNAs 5-11. עם זאת, גישות מציאת shRNA בתיווך אלה יש להם מגבלה כאסטרטגיות נוקאאוט קונבנציונליות, שכן דלדול יציב הוא לא ריאלי כאשר מטרות גנים הן חיוניות להישרדות תאים. כדי להתגבר על מגבלה זו, ואן דה Wetering et al. שונים 12 shRNA ביטוי וקטור pSUPER 5
כאן, אנו מתארים שיטה יעילה להפקה יציבה אדם ט בשורות תאים שיניעו מהימן או ביטוי יתר מושרה או דלדול של הגן של עניין. באמצעות שיטה זו, יש לנו נוצרו בהצלחה ט בשורות תאים אשר הקלו באופן משמעותי על הניתוח של MST / hMOB / NDR המפל בcentrosome 13,14 ואפופטוזיס איתות 15,16. בדו"ח זה, אנו מתארים הווקטורים של בחירה שלנו, בנוסף לתיאור שני שלבי המניפולציה הרצופים הנדרשים ביעילות כדי ליצור אדם ט בשורות תאים (איור 2). יתר על כן, מלבד מתאר פרוטוקול עבור הדור של אדם ט בשורות תאים, נדונו היבטים קריטיים לגבי הנהלים הטכניים והאפיון של ט בתאים.
Protocol
1. שיבוט של pcDNA6_TetR_IRES_blast
- כפי שמודגם באיור 3, לבצע עיכול חלקי של pcDNA6/TR פלסמיד (V1025-20, Invitrogen) עם הגבלת אנזימי Xba אני והמש"ק להסיר את גן TetR והאמרגן של התנגדות blasticidin (BlastR) הגן. לבודד את בר 4.6 קילו הווקטור.
- כדי להסיר את רצף polyadenylation מגן TetR, להציג באמצעות PCR אני אתר Xho מייד לאחר קודון העצירה של TetR cDNA תוך שימור Xba האתר ב5'end של cDNA. Subclone בר שנוצר לpMigR1 17 באמצעות אנזימי ההגבלה Xba ואני Xho לייצר pMigR1_TetR פלסמיד.
- לעכל את וקטור pMigR1_TetR עם הגבלת אנזימי Xba ואני מש"ק לשחרר בר TetR_IRES. לבודד את בר 1.25 הק"ג להוסיף.
- לקשור 4.6 הק"ג pcDNA6/TR ו1.25 ברי kb TetR_IRES. Transform מוצר הקשירה לE.coli המוסמך ולזהות את מבנה pcDNA6_TetR_IRES_blast הרצוי באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולריות סטנדרטיות.
2. הדור של שורות תאי יציבות הבעת TetR
- ביום 1 ביום, זרעי 1x10 6 תאים לכל צלחת תרבית רקמה 10-סנטימטר באמצעות מדיום הגידול הרגיל שלך (למשל DMEM בתוספת 10% FCS). זרעי שתי צלחות, אחת לtransfection עם pcDNA6_TetR_IRES_blast ואחרות כמו שליטה שלילית לבחירת blasticidin. ודא להשתמש מעבר הנמוך ביותר האפשרי ומדיום גידול המומלץ.
- ביום 2, transfect צלחת אחת עם 2 מיקרוגרם של pcDNA6_TetR_IRES_blast באמצעות 6 Fugene (E2691, Promega) בעקבות הוראות היצרן. אל transfect הצלחת השנייה.
- ביום 3, להוסיף מדיום גידול המכיל סטנדרטי blasticidin 5 מיקרוגרם / מ"ל לשתי הצלחות. שים לב שריכוז הבחירה האופטימלית עשוי להשתנות בהתאם לקו תא נתון ואולי need שייקבע מראש.
- ביום 4, לפצל את התאים ב 1/5, 1/25, 1/50 ו1 / 100 באמצעות צלחות 10-סנטימטר ובינוני צמיחה סטנדרטית המכילים 5 מ"ג / המ"ל blasticidin. הקפד לתייג צלחות המכילות תאי untransfected או transfected כראוי. הכן שתי צלחות לצעד דילול.
