Summary
Un moyen simple et rapide pour générer des lignées de cellules humaines avec inductible et réversible surexpression d'ADNc ou shRNA médiée par le knock-down du gène d'intérêt. Cette méthode permet aux chercheurs de lignées cellulaires de manière fiable et reproductible de manipuler très difficiles à modifier, par des méthodes classiques de transfection transitoire ou knock-down / KO stratégies.
Abstract
Une approche majeure dans le domaine de la biologie cellulaire des mammifères est la manipulation de l'expression de gènes d'intérêt dans des lignées cellulaires sélectionnées, dans le but de révéler un ou plusieurs de la fonction du gène (s) en utilisant la surexpression transitoire / stable ou knockdown du gène d'intérêt. Malheureusement, pour diverses enquêtes de cellules biologiques de cette approche ne convient pas lorsque les manipulations de résultat de l'expression de gènes dans des cellules de croissance / prolifération de défauts ou de différenciation cellulaire indésirable. Par conséquent, les chercheurs ont adapté la protéine répresseur tétracycline (TetR), tiré de l'E. résistance à la tétracycline coli opéron 1, de générer très efficaces et serré systèmes réglementaires pour exprimer des ADNc dans des cellules de mammifères 2,3. En bref, TetR a été modifié pour l'initiation ou l'autre bloc (1) de la transcription en se liant à l'opérateur Tet-(A) dans la région du promoteur lors de l'addition de tétracycline (Tet-off appelé système) ou (2) se lient à la TO en til absence de tétracycline (Tet appelée sur-système) (figure 1). Compte tenu de l'inconvénient que le système Tet-off nécessite la présence continue de la tétracycline (qui a une demi-vie d'environ 24 heures dans un milieu de culture des tissus cellulaires) Tet-le système a été plus largement optimisée, ce qui entraîne le développement des très serré et des systèmes de vecteurs efficaces pour l'expression d'ADNc utilisée ici.
Peu de temps après l'établissement de l'interférence ARN (ARNi) pour abattre des gènes dans les cellules de mammifères 4, des vecteurs exprimant des ARN en épingle à cheveux court (shRNA) ont été décrits qui fonctionnent très similaire à siRNA 5-11. Cependant, ces approches knockdown shRNA médiées par la même restriction que les stratégies conventionnelles huitièmes de finale, puisque l'épuisement stable n'est pas possible lorsque les gènes cibles sont essentiels à la survie cellulaire. Pour contourner cette limitation, van de Wetering et al. 12 a modifié le shRNA vecteur d'expression pSUPER 5
Ici, nous décrivons une méthode pour générer efficacement humaine stable Tet-sur lignées cellulaires qui conduisent surexpression inductible de manière fiable l'un ou l'épuisement du gène d'intérêt. En utilisant cette méthode, nous avons réussi à générer Tet-sur des lignées cellulaires a considérablement facilité l'analyse de la cascade de MST / hMOB / NDR de 13,14 centrosome et l'apoptose de signalisation 15,16. Dans ce rapport, nous décrivons nos vecteurs de choix, en plus de décrire les deux étapes consécutives de manipulation qui sont nécessaires pour générer efficacement des humains Tet-sur des lignées cellulaires (figure 2). Par ailleurs, outre décrivant un protocole pour la génération de l'homme Tet-sur des lignées cellulaires, nous allons discuter des aspects critiques concernant les procédures techniques et la caractérisation des cellules Tet-on.
Protocol
1. Clonage de pcDNA6_TetR_IRES_blast
- Comme le montre la figure 3, effectuez un condensé partielle du plasmide pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen) avec les enzymes de restriction Xba I et Nco I pour éliminer le gène TetR et le promoteur de la résistance blasticidine (BlastR) gène. Isoler le fragment de 4,6 kb vecteur.
- Pour supprimer la séquence de polyadénylation du gène TetR, introduit par PCR un site Xho I immédiatement après le codon stop de l'ADNc TetR tout en conservant le site Xba I à l'extrémité 5 'de l'ADNc. Sous-cloner le fragment résultant dans pMigR1 17 en utilisant les enzymes de restriction Xbal et Xhol pour générer le plasmide pMigR1_TetR.
