Summary
Быстрый и простой способ создания клеточных линий человека с индуцибельной и обратимым кДНК гиперэкспрессией или ShRNA-опосредованной нокдаун гена интереса. Этот метод позволяет исследователям надежно и высоко воспроизводимо управлять клеточными линиями, которые трудно изменить переходным методов трансфекции или обычные нокдаун / нокаут стратегии.
Protocol
1. Клонирование pcDNA6_TetR_IRES_blast
- Как показано на рисунке 3, выполнить частичную дайджест pcDNA6/TR плазмиды (V1025-20, Invitrogen) рестриктазами Xba я и сержантского я, чтобы удалить ген TetR и промоутером сопротивление бластицидин (BlastR) гена. Изолировать 4,6 Кб фрагмент вектора.
- Чтобы удалить последовательность полиаденилирования от гена TetR, ввести с помощью ПЦР Xho я сайте сразу же после стоп-кодона из TetR кДНК при сохранении сайте Xba я на 5'-кДНК. Субклона полученный фрагмент в pMigR1 17 с использованием ферментов рестрикции Xba я и Xho I для создания pMigR1_TetR плазмиды.
- Дайджест pMigR1_TetR вектор с рестриктаз Xba я и сержантского я, чтобы освободить TetR_IRES фрагмент. Изолировать 1,25 кб вставки фрагмента.
- Лигируют 4,6 Кб pcDNA6/TR и 1,25 кб TetR_IRES фрагментов. Transform перевязки продуктов в компетентные E.coli и определить желаемую pcDNA6_TetR_IRES_blast конструкция с использованием стандартных методов молекулярной биологии.
2. Генерация клеточных линий, стабильно экспрессирующих TetR
- На 1-й день, Seed 1x10 6 клеток на 10-сантиметровом культуре ткани пластины с помощью стандартной среде роста (например, DMEM с добавлением 10% FCS). Семенной двух пластин, одна для трансфекции pcDNA6_TetR_IRES_blast, а другой в качестве отрицательного контроля для отбора бластицидин. Убедитесь, использовать низкие проход возможен и рекомендуемый средний рост.
- На 2-й день трансфекции одна пластина с 2 мкг pcDNA6_TetR_IRES_blast использованием Fugene 6 (E2691, Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Не трансфекции второй пластины.
- На 3-й день, добавить стандартную питательную среду, содержащую 5 мкг / мл бластицидин для обеих пластин. Обратите внимание, что выбор оптимальной концентрации могут варьироваться для данной линии клеток и могущество пEED должны быть определены заранее.
- На 4-й день, разделили клетки на 1/5, 1/25, 1/50 и 1/100 с помощью 10-см пластины и стандартной питательной среде, содержащей 5 мг / мл бластицидин. Убедитесь в том, чтобы правильно маркировать пластин, содержащих нетрансфецированные или трансфекции клеток. Приготовьте две пластины на разведение шаг.
- Проверьте клетки ежедневно, гарантируя, что все клетки на нетрансфицированных пластин умерли в течение первой недели. Измените выделение средств массовой информации каждые 2-3 дня.
- Через 1-2 недели, бластицидин устойчивых колоний должны начать появляться. Выберите пластины, содержащие от 5 до 50 колоний для обеспечения одной колонии могут быть выбраны.
- Когда колонии достигли диаметром около 5 мм (или больше), выделить по крайней мере 12 независимых клонов использованием клонирования цилиндров, чтобы выбрать одну колонии. Передача каждого клона в отдельную лунку в 24-луночный планшет для культивирования тканей. Когда сливающиеся, разделить клетки из каждой лунки в одну лунку 6-луночный планшет для культивирования тканей.
- Продолжайте культуры CLте, в выборе средств массовой информации. Когда сливающиеся, разбиение ячеек из каждой лунки на две одиночных скважин из 6-луночный планшет для культивирования тканей.
- Для каждого клона должны быть протестированы, заморозить одну скважину вырожденных клеток и урожай клеток в другие хорошо для последующего тестирования с помощью иммуноблоттинга.
- Обнаружение TetR помощью Вестерн-блоттинга с помощью мыши моноклональные анти-TET02 антител (Mobitec GmbH). Не забудьте включить лизат родительской клеточной линии в качестве отрицательного контроля.