- בדקו תאים יומיים, ולהבטיח כי כל התאים שעל צלחות untransfected מתו בתוך השבוע הראשון. שינוי תקשורת בחירה כל 2-3 ימים.
- לאחר 1-2 שבועות, מושבות blasticidin עמידות צריכות להתחיל להופיע. בחר צלחות המכילות 5-50 מושבות כדי להבטיח שמושבות בודדות יכולות להיות הרים.
- כשהגיעו למושבות בקוטר של כ 5 מ"מ (או גדול), לבודד לפחות 12 שיבוטים עצמאיים באמצעות צילינדרי שיבוט להרים מושבות בודדות. העבר כל שיבוט לתוך באר נפרד מצלחת תרבית רקמה 24 כן. כשמתלכד, לפצל את התאים מכל אחד ואחד גם לתוך היטב של צלחת תרבית רקמה 6-כן.
- המשך CL של התרבותאלה בתקשורת בחירה. כאשר, תאי confluent מפוצל מכל טובה לשתי בארות בודדות של צלחת תרבית רקמה 6-כן.
- לכל שיבוט להיבדק, להקפיא באר אחת של תאים ותאי confluent קטיף ובשני לבדיקה הבאה על ידי immunoblotting.
- זיהוי TetR ידי מערב סופג באמצעות נוגדן חד השבטי העכבר אנטי TET02 (MoBiTec GmbH). זכור לכלול lysate של שורת תאים ההוריות כביקורת שלילית.
- בחר 3 שיבוטים עם ביטוי TetR הגבוה ביותר ולהרחיב כל תרבות משובטת. הקפא מניות של כל שיבוט מבטיח בהקדם האפשרי. לבסוף, לבחון את הפרמטרים הביולוגיים המולקולריים ותא של עניין על ידי השוואה בין שורות תאים ההוריות עם שיבוטי TetR מבטאים-. בחר השיבוט "הכי הטוב" עם ביטוי TetR הגבוה ביותר שלא מציג את כל שינויים בפרמטרים הביולוגיים המולקולריים ותא של עניין.
3. בדיקת פיילוט של pTER וPT-Rex DEST30 וקטורים בטאing shRNA או cDNAs, בהתאמה
- צור pTER פלסמיד עם מוסיף shRNA כמתואר 12. לבנות PT-רקס DEST30 וקטור (12301-016, Invitrogen) המכיל cDNA של ריבית באמצעות טכנולוגית Gateway (Invitrogen). במקרה של ביטוי cDNA, תוספת של תג לcDNA יהיה מאוחר להקל זיהוי של חלבון בטא exogenously.
- Transiently transfect קו תא המטרה ההורית עם pTER או PT-רקס DEST30 פלסמידים (להביע או shRNAs או cDNAs עניין) באמצעות מגיב transfection של בחירה. לבדיקה של פלסמידים ביטוי shRNA, להבטיח יעילות transfection גבוהה יכולה להיות מושגת.
- קציר transfected תאים ותהליך לimmunoblotting באמצעות הנוגדנים המתאימים, מצפה לגילוי דלדול או ביטוי יתר של הגן של עניין שלך.
4. דור של שורות תאי יציבות עם טטרציקלין-מושרה (ט ב) ביטוי של shRNAs או cDNAs שימוש pTER או PT-Rex DEST30 וקטורים
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דוגמה לאפיון הראשוני של-1 RPE שורות תאי יציבות מבטאות TetR מוצגת באיור 4. שים לב כי כל שיבוטי רשתית-1 מביעים רמות שונות של TetR (השווה נתיבים 2 ו 5), ואילו קו התא ההורי (המשמש כשליטה שלילית) אינו מבטא את חלבון TetR אקסוגני (איור 4, 1 נתיב). וריאציה זו בביטוי TetR בין הרשתית-1 ט על שיבוטים סלולריים צפויה, שכן הביטוי של TetR להביע פלסמידים תלוי מאוד באתר האינטגרציה פלסמיד.