- Digérer le vecteur pMigR1_TetR avec les enzymes de restriction Xba I et le Nco I pour libérer le fragment TetR_IRES. Isoler le fragment de 1,25 kb insert.
- Ligaturer le 4,6 kb pcDNA6/TR et de 1,25 ko fragments TetR_IRES. Transform le produit de ligation dans E.coli compétentes et d'identifier la construction pcDNA6_TetR_IRES_blast souhaité à l'aide des techniques classiques de biologie moléculaire.
2. Génération de lignées cellulaires exprimant de façon stable TetR
- Au jour 1, semences 1x10 6 cellules par 10 cm de plaque de culture tissulaire en utilisant votre milieu de croissance standard (par exemple DMEM supplémenté avec 10% de SVF). Semences deux plaques, une pour la transfection avec pcDNA6_TetR_IRES_blast, et l'autre en tant que témoin négatif pour la sélection blasticidine. Vérifiez que vous utilisez le plus possible le passage et le milieu de croissance recommandé.
- Le jour 2, transfecter une plaque avec 2 ug de pcDNA6_TetR_IRES_blast utilisant Fugene 6 (E2691, Promega) selon les instructions du fabricant. Ne transfecter la seconde plaque.
- Au jour 3, ajouter du milieu de croissance standard contenant 5 pg / ml blasticidine aux deux plaques. S'il vous plaît noter que la concentration sélection optimale peut varier d'une lignée cellulaire donnée et la puissance nEED à être déterminé à l'avance.
- Au jour 4, diviser les cellules à 1/5, 1/25, 1/50 et 1/100 en utilisant des plaques de 10 cm et milieu de croissance standard contenant 5 mg / ml blasticidine. Assurez-vous d'étiqueter correctement les plaques contenant des cellules non transfectées ou transfectées. Préparer deux plaques à l'étape de dilution.
- Vérifiez cellules quotidien, veiller à ce que toutes les cellules sur les plaques non transfectées sont morts pendant la première semaine. Changer milieu de sélection tous les 2-3 jours.
- Après 1-2 semaines, blasticidine colonies résistantes devraient commencer à apparaître. Sélectionner des plaques contenant de 5 à 50 colonies afin de s'assurer que seules les colonies peuvent être récupérés.
- Lorsque les colonies ont atteint un diamètre d'environ 5 mm (ou plus), d'isoler au moins 12 clones indépendants utilisant des cylindres de clonage pour ramasser des colonies isolées. Transférer chaque clone dans un puits séparé d'une plaque de 24 puits de culture de tissu. Lorsque confluentes, diviser les cellules de chaque puits en un seul puits d'une plaque à 6 puits de culture de tissu.
- Continuer à cl cultureceux de milieux de sélection. Lorsque confluentes, les cellules divisées de chaque puits dans deux puits individuels d'une plaque à 6 puits de culture de tissu.
- Pour chaque clone à tester, ainsi geler une des cellules confluentes et les cellules de capture dans le puits pour les autres essais ultérieurs par immuno-empreinte.
- Détecter TetR par Western blot en utilisant l'anticorps monoclonal anti-TET02 anticorps (Mobitec GmbH). Oublier d'inclure un lysat de la lignée cellulaire parentale comme contrôle négatif.
- Sélectionnez 3 clones avec la plus haute expression TetR et développer chaque culture clonale. Geler les stocks de chaque clone prometteur dès que possible. Enfin, examinez les paramètres moléculaires et cellulaires biologiques d'intérêt en comparant les lignées cellulaires parentales avec les clones exprimant TetR. Sélectionnez le "meilleur" clone avec la plus haute expression TetR qui n'affiche pas de changements dans les paramètres moléculaires et cellulaires biologiques d'intérêt.
3. Mise à l'essai de PTER et pT-Rex DEST30 Vecteurs Exprimez-ment shRNA ou des ADNc, respectivement
- Générer pter plasmide avec inserts shRNA comme décrit 12. Construire pT-Rex DEST30 vecteur (12301-016, Invitrogen) contenant l'ADNc d'intérêt en utilisant la technologie de passerelle (Invitrogen). Dans le cas d'expression d'ADNc, plus de un pour l'ADNc sera ultérieurement faciliter la détection de la protéine exprimée de manière exogène.
