Summary
Een snelle en eenvoudige manier om humane cellijnen met induceerbare en omkeerbare cDNA overexpressie of shRNA-gemedieerde knock-down van het gen van belang genereren. Deze methode kunnen onderzoekers betrouwbaar en zeer reproduceerbaar manipuleren cellijnen die moeilijk te veranderen door transiënte transfectie methoden of conventionele knockdown / knockout strategieën.
Abstract
Een belangrijke benadering op het gebied van zoogdiercel biologie is de manipulatie van de expressie van genen van belang in geselecteerde cellijnen, teneinde te onthullen een of meer van de functie van het gen (s) met behulp van transiënte / stabiele overexpressie of knockdown van het gen van belang. Helaas, voor diverse celbiologische onderzoeken deze aanpak is niet geschikt wanneer manipulaties van genexpressie resultaat in cel groei / proliferatie gebreken of ongewenste celdifferentiatie. Daarom hebben onderzoekers aangepast de tetracycline repressor eiwit (TetR), uit de E. coli tetracycline resistentie operon 1, om zeer efficiënte en strakke regelgeving genereren cDNA expressie in zoogdiercellen 2,3. Kortom, TetR aangepast om ofwel (1) blok initiatie van transcriptie door binding aan het Tet-operator (TO) in de promoter regio na toevoeging van tetracycline (Tet-off genoemd systeem) of (2) binden aan de TO thij afwezigheid van tetracycline (Tet-on genoemd systeem) (figuur 1). Aangezien het ongemak dat het Tet-off systeem de continue aanwezigheid van tetracycline (met een halfwaardetijd van ongeveer 24 uur in weefselkweek celkweekmedium) moeten Tet-on systeem is uitgebreider geoptimaliseerd, zodat de ontwikkeling van zeer strakke en efficiënte vectorsystemen voor cDNA expressie zoals hier gebruikt.
Kort na de instelling van RNA interferentie (RNAi) voor gen knockdown in zoogdiercellen 4, vectoren die korte haarspeld RNA (shRNAs) beschreven die functie, vergelijkbaar met siRNA 5-11. Echter, deze shRNA gemedieerde knockdown benaderingen hebben dezelfde beperking als conventionele knockout strategieën, aangezien stabiel uitputting niet uitvoerbaar is targets gen zijn essentieel voor cellulaire overleving. Om deze beperking te overwinnen, van de Wetering et al. 12. Wijzigde de shRNA expressievector pSUPER 5
Hier beschrijven we een methode om efficiënt genereren stabiele humaan Tet-on cellijnen die betrouwbaar rijden of induceerbare overexpressie of uitputting van het gen van belang. Met deze methode, hebben we met succes gegenereerd Tet-on cellijnen die significant de analyse van de MST / hMOB / NDR cascade vergemakkelijkt centrosoom 13,14 en 15,16 signalering van apoptose. In dit rapport beschrijven we onze vectoren van keuze naast beschrijven twee opeenvolgende stappen van manipulatie die noodzakelijk zijn om efficiënt genereren menselijke Tet-on cellijnen (figuur 2). Bovendien naast waarin een protocol voor het genereren van menselijke Tet-on cellijnen bespreken we kritische aspecten van de technische procedures en karakterisering van Tet-on cellen.
Protocol
1. Klonering van pcDNA6_TetR_IRES_blast
- Zoals geïllustreerd in figuur 3, voert een gedeeltelijk digest van pcDNA6/TR plasmide (V1025-20, Invitrogen) met de restrictie-enzymen Xba I en Nco I bij de TetR gen en de promoter van de blasticidine resistentie (BlastR) gen te verwijderen. Isoleer de 4,6 kb vectorfragment.
- De polyadenyleringssequentie uit het TetR gen te introduceren door PCR een Xhol plaats onmiddellijk na het stopcodon van het cDNA met behoud TetR de Xba I plaats bij het 5'-uiteinde van het cDNA. Subkloon het resulterende fragment in pMigR1 17 met restrictie-enzymen XbaI en XhoI het genereren van de pMigR1_TetR plasmide.