- Выберите 3-х клонов с высокой TetR выражения и расширения каждого клональный культуры. Замораживание акций каждой перспективных клонов как можно скорее. Наконец, изучение молекулярных и клеточных биологических параметров, представляющих интерес, сравнивая родительских линий клеток с TetR-экспрессирующих клонов. Выберите "лучший" клон с высокой TetR выражение, которое не выводит никаких изменений в молекулярной и клеточной биологических параметров, представляющих интерес.
3. Пилотное тестирование pTER и PT-Rex DEST30 векторы ЭкспрессING ShRNA или кДНК, Соответственно
- Создание pTER плазмиды со вставками ShRNA, как описано 12. Построить PT-Rex DEST30 вектор (12301-016, Invitrogen), содержащей кДНК интерес использовании шлюза технологий (Invitrogen). В случае кДНК выражения, добавление тегов к кДНК позже облегчения обнаружения экзогенно выразил белка.
- Временно трансфекции родительской линии клеток-мишеней с pTER или PT-Rex DEST30 плазмиды (выражение либо shRNAs или кДНК интерес) с помощью трансфекции реагента выбор. Для тестирования плазмид ShRNA выражения, обеспечить высокую эффективность трансфекции может быть достигнута.
- Урожай трансфицированных клеток и процесс иммуноблоттинга помощью соответствующих антител, ожидая обнаружить истощения или избыточная экспрессия гена ваших интересов.
4. Генерация стабильных клеточных линий с Тетрациклин-индуцируемых (Тет-на) Выражение shRNAs или кДНК Использование pTER или PT-Rex DEST30 векторы
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Например для начальных характеристик ПЭС-1 клеточные линии, стабильно экспрессирующие TetR показано на рисунке 4. Отметим, что все НПП-1 клонов выражать различные уровни TetR (сравните дорожки 2 и 5), в то время как родительская клеточная линия (которая служит в качестве отрицательного контроля) не выражает экзогенных белков TetR (рис. 4, дорожка 1). Это изменение в выражении TetR среди ПЭС-1 Тет-на клеточных клонов, как ожидается, поскольку выражение TetR выражения плазмиды сильно зависит от плазмиды сайта интеграции.
Характеристика стабильного ПЭС-1 Тет-на клеточных клонов выражения shRNAs направлены против киназы MST3 показывает, что некоторые клоны должны быть проверены с целью определения клеточных линиях с наиболее эффективным истощения интерес гена (рис. 5). В случае показано на рисунке (Рисунок 5) клеточных клонов № 1, № 2 и № 3 были выбраны для дальнейшего анализа. Изменение яп истощения эффективности, как ожидается, поскольку выражение выражение ShRNA сильно зависит от плазмиды сайта интеграции.
Рисунок 1. Различия между Tet-офф и Тет-систем выражения показано на рисунке. Тетрациклин (Tet) белок-репрессор (TetR) был изменен, чтобы либо (1) блок инициации транскрипции путем связывания с Тет-оператора (ТО) в промоторной региона при добавлении тетрациклин (называется Тет-выключения системы) или (2) связываются с в отсутствии тетрациклина (называется Тет-на системе).
Рисунок 2. Описание двух последовательных шагов манипуляций, необходимых для создания человеческого Тет-на клеточных линиях с индуцируемой экспрессии ShRNA или кДНК интерес. (например, сыворотка ответ голода, цены пролиферации клеток, или выражение маркерных белков), "лучший" TetR-положительных клона расширена и хранится. Шаг 2: Генерация Тет-на клеточных линиях с ShRNA индуцибельной / кДНК выражение. «Лучших» TetR-позитивные клетки, трансфицированные pTER 12 для выражения ShRNA или с PT-Rex DEST30 (12301-016, Invitrogen) для кДНК выражения, а Blast / зеоцина или Blast/G418 устойчивые клоны будут выбраны, соответственно. Несколько отдельных клеточных клонов собирают, расширен и отбор иммуноблоттинга для Тетрациклин-индуцируемых нокдаун или экспрессии гена интереса. Наконец, клоны интересрасширены, повторное тестирование и хранится.
Рисунок 3. Генерация pcDNA6_TetR_IRES_blast вектор. Вновь созданные pMigR1_TetR плазмиду расщепляли Xba я и сержантского я и выпустил 1.25kb фрагмент, содержащий TetR и IRES (внутренних рибосомы сайте вступления) последовательностей, был клонирован в отображаемых Xba я и сержантского я сайтов pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen). В результате pcDNA_TetR_IRES_blast вектор выражает TetR и ген бластицидин сопротивления (BlastR) с помощью того же промотора CMV, тем самым гарантируя, что все бластицидин резистентные клетки также выразить TetR.
