Summary
inducible과 관심의 유전자의 치료 cDNA overexpression 또는 shRNA로 인한 똑 다운과 인간의 세포 라인을 생성하기 위해 신속하고 간단한 방법. 이 방법은 일시적 transfection 방법 또는 기존 최저 / 한방 전략에 의해 변경하기가 어렵 안정적으로 높은 reproducibly 조작 세포 라인에 연구자 수 있습니다.
Abstract
포유류의 세포 생물학 분야의 주요 접근 방식은 공개 할 목적으로, 선택한 셀 라인에 대한 관심의 유전자의 표현의 조작이 하나 이상의 유전자의 과도 / 안정 overexpression 또는 분해를 사용하여 유전자의 기능 (들)의 여러 관심. 불행하게도, 다양한 세포 생물 조사에 대해이 방법은 적합 할 때 세포의 성장 / 확산 결함이나 원치 않는 세포 분화의 유전자 발현 결과의 조작. 따라서, 연구자들은 E.에서 가져온 테트라싸이클린 억제 단백질을 (TetR), 적응 대장균의 테트라 사이클린 내성 오페론 1,2,3 포유류의 세포에 cDNAs을 표현하는 매우 효율적이고 긴밀한 규제 시스템을 생성합니다. 즉, TetR은의 TO에 테트라 사이클린 (Tet - 오프 시스템이라고한다)의 추가시 발기인 지역의 Tet-연산자 (TO)에 바인딩 또는 (2) 바인드에 의해 전사 (1) 블록 개시 하나에 수정되었습니다 티테트라 사이클린의 그 부재 (시스템 Tet 기능이라고한다) (그림 1). Tet - 오프 시스템은 테트라 사이클린의 지속적인 존재를 (이는 조직 세포 배양 매체에 약 24 시간의 반감기가) 필요하다는 불편을 끼쳐 드려 감안할 때 Tet는 -에서 시스템보다 폭이 매우 촉박 개발의 결과, 최적화 된 및 cDNA 표현 효율적인 벡터 시스템은 여기에 사용 된.
바로 짧은 머리 핀의 자형 RNAs (shRNAs)를 표현하는 4 포유류 세포 벡터에서 유전자 최저에 대한 RNA 간섭 (RNAi)의 설립 이후 siRNAs 5-11와 매우 유사한이 기능은 설명했다. 유전자 타겟 세포 생존을 위해 필수적입니다 때 안정적으로 고갈이 적합하지 않을 때문에 그러나, 이러한 shRNA로 인한 최저의 접근 방법은 기존의 한방 전략과 같은 제한이 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 밴 드 Wetering 외. 12 shRNA 표현 벡터 pSUPER에게 수정 5
여기, 우리는 효율적으로 생성하는 방법을 설명 안정된 인간 Tet-inducible에 안정적으로의 overexpression 또는 관심의 유전자의 고갈 중 하나를 운전 세포 라인. 이 방법 사용, 우리는 성공적으로 생성했습니다 Tet-에 크게 중심체 13,14과 15,16 신호를 apoptosis에 산악 표준시 / hMOB / NDR 폭포의 분석을 촉진 세포 라인. 이 보고서에서 우리는 선택의 우리의 벡터를 설명 효율적으로 생성하는 데 필요한 두 개의 연속 조작 단계를 설명뿐만 아니라 인간의 Tet-에 세포 라인 (그림 2). 또한,의 생성을위한 프로토콜을 요약 외에 인간의 Tet-에 세포 라인, 우리는 중요한 기술적 절차에 관한 부분 및 특성화 세포 Tet 기능을 설명합니다.
Protocol
1. pcDNA6_TetR_IRES_blast의 복제
- 그림 3에 도시 된 바와 같이, 제한 효소 Xba I 및 NCO 나는 TetR 유전자와 blasticidin 저항 (BlastR) 유전자의 프로모터를 제거 할 수있는 플라스미드 pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen)의 일부 다이제스트를 수행합니다. 4.6 킬로바이트 벡터 조각을 분리합니다.
- TetR 유전자에서 polyadenylation 순서를 제거하려면 Xho I 사이트는 즉시 TetR의 정지 코돈 cDNA의 5'end의 보존 Xba I 사이트 잠시 후 cDNA PCR에서 소개합니다. pMigR1_TetR이 플라스미드 생성하기 위해 제한 효소 Xba I과 Xho I을 사용하여 pMigR1 17으로 인한 조각을 Subclone.