- Digereren van het pMigR1_TetR vector met de restrictie-enzymen Xba I en Nco I bij de TetR_IRES fragment vrij. Isoleer de 1,25 kb insert fragment.
- Ligeren van het 4,6 kb pcDNA6/TR en de 1,25 kb TetR_IRES fragmenten. Transform het ligatieproduct in competente E.coli en identificeert de gewenste pcDNA6_TetR_IRES_blast construct gebruikmaking van standaard moleculaire biologische technieken.
2. Generatie van cellijnen stabiel tot expressie TetR
- Op dag 1, Seed 1x10 6 cellen per 10 cm weefselkweekplaat met een standaard groeimedium (bijvoorbeeld DMEM aangevuld met 10% FCS). Seed twee platen, een voor transfectie met pcDNA6_TetR_IRES_blast en de andere als een negatieve controle voor selectie blasticidine. Zorg ervoor dat u de laagst mogelijke doorgang en de aanbevolen groei medium te gebruiken.
- Op dag 2 transfecteren een plaat met 2 pg pcDNA6_TetR_IRES_blast met Fugene 6 (E2691, Promega) volgens de instructies van de fabrikant. Niet transfecteren de tweede plaat.
- Op dag 3, worden standaard groeimedium bevattende 5 ug / ml blasticidine aan beide platen. Houd er rekening mee dat de optimale selectie concentratie kan variëren voor een bepaalde cellijn en macht need van te voren worden bepaald.
- Op dag 4 worden de cellen gesplitst op 1/5, 1/25, 1/50 en 1/100 met 10-cm platen en standaard groeimedium bevattende 5 mg / ml blasticidine. Zorg ervoor dat u een behoorlijk label platen die getransfecteerde of getransfecteerde cellen. Bereid twee platen per verdunning stap.
- Dagelijkse controle cellen, zodat alle cellen op het getransfecteerde platen stierven binnen de eerste week. Verander selectie media om de 2-3 dagen.
- Na 1-2 weken moet blasticidine-resistente kolonies beginnen te verschijnen. Selecteer platen die 5 tot 50 kolonies opdat enkele kolonies kunnen worden opgehaald.
- Wanneer de kolonies hebben een diameter van ongeveer 5 mm (of groter) bereikt, isoleren ten minste 12 onafhankelijke klonen met klonen cilinders enkele kolonies halen. Breng elke kloon in een aparte putje van een 24-well weefselkweekplaat. Wanneer confluent, splitsen cellen uit elk putje in een enkel putje van een 6-well weefselkweekplaat.
- Doorgaan naar cultuur cldie in de selectie media. Wanneer confluent, split cellen uit elk putje in twee afzonderlijke putjes van een 6-well weefselkweekplaat.
- Voor elke kloon te testen, bevriezen een putje van confluente cellen en oogsten cellen in het andere goed voor het testen door immunoblotting.
- Detecteren TetR door Western blotting met de muis monoklonaal anti-TET02 antilichaam (Mobitec GmbH). Herinneren aan een lysaat van de ouderlijke cellijn als een negatieve controle omvat.
- Selecteer 3 klonen met de hoogste TetR expressie en uit te breiden elk klonale cultuur. Freeze voorraden van elke kloon veelbelovend zo spoedig mogelijk. Tenslotte, bekijk de moleculaire en celbiologische parameters van belang door vergelijking van de oudercel lijnen met de TetR-tot expressie brengende klonen. Selecteer de 'beste' kloon met de hoogste TetR uitdrukking die niet wordt weergegeven eventuele wijzigingen in de moleculaire en cel-biologische parameters van belang.
3. Pilot Testen van Pter en pT-Rex DEST30 Vectoren Expressing shRNA of cDNA's, Respectievelijk
- Genereren Pter plasmide met shRNA inserts beschreven 12. Construct pT-Rex DEST30 vector (12,301-016, Invitrogen) met het cDNA van belang met Gateway-technologie (Invitrogen). Bij cDNA expressie zal toevoeging van een label aan het cDNA later vergemakkelijken detectie van exogeen tot expressie gebrachte eiwit.