Рисунок 4. Анализ ПЭС-1 клеточных клонов, стабильно трансфицированные pcDNA / TetR_IRES_blast.Родительский ПЭС-1 клеток по сравнению с ППД-1-клеток, стабильно экспрессирующих TetR с помощью иммуноблоттинга с использованием анти-TetR (верхняя панель) и анти-альфа-тубулина антителами (нижняя панель).
Рисунок 5. . Анализ ПЭС-1 TetR-положительных клонов, стабильно трансфицированные pTER_shMST3 Для идентификации клеток с тетрациклином-индуцируемой экспрессии shRNAs таргетинга MST3, клоны, выращенные в отсутствие (-) или наличия (+) тетрациклину (Tet) в течение 72 ч, Перед обработкой для иммуноблоттинга с использованием анти-MST3 (верхняя панель) и анти-альфа-тубулина антителами (нижняя панель).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы считаем, что Тет-систем значительно облегчить анализ функции генов, особенно в клеточных системах, которые трудно манипулировать и / или при манипуляции генов необходима для выживания клеток. Кроме того, способность контролировать экспрессию генов весьма специфический Тет-систем предоставляет возможность для изучения функций генов на разных этапах (например, во время клеточного цикла или четко определенные процессы дифференциации). Метод, представленный здесь, позволит исследователям для создания желаемого стабильного Тет-на клеточных линиях, в течение разумного периода времени (обычно 3-6 месяцев, в значительной степени в зависимости от степени молекулярной и клеточной биологической профилирования, которые необходимы для характеристики TetR-позитивных клеточных линий). Успешное получение и применение Тет-на клеточных линиях, однако, в значительной степени зависит от нескольких факторов.
Во-первых, отбор клеток с достаточно высокой экспрессией TetRтребуется для обеспечения строгой репрессии транскрипции в отсутствие тетрациклин. Не менее важно, начальная характеристика целевой клетки, экспрессирующие TetR должна охватывать все возможные молекулярные и клеточные биологические параметры, которые будут изучены на долгосрочную перспективу. По нашему опыту, хорошо характеризуется TetR-позитивных клеточных линий является очень хорошей отправной точкой для многочисленных исследовательских проектов.
Во-вторых, это необходимо для поддержания концентрации тетрациклина как можно ниже, чтобы предотвратить возможные плейотропных эффектов при тестировании и анализе Тет-на клонов для ShRNA / кДНК выражение. Если это возможно, тетрациклин концентрация не должна превышать 2 мкг / мл (предпочтительно ниже 2 мкг / мл). Кроме того, поскольку тетрациклин имеет период полураспада около 24 часа в тканях клеточных культур среды, эксперименты, которые последние несколько дней должны рассмотреть дополнительные раунды тетрациклин того. Доксициклин, тетрациклин альтернативного синтетического, Также могут быть учтены при цитотоксической уровня тетрациклина вызывают обеспокоенность.
В-третьих, тесты должны применяться по-разному для кДНК и ShRNA выражение. В то время как Тет-на клетки, экспрессирующие кДНК будет легко произвести заметного количества белка в течение 24 часов, истощения эндогенных факторов на ShRNA-обусловленный нокдаун может занять гораздо больше времени. Как правило, мы рекомендуем проверить клоны, экспрессирующие shRNAs только 96 часа после тетрациклина того, что приведет к снижению уровня вашего интерес гена, даже если период полураспада ваша цель 24 часа в сутки. Пример показан на рисунке 5 представляет собой «идеальный» результат обследования для ShRNA-опосредованной истощения, и изменения в протокол тестирования может потребоваться для определения оптимальных условий нокдаун. Последнее, но не менее, мы хотели бы подчеркнуть тот факт, что хорошо организованной инструменты скрининга (QRT-PCR зонды, антитела) будет в значительной степени способствовать выявлению желаемого клеточных клонов. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим всех членов нашей лаборатории за полезные обсуждения. Мы благодарим Джоанна Lisztwan и Кристина Gewinner за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана грантом BBSRC BB/I021248/1 и Wellcome Trust грант 090090/Z/09/ZAH является научным Wellcome Trust развития карьеры научный сотрудник Института Рака UCL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
- Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
- van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
- Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
- Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
- Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
- Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
- Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