- TetR_IRES 조각을 출시 할 제한 효소 Xba I 및 NCO I로 pMigR1_TetR 벡터를 소화. 1.25 이하 삽입 조각을 분리합니다.
- 4.6 킬로바이트 pcDNA6/TR와 1.25 킬로바이트 TetR_IRES 조각을 Ligate. TR관할 E.coli에 결합 제품을 ansform 및 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 원하는 pcDNA6_TetR_IRES_blast의 구조를 확인합니다.
2. 세포 라인의 생성 안정적으로 TetR을 표현
- 1 일, 씨 1x10에서 표준 성장 매체를 사용하여 10 cm 조직 배양 접시 당 6 셀 (예 : DMEM 10 % FCS와 보충). 종자 두 개의 플레이트, pcDNA6_TetR_IRES_blast과 transfection 한, 그리고 blasticidin 선택을위한 대조군으로 다른. 가능한 가장 낮은 통로 및 권장 성장 매체를 사용하여 확인하십시오.
- 2 일에서 transfect 제조업체의 지침에 따라 Fugene 6 일 (E2691, Promega)를 사용하여 pcDNA6_TetR_IRES_blast 2 μg과 하나가 판. 두 번째 판을 transfect하지 마십시오.
- 3 일에 두 접시에 5 μg / ML blasticidin를 포함하는 표준 성장 매체를 추가 할 수 있습니다. 최적의 선택 농도가 주어진 셀 라인에 따라 다를 수 있습니다 및 주시기 바랍니다 수도 N사전에 결정해야 eed.
- 일 4 일, 10 cm 접시 5 MG / ML blasticidin를 포함하는 표준 성장 매체를 사용하여 50분의 1과 1 / 100, 25분의 1, 1 / 5 셀을 분할. 제대로 untransfected 또는 transfected 세포를 포함하는 접시에 라벨을해야합니다. 희석 단계마다 두 개의 플레이트를 준비합니다.
- untransfected 접시에있는 모든 세포는 첫 번째 주일 이내에 사망 있도록 매일 셀을 선택합니다. 모든 2-3일 선택 미디어를 변경합니다.
- 1-2주 후, blasticidin 방지 식민지가 표시 될 것입니다. 하나의 식민지가 침투 할 수 있도록 5-50 식민지를 포함하는 접시를 선택합니다.
- 식민지는 약 5mm (또는 더 큰)의 직경에 도달했을 때, 단일 식민지을 선택 복제 실린더를 사용하여 적어도 12 독립적 인 클론을 분리. 24 잘 조직 배양 플레이트 별도의 잘으로 각 복제를 전송합니다. 때 합류, 잘 6 잘 조직 배양 플레이트의 하나에 각도에서 세포를 분리.
- 문화 CL로 이동선택 미디어들. 6 잘 조직 배양 플레이트의 두 단일 우물에 각도에서 때 합류, 분할 세포.
- 각 클론을 테스트하기 위해서는 immunoblotting의 후속 테스트를 위해 다른 잘에 합류 셀 및 수확 세포의 잘 하나를 동결.
- 서양은 마우스 단클론 항 TET02 항체 (MoBiTec GmbH가)를 사용 blotting에 의해 TetR 감지. 대조군으로 부모 세포 라인의 lysate를 포함해야합니다.
- 가장 높은 TetR 식으로 3 클론을 선택하고 각 clonal 문화를 확장합니다. 가능한 한 빨리 각 유망 클론의 주식을 멈춰 봐. 마지막으로, TetR - 표현 클론과 함께 부모 세포 라인을 비교하여 관심의 분자 및 세포 생물학적 매개 변수를 검사합니다. 관심의 분자 및 세포 생물학적 매개 변수에 변경을 표시하지 않습니다 가장 높은 TetR 표현으로 '최고'클론을 선택합니다.
3. pTER와 PT-렉스 DEST30 벡터의 파일럿 테스트 표현각각 ING shRNA 또는 cDNAs,
- 12에 설명 된대로 shRNA 삽입과 플라스미드 pTER를 생성 할 수 있습니다. PT-렉스 DEST30 벡터 (12301-016, Invitrogen) 게이트웨이 기술 (Invitrogen)를 사용하여 관심있는 cDNA를 포함하는를 구성합니다. cDNA 표현의 경우, cDNA에 태그 추가 나중에 exogenously 표현 단백질의 검출을 용이하게합니다.