- Tijdelijk transfecteren de ouderlijke doelcel lijn met Pter of pT-Rex DEST30 plasmiden (die ofwel shRNAs of cDNA's van belang) met behulp van de transfectie reagens van keuze. Voor het testen van shRNA expressieplasmiden zorgen voor hoge transfectie-efficiëntie kan worden bereikt.
- Oogst cellen en proces getransfecteerd voor immunoblotting met de juiste antilichamen, in de verwachting tot een uitputting of overexpressie van uw gen van belang op te sporen.
4. Genereren van stabiele cellijnen met tetracycline induceerbare (Tet-on) Expressie van shRNAs of cDNA gebruiken Pter of Pt-Rex DEST30 Vectors
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld voor de initiële karakterisering van RPE-1 cellijnen die stabiel TetR is weergegeven in figuur 4. Merk op dat alle klonen RPE-1 expressie verschillende niveaus van TetR (vergelijk lanen 2 en 5), terwijl de ouderlijke cellijn (dat als negatieve controle) drukt niet de exogene TetR eiwit (Figuur 4, baan 1). Deze variatie in TetR uitdrukking onder RPE-1 Tet-on celklonen verwacht, omdat de expressie van de TetR expressie plasmiden is sterk afhankelijk van het plasmide integratieplaats.
De karakterisering van stabiele RPE-1 Tet-on cell klonen die shRNAs tegen de MST3 kinase blijkt dat verschillende klonen getest moeten worden om de cellijnen definiëren met de meest efficiënte afbraak van het gen van belang (figuur 5). In het geïllustreerde geval (figuur 5) celklonen # 1, # 2 en # 3 werden gekozen voor verdere analyse. De variatie in depletie efficiëntie verwacht, aangezien de expressie van shRNA expressie is sterk afhankelijk van het plasmide integratieplaats.
Figuur 1. De verschillen tussen Tet-off en Tet-on expressiesystemen zijn vertegenwoordigd. Het Tetracycline (Tet) repressor eiwit (TetR) is aangepast om ofwel (1) blok initiatie van transcriptie bij binding aan de Tet-operator (TO) in de promoter regio na toevoeging van tetracycline (Tet-off genoemd systeem) of (2) binden aan de TO in afwezigheid van tetracycline (Tet-on genoemd systeem).
Figuur 2. Beschrijving van de twee opeenvolgende stappen van manipulatie noodzakelijk genereren menselijke Tet-on cellijnen met induceerbare expressie van het cDNA of shRNA plaats. (bijvoorbeeld serum honger reactie, celproliferatie tarieven, of de expressie van de markeerdraad eiwitten), wordt de 'beste' TetR-positieve kloon uitgebreid en opgeslagen. Stap 2: Genereren van Tet-on cellijnen met induceerbare shRNA / cDNA expressie. De "beste" TetR-positieve cellen worden getransfecteerd met Pter 12 voor shRNA expressie of pT-Rex DEST30 (12.301-016, Invitrogen) voor cDNA expressie en Blast / of Zeocine Blast/G418 resistente klonen geselecteerd, respectievelijk. Meerdere afzonderlijke celklonen worden geplukt, uitgebreid en gescreend door immunoblotting voor tetracycline induceerbare knockdown of expressie van het gen van belang. Tenslotte klonen plaatsworden uitgebreid, opnieuw getest en opgeslagen.
Figuur 3. Generatie pcDNA6_TetR_IRES_blast vector. PMigR1_TetR De nieuw gegenereerde plasmide werd geknipt met Xba I en Nco I en de vrijgekomen 1.25kb fragment met de TetR en IRES (interne ribosoom ingangsplaats) sequenties gekloneerd in de weergegeven Xba I en Nco I plaatsen van pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen). De resulterende vector pcDNA_TetR_IRES_blast drukt de TetR en Blasticidine resistentiegen (BlastR) met dezelfde CMV promoter, waardoor wordt gewaarborgd dat alle Blasticidine resistente cellen ook express TetR.
Figuur 4. Analyse van RPE-1 cel klonen die stabiel getransfecteerd met pcDNA / TetR_IRES_blast.Ouderlijke RPE-1 cellen vergeleken met RPE-1-cellen die stabiel TetR door immunoblotting met anti-TetR (bovenste paneel) en anti-alfa-tubuline antilichamen (onderste paneel).