האפיון יציב רשתית-1 ט על שיבוטים סלולריים shRNAs מביע כוון נגד קינאז MST3 מראה כי כמה שיבוטים צריכים להיבדק על מנת להגדיר את שורות תאים עם הדלדול היעיל ביותר של הגן של עניין (איור 5). במקרה המאויר (איור 5) שיבוטי תא המס '1, 2 ו 3 נבחרו לניתוח נוסף. וריאציתייעילות דלדול n צפויה, שכן הביטוי לביטוי shRNA תלוי מאוד באתר האינטגרציה פלסמיד.
איור 1. ההבדלים בין ט הפעמי וט במערכות ביטוי מוצגים. חלבון טטרציקלין (ט) המדכא (TetR) הותאם לאו (1) ייזום הבלוק של שעתוק ידי כבילת ט המפעיל (TO) במקדם אזור על תוספת של טטרציקלין (מערכת נקראת ט הכבוי) או (2) לאגד להיעדר טטרציקלין (מכונה ט במערכת).
איור 2. תיאור של שני צעדים הרצופים המניפולציה הדרושים ליצירת אדם ט בשורות תאים עם ביטוי מושרה של shRNA או cDNA של עניין. לדוגמא סרום רעב, שיעורי התפשטות תאים, או ביטוי של חלבוני סמנים), השיבוט 'הטוב ביותר' TetR החיובי מתרחב ומאוחסן. שלב 2: דור של ט בשורות תאים עם shRNA המושרה / ביטוי cDNA. התאים 'הכי הטובים' TetR-החיוביים transfected עם 12 pTER לביטוי shRNA או עם PT-רקס DEST30 (12301-016, Invitrogen) לביטוי cDNA, ופיצוץ / או Zeocin Blast/G418 שיבוטים עמידים נבחרים, בהתאמה. שיבוטי תא בודדים כמה הם הרימו, התרחבו והוקרנו על ידי immunoblotting למציאת טטרציקלין-מושרה או ביטוי של הגן של עניין. לבסוף, שיבוטים של ענייןהם התרחבו, נבדקו מחדש, ומאוחסן.
איור 3. הדור של וקטור pcDNA6_TetR_IRES_blast. PMigR1_TetR הפלסמיד חדש שנוצר היה מתעכל עם Xba אני ומש"ק אני, ובר 1.25kb שוחרר מכיל TetR וires (אתר כניסה הריבוזום הפנימי) רצפים שוכפל למוצגים Xba אתרי I מש"ק שלי ו pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen). וקטור pcDNA_TetR_IRES_blast כתוצאה מבטא TetR וגן התנגדות Blasticidin (BlastR) באמצעות אותו אמרגן CMV, ובכך להבטיח כי כל התאים העמידים Blasticidin גם מפורש TetR.
איור 4. ניתוח של-1 RPE שיבוטי תא transfected ביציבות עם pcDNA / TetR_IRES_blast.רשתית-1 הורי תאים הושוו ל- 1 תאי RPE יציבות מבטאים TetR ידי immunoblotting באמצעות נוגדנים (פנל תחתון) נגד אלפא טובולין אנטי TetR (פנל עליון) ו.