- Transfecter de manière transitoire la ligne de mire des parents cellule avec PTER ou pT-Rex DEST30 plasmides shRNA (exprimant soit ou ADNc d'intérêt) en utilisant le réactif de transfection de choix. Pour le test de plasmides d'expression shRNA, assurer l'efficacité de transfection élevées peuvent être obtenues.
- Récolte des cellules transfectées et le processus d'immunoblot en utilisant les anticorps appropriés, s'attendant à détecter un épuisement ou la surexpression de votre gène d'intérêt.
4. Génération de lignées cellulaires stables avec inductible par la tétracycline (Tet-on) Expression de shRNA ou d'ADNc à l'aide PTER ou pT-Rex DEST30 Vecteurs
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Representative Results
Un exemple pour la caractérisation initiale de l'EPR-1 lignées cellulaires exprimant de façon stable TetR est illustré à la figure 4. Notez que tous les clones EPR-1 expriment différents niveaux de TetR (comparer les pistes 2 et 5), tandis que la lignée cellulaire parentale (qui sert de témoin négatif) n'exprime pas la protéine exogène TetR (figure 4, ligne 1). Cette variation de l'expression TetR entre RPE-1-Tet sur des clones de cellules est prévu, puisque l'expression de la TetR plasmides exprimant dépend fortement du site d'intégration du plasmide.
La caractérisation de la stabilité EPR-1-Tet sur des clones de cellules exprimant des shRNA dirigés contre la kinase MST3 montre que plusieurs clones doivent être testés afin de définir les lignées cellulaires à l'épuisement la plus efficace du gène d'intérêt (figure 5). Dans le cas illustré clones cellulaires (figure 5) # 1, # 2 et # 3 ont été choisis pour une analyse plus approfondie. La variation de il'efficacité épuisement n est attendue, puisque l'expression de l'expression shRNA est très dépendante sur le site d'intégration du plasmide.
Figure 1. Les différences entre Tet-off et des systèmes d'expression Tet-On sont affichés. La tétracycline (Tet) protéine répresseur (TetR) a été modifié pour l'initiation ou l'autre bloc (1) de la transcription en se liant à l'opérateur Tet-(A) dans le promoteur lors de l'addition région de la tétracycline (Tet-off appelé système) ou (2) se lient à l'A en l'absence de tétracycline (Tet-dite de l'installation).
Figure 2. Description des deux étapes consécutives de manipulation nécessaires pour générer humain Tet-sur des lignées de cellules ayant une expression inductible de la shRNA ou d'ADNc d'intérêt. exemple, la réponse privation de sérum, les taux de prolifération cellulaire, ou l'expression de protéines marqueurs), le «meilleur» TetR-positif clone est développé et stocké. Etape 2: Génération de Tet-sur lignées cellulaires avec des shRNA inductible / expression d'ADNc. Les «meilleurs» TetR-positives cellules sont transfectées avec pter 12 pour l'expression shRNA ou avec pT-Rex DEST30 (12301-016, Invitrogen) pour l'expression d'ADNc, et Blast / zéocine ou Blast/G418 clones résistants sont sélectionnés, respectivement. Plusieurs clones de cellules individuelles sont cueillis, agrandi et projeté par immunoblot de la tétracycline inductible par effet de choc ou de l'expression du gène d'intérêt. Enfin, les clones d'intérêtsont développés, testés et stockés.
Figure 3. Génération du vecteur pcDNA6_TetR_IRES_blast. L'pMigR1_TetR nouvellement généré plasmide a été digéré avec Xba I et Nco I et le fragment libéré 1.25KB contenant le TetR et IRES (site d'entrée interne des ribosomes) des séquences a été cloné dans le affichée Xba I et Nco I des sites de pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen). Le vecteur résultant pcDNA_TetR_IRES_blast exprime la TetR et le gène de résistance à blasticidine (BlastR) en utilisant le même promoteur CMV, garantissant ainsi que toutes les cellules expriment également résistantes blasticidine TetR.
Figure 4. Analyse des RPE-1 clones de cellules transfectées de façon stable avec pcDNA / TetR_IRES_blast.EPR-1 parental cellules ont été comparés aux RPE-1 des cellules exprimant de façon stable TetR par immunoblot en utilisant anti-TetR (panneau supérieur) et anti-alpha-tubuline anticorps (panneau inférieur).