- Transiently 선택의 transfection 시약을 사용하여 pTER 또는 PT-렉스 DEST30 plasmids (shRNAs 또는 관심 cDNAs 중 하나를 표현)와 부모 대상 셀 라인을 transfect. shRNA 표현 plasmids의 테스트를 위해 높은 transfection 효율을 달성 할 수 있는지 확인합니다.
- 수확 관심의 유전자의 고갈이나 overexpression을 감지하는 기대, 해당 항체를 사용하여 immunoblotting을위한 세포와 과정을 transfected.
4. 테트라싸이클린-inducible (Tet-에서) pTER 또는 PT-렉스 DEST30 벡터를 사용하여 shRNAs 또는 cDNAs의 표현과 안정적인 세포 라인의 생성
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Representative Results
안정적 TetR을 표현 RPE-1 세포 라인의 초기 특성에 대한 예는 그림 4에 표시됩니다. 부모 셀 라인 (대조군 역할을 함) 외인성 TetR 단백질을 표현하지 않는 동안 모든 RPE-1 클론은 (그림 4 차선 1), (레인 2, 5 비교) TetR의 수준을 다양한 표현합니다. RPE-1 중 TetR 식의이 유사 Tet이 기능 세포 클론 예상되며, plasmids을 표현 TetR의 표현부터 플라스미드 통합 사이트에 크게 의존합니다.
의 안정적인 RPE-1 Tet-에 세포 클론 MST3의 키나제에 대한 지시 표현 shRNAs 여러 클론 관심의 유전자 (그림 5)의 가장 효율적인 고갈과 세포 라인을 정의하기 위해 테스트해야하는 보여줍니다. 특성 도시 된 경우 (그림 5) 세포 클론 # 1, # 2, # 3은 추가적인 분석을 위해 선정되었습니다. 변화 전shRNA 식의 표현이 플라스미드 통합 사이트에 크게 의존하기 때문에 N 고갈 효율이 예상된다.
1 그림. Tet - 오프와 Tet-에 표현 시스템 사이의 차이점이 표시됩니다. 테트라싸이클린 (Tet) 억제 단백질 (TetR)이 발기인에 Tet-연산자 (TO)에 바인딩에 의해 전사 (1) 블록 개시 하나에 수정되었습니다 테트라 사이클린 (칭했다 Tet - 오프 시스템)의 추가에 따라 지역이나 테트라 사이클린 (시스템 Tet 기능이라고한다)의 부재에서 TO까지 (2) 구속.
그림 2. 생성하는 데 필요한 두 개의 연속 조작 단계에 대한 설명 인간 Tet-에 shRNA 관심있는 cDNA의 inducible 표현과 세포 라인. (예 : 혈청 기아 응답, 세포 증식 속도, 또는 마커 단백질의 표현)에 대한 테스트 후, '최고'TetR - 긍정적 인 클론을 확장하고 저장됩니다. 2 단계 :의 생성 Tet-inducible에의 shRNA / cDNA 표정으로 세포 라인. '최고'TetR 양성 세포는 shRNA를 표현 pTER 12 또는 cDNA 표현 PT-렉스 DEST30 (12301-016, Invitrogen)와 transfected되며, 폭발 / Zeocin 또는 Blast/G418 방지 클론이 각각 선택됩니다. 여러 개별 셀 클론은 수령 확장하고 관심있는 유전자의 테트라싸이클린-inducible의 최저 또는 표현식에 대한 immunoblotting에 의해 심사됩니다. 관심 마지막으로, 클론, 확장 다시 테스트 및 저장됩니다.
그림 3. pcDNA6_TetR_IRES_blast 벡터의 세대. 플라스미드 새로 생성 pMigR1_TetR는 Xba I와 NCO I와 소화되었고, TetR 및 IRES가 포함 된 출시 1.25kb 조각은 (내부 ribosome 항목 사이트) 시퀀스가 표시 Xba I와 NCO I 사이트에 복제 된 pcDNA6/TR (V1025-20, Invitrogen). 그 결과 pcDNA_TetR_IRES_blast 벡터함으로써 모든 Blasticidin 방지 세포는 명시 적 TetR 보장 같은 CMV 프로모터를 사용하여 TetR과 Blasticidin 저항 유전자 (BlastR)을 표현하고 있습니다.
4 그림. RPE-1 세포 클론의 분석 안정적으로 pcDNA / TetR_IRES_blast와 transfected.부모 RPE-1 세포가 안정적으로 방지 TetR (맨 위 패널)과 반 - 알파 - tubulin 항체 (아래 패널)를 사용 immunoblotting하여 TetR을 표현 RPE-1 세포에 비해되었다.