Figuur 5. . Analyse van RPE-1 TetR-positieve klonen stabiel getransfecteerd met pTER_shMST3 Om cellen met tetracycline-induceerbare expressie van shRNAs gericht MST3 identificeren, werden klonen gegroeid in de afwezigheid (-) of aanwezigheid (+) van tetracycline (Tet) gedurende 72 uur, voor verwerking voor immuunblotting met anti-MST3 (bovenste paneel) en anti-alfa-tubuline antilichamen (onderste paneel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij geloven dat Tet-on systemen sterk de analyse van genfunctie maken, met name in celsystemen die moeilijk te manipuleren en / of wanneer de gemanipuleerde gen essentieel voor celoverleving. Bovendien de mogelijkheid om genexpressie te controleren door zeer specifieke Tet-on systemen biedt de mogelijkheid om genfuncties studeren verschillende fasen (bijvoorbeeld tijdens de celcyclus of goed gedefinieerde differentiatie). Werkwijze hier gepresenteerde onderzoekers in staat om de gewenste stabiele genereren Tet-on cellijnen binnen een redelijke tijd (gewoonlijk 3-6 maanden, grotendeels afhankelijk van de mate van moleculaire en celbiologische profilering die noodzakelijk is voor de karakterisering van TetR-positieve cellijnen). De succesvolle productie en toepassing van Tet-on cellijnen is echter sterk afhankelijk van verschillende factoren.
Eerste, de selectie van cellen met voldoende hoge expressie van TetRmoet strenge onderdrukking van transcriptie in afwezigheid van tetracycline waarborgen. Even belangrijk, moet de initiële karakterisering van de target cellen die het TetR alle mogelijke moleculaire en celbiologische parameters die worden onderzocht op lange termijn. In onze ervaring, een goed gekarakteriseerde TetR-positieve cellijn is een zeer goed uitgangspunt voor talrijke onderzoeksprojecten.
Anderzijds moet de concentratie tetracycline zo laag mogelijk mogelijke pleiotrope effecten te voorkomen houden bij het testen en analyseren Tet-on klonen voor shRNA / cDNA expressie. Indien mogelijk moet de concentratie tetracycline niet hoger dan 2 pg / ml (bij voorkeur lager dan 2 ug / ml). Aangezien tetracycline een halfwaardetijd van ongeveer 24 uur in weefselkweek celkweekmedium, experimenten laatste dagen moeten overwegen extra ronden van tetracycline toevoeging. Doxycycline, een synthetisch tetracycline alternatiefKan rekening worden gehouden bij cytotoxische niveaus van tetracycline van belang zijn.
Ten derde moeten proeven anders worden toegepast voor cDNA en shRNA expressie. Terwijl Tet-on cellen die cDNA's zal gemakkelijk detecteerbare hoeveelheden eiwitten te produceren binnen 24 uur, kan de uitputting van endogene factoren door shRNA-gemedieerde knockdown veel langer duren. Over het algemeen raden we aan om klonen die shRNAs slechts 96 uur na tetracycline toevoeging, die zal leiden tot verlaagde niveaus van uw gen van belang, zelfs als de halfwaardetijd van uw doelgroep is 24 uur testen. Het voorbeeld van figuur 5 een 'ideaal' screening resultaat shRNA-gemedieerde afbraak en wijzigingen van het testprotocol nodig zijn om de optimale slag definiëren de voorwaarden. Last, but not least, willen we aan het feit dat gevestigde screening tools (qRT-PCR sondes, antilichamen) sterk zal de identificatie van de gewenste cel klonen te vergemakkelijken benadrukken. </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken alle leden van ons laboratorium voor nuttige discussies. Wij danken Joanna Lisztwan en Christina Gewinner voor kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de BBSRC subsidie BB/I021248/1 en de Wellcome Trust subsidie 090090/Z/09/ZAH is een Wellcome Trust Research Career Development fellow aan de UCL Kanker Instituut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
- Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
- van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
- Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
- Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
- Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
- Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
- Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