Figure 5. . Analyse des RPE-1 TetR-clones positifs transfectées de façon stable avec pTER_shMST3 Pour identifier les cellules avec inductible par la tétracycline expression de shRNA ciblant MST3, les clones ont été cultivés en l'absence (-) ou en présence (+) de la tétracycline (Tet) pendant 72 heures, avant le traitement pour immunoblot en utilisant des anticorps anti-MST3 (panneau supérieur) et anti-alpha-tubuline (panneau inférieur).
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Discussion
Nous croyons que Tet-sur les systèmes facilitera grandement l'analyse de la fonction des gènes, en particulier dans des systèmes cellulaires qui sont difficiles à manipuler et / ou lorsque le gène manipulé est essentielle à la survie cellulaire. En outre, la capacité de contrôler l'expression des gènes très spécifiques par Tet-sur les systèmes offre la possibilité d'étudier la fonction des gènes à des stades différents (par exemple lors de la progression du cycle cellulaire ou des processus de différenciation bien définies). La méthode présentée ici permettra aux chercheurs de générer la stabilité souhaitée Tet-sur des lignées cellulaires dans un délai raisonnable (normalement 3-6 mois, en grande partie en fonction de l'ampleur du profilage de biologie moléculaire et cellulaire qui est nécessaire pour la caractérisation des TetR-positif lignées cellulaires). La génération et l'application efficaces de la Tet-sur des lignées cellulaires, cependant, est fortement tributaire de plusieurs facteurs.
Tout d'abord, la sélection des cellules avec suffisamment élevée de l'expression TetRdoit veiller à la répression de la transcription rigoureuse en l'absence de tétracycline. Tout aussi important, la caractérisation initiale des cellules cibles exprimant le TetR devrait couvrir tous les possibles moléculaire et cellulaire des paramètres biologiques qui seront étudiées sur le long terme. Dans notre expérience, une lignée cellulaire bien caractérisée TetR-positif est un très bon point de départ pour de nombreux projets de recherche.
Deuxièmement, il est nécessaire de maintenir la concentration de tétracycline aussi bas que possible afin d'éviter d'éventuels effets pléiotropes lors de l'essai et d'analyse sur Tet-clones pour shRNA / expression d'ADNc. Si possible, la concentration la tétracycline ne doit pas être supérieure à 2 ng / ml (de préférence inférieure à 2 ng / ml). En outre, depuis la tétracycline a une demi-vie d'environ 24 heures dans un milieu de culture de tissu cellulaire, des expériences qui durent plusieurs jours devraient tenir compte des cycles supplémentaires de plus tétracycline. La doxycycline, la tétracycline une alternative synthétique, Peuvent également être considérés lorsque les niveaux cytotoxiques de la tétracycline sont préoccupantes.
Troisièmement, les essais doivent être appliquées différemment d'expression d'ADNc, shARN. Bien-Tet sur des cellules exprimant des ADNc pourrez facilement produire des quantités détectables de protéines dans les 24 heures, l'épuisement des facteurs endogènes par shRNA médiation knockdown peut prendre beaucoup plus longtemps. En règle générale, nous recommandons de tester des clones exprimant des shRNA seulement 96 h après l'addition de tétracycline, ce qui conduira à une baisse des niveaux de votre gène d'intérêt, même si la demi-vie de votre cible est de 24 heures. L'exemple de la figure 5 représente un résultat «idéal» pour le dépistage shRNA médiée par l'épuisement, et les modifications au protocole d'essai peut être nécessaire de définir le coup des conditions optimales. Dernier point, mais non le moindre, nous tenons à insister sur le fait que les outils de dépistage bien établis (qRT-PCR sondes, anticorps) va grandement faciliter l'identification de vos clones de cellules souhaitées. </ P>
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier tous les membres de notre laboratoire pour des discussions utiles. Nous remercions Joanna et Christina Lisztwan Gewinner pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le BBSRC BB/I021248/1 subvention et le Wellcome Trust est une subvention 090090/Z/09/ZAH Wellcome Research Trust carrière collègue de développement à l'Institut du cancer UCL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
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