그림 5. ., 72 시간에 테트라싸이클린 (Tet) 또는 존재 (+) (-) RPE-1 TetR - 긍정적 인 클론 분석 안정적으로 pTER_shMST3와 transfected MST3을 대상으로 shRNAs의 테트라 사이클린-inducible 표현과 세포를 식별하려면, 클론이없는 상태에서 성장 된 전에 방지 MST3 (맨 위 패널)과 반 - 알파 - tubulin 항체가 (아래 패널)를 사용하여 immunoblotting에 대한 처리.
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Discussion
우리는 Tet-에 시스템이 크게 특히 조작 유전자가 세포 생존에 필수적인 경우 조작 및 / 또는하기가 어렵 전지 시스템에서 유전자 기능의 분석을 용이하게 있다고 생각합니다. 또한, 매우 구체적인 Tet-에 시스템에 의해 유전자 발현을 제어 할 수있는 능력은 다른 단계 (세포주기의 진행이나 잘 정의 된 차별화 프로세스 동안 예를 들어)에 유전자 기능을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다. 여기에 제시된 방법은 연구자 생성 할 수 있습니다 원하는 안정적인 Tet-에 크게 TetR 양성의 특성에 필요한 분자 및 세포 생물학적 프로파일의 범위에 따라 적절한 시간 프레임 (보통 3-6개월, 내 세포 라인 세포 라인). 의 성공적인 발전 및 응용 프로그램 Tet은 -에 세포 라인,하지만, 여러 가지 요인에 매우 의존한다.
첫째, TetR의 충분히 높은 표현과 세포의 선택테트라 사이클린의 부재에서 전사의 엄격한 억압을 보장하기 위해 필요합니다. 마찬가지로 중요한 것은, TetR을 표현 대상 세포의 초기 특성은 장기에 공부하게 될 모든 가능한 분자 및 세포 생물학적 매개 변수를 포함해야합니다. 우리의 경험에서 잘 특징 TetR 양성 세포 라인은 수많은 연구 프로젝트를위한 아주 좋은 출발점이 될 것입니다.
둘째, 테스트 및 shRNA / cDNA 표현 클론 Tet-에 분석 가능한 경우 pleiotropic 효과를 방지하기 위해 가능한 한 낮은 테트라 사이클린 농도를 유지하기 위해 필요합니다. 가능하다면, 테트라 사이클린 농도는 2 μg / ML (2 μg / ML보다 우선적으로 아래)보다 높을 수 없습니다. 또한, 테트라 사이클린은 조직 세포 배양 매체, 지난 몇 일 테트라 사이클린 또한 추가 순찰을 고려해야 실험에서 약 24 시간의 반감기가 때문입니다. Doxycycline, 합성 테트라 사이클린 대안테트라 사이클린의 세포 독성 수준이 우려 할 때도 고려 될 수있다.
셋째, 시험은 cDNA 및 shRNA 표현에 대해 다르게 적용되어야합니다. Tet이 기능 세포 표현 cDNAs 쉽게 24 시간 이내에 단백질의 검출 양을 생산하는 반면, shRNA로 인한 최저의 내생 요인의 고갈이 훨씬 오래 걸릴 수 있습니다. 일반적으로, 우리는 당신의 목표의 반 생활은 24 시간 인 경우에도 관심 유전자의 감소 수준으로 이어질 것 테트라 사이클린 또한, 이후 shRNAs ... 단지 96 시간을 표현 클론을 테스트하는 것이 좋습니다. 그림 5에 표시된 예는 shRNA로 인한 고갈에 대한 '이상적인'심사 결과를 나타내고, 테스트 프로토콜에 대한 수정은 조건 아래 최적의 노크를 정의해야 할 수도 있습니다. 마지막으로,하지만, 우리는 잘 설립 된 검사 도구 (qRT-PCR 프로브, 항체)이 크게 원하는 세포 클론의 식별을 용이하게한다는 사실을 강조하고 싶습니다. </ P>
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 도움이 논의에 대한 우리 연구실의 모든 구성원을 감사드립니다. 우리는 원고의 중요한 읽기 안나 Lisztwan과 크리스티나 Gewinner 감사드립니다. 이 작품은 BBSRC 기금 BB/I021248/1 지원하고 웰컴 트러스트 부여 090090/Z/09/ZAH은 UCL 암 연구소에서 웰컴 트러스트 연구 경력 개발 동료가되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
References
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