איור 5. . ניתוח-1 RPE שיבוטי TetR חיוביים transfected ביציבות עם pTER_shMST3 כדי לזהות תאים עם ביטוי טטרציקלין-מושרה של shRNAs מיקוד MST3, שיבוטים גדלו בהעדר (-) או הנוכחות (+) של טטרציקלין (ט) במשך 72 שעות, לפני העיבוד לimmunoblotting באמצעות נוגדנים נגד אלפא טובולין אנטי MST3-(פנל עליון) ו( פנל תחתון).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מאמינים כי ט במערכות להקל על הניתוח של תפקוד הגן באופן משמעותי, במיוחד במערכות תא שקשה לתמרן ו / או כאשר גן המניפולציות הוא חיוני להישרדות תא. יתר על כן, היכולת לשלוט על ביטוי גנים על ידי ט במערכות מאוד ספציפיות מציעה את ההזדמנות ללמוד פונקציות גנטיות בשלבים שונים (לדוגמה במהלך התקדמות מחזור תא או תהליכי התמיינות מוגדרות היטב). השיטה שהוצגה כאן תאפשר לחוקרים להפיק רצוי יציב ט בשורות תאים בתוך מסגרת זמן סבירה (בדרך כלל 3-6 חודשים, במידה רבה בהתאם למידה של אפיון ביולוגי מולקולרי של תא שהוא הכרחי לאפיון של TetR חיובי שורות תאים). הדור והיישום המוצלח של ט בשורות תאים, לעומת זאת, הוא ביקורתי תלוי במספר גורמים.
ראשית, הבחירה של תאים עם ביטוי גבוה במידה מספקת של TetRנדרש כדי להבטיח דיכוי מחמיר של שעתוק בהיעדר טטרציקלין. לא פחות חשוב, האפיון הראשוני של תאי המטרה להביע TetR צריך לכסות את כל הפרמטרים המולקולריים של תא הביולוגיים האפשריים שיילמדו בטווח הארוך. מניסיוננו, שורת תאי TetR חיובית גם מאופיינת היא נקודת התחלה טובה מאוד לפרויקטים רבים של מחקר.
שנית, יש צורך לשמור על הריכוז הנמוך ככל האפשר, כדי למנוע תופעות pleiotropic אפשריות טטרציקלין כאשר בדיקות וניתוח ט בשיבוטים לshRNA / ביטוי cDNA. אם אפשר, ריכוז טטרציקלין לא צריך להיות גבוה יותר מאשר 2 מיקרוגרם / מ"ל (מעדיף נמוך מ2 מיקרוגרם / מ"ל). יתר על כן, מאז טטרציקלין יש זמן מחצית חיים של כ 24 שעות במדיום רקמת תאי תרבות, ניסויים שימים אחרונים צריכים לשקול סיבובים נוספים של בנוסף טטרציקלין. דוקסיציקלין, טטרציקלין אלטרנטיבה סינטתית, יכול להיחשב גם כאשר רמות ציטוטוקסיות של טטרציקלין הן בעלי עניין.
שלישית, בדיקות צריכות להיות מיושמת באופן שונה לביטוי cDNA וshRNA. אמנם ט בתאי cDNAs מבטא יהיה בקלות לייצר כמויות לגילוי של חלבונים בתוך 24 שעות, הדלדול של גורמים אנדוגניים על ידי מציאת shRNA בתיווך יכול לקחת עוד זמן רב. באופן כללי, אנו ממליצים לבדוק שיבוטים מבטאים shRNAs רק 96 שעות לאחר בנוסף טטרציקלין, שיוביל לירידה ברמות של הגן של עניין שלך, גם אם מחצית החיים של היעד שלך הם 24 שעות. הדוגמא מוצגת באיור 5 מייצגת תוצאה "אידיאלית" הקרנה לדלדול shRNA בתיווך, ושינויים בפרוטוקול הבדיקה ייתכן שיהיו צורך להגדיר את התנאים האופטימלית דפיקה. אחרון, אך לא פחות חשוב, ברצוננו להדגיש את העובדה כי כלי מיון מבוסס היטב (בדיקות qRT-PCR, נוגדנים) יהיה להקל על זיהוי של שיבוטי תאים הרצויים מאוד. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
אנו מודים לכל החברים במעבדה שלנו לדיונים מועילים. אנו מודים ג'ואנה Lisztwan וכריסטינה Gewinner לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק BBSRC BB/I021248/1 וקרן Wellcome מענק 090090/Z/09/ZAH היא עמית קרן Wellcome מחקר פיתוח קריירה בUCL מכון הסרטן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
- Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
- van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
- Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
- Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
- Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
- Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
- Